Summary
여기, 우리가 격리, 확장, 및 개 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포의 분화 하는 방법을 설명합니다.
Abstract
중간 엽 줄기 세포 (MSCs)에 대 한 관심은 절연, 확장, 및 문화의 그들의 용이성으로 인해 지난 10 년간 증가 했다. 최근에, 연구는 이러한 세포 넓은 차별화 용량을 증명 하고있다. MSCs에서 풍부 하 고 생물학 낭비로 ovariectomy 수술 후 자주 취소 됩니다는 사실 때문 난소 세포 기반 치료를 위한 유망한 후보자를 나타냅니다. 이 문서에서는 격리, 확장에 대 한 절차를 설명 합니다 및 MSCs의 세포 분류의 필요성 없이 개 난소에서 파생 된 기술. 이 프로토콜은 임상 시험에서이 매우 구별할 세포의 광범위 한 적용으로 인해 재생 의학에 대 한 중요 한 도구 나타내고 치료 사용.
Introduction
줄기 세포에 초점 년간 과거, 강력한 재생 의학 치료 발견의 집단 목표에 의해 연료 되었습니다 연구 노력을 실질적으로 증가 했다 출판된 연구의 수입니다. 줄기 세포는 두 개의 기본 정의 마커: 자기 혁신과 차별화. 중간 엽 줄기 세포 정기 조직 회전율에 대 한 책임은 고1배아 줄기 세포 비해 분화의 보다 제한 된 용량을가지고. 최근에, 많은 연구 다양 한 MSCs의 그리고 논의 중인 주제는 배아 및 성체 줄기 세포 간의 차이점 모든2에 존재 하는 여부.
Ovarium 표면 상피는 커밋되지 않은 세포의 층, 상대적으로 덜 분화, 두 상피와 중간 엽 마커3, 유지 하는 다른 종류의 세포에 대 한 응답에서으로 분화 하는 능력을 표현 하는 환경 신호4. 줄기 세포는 난소에서의 정확한 위치는 잘 알려진; 그러나, 그것은 bipotential 창시자 tunica albuginea에서 생식 세포5일으키 제안 되었습니다. 이러한 셀 stromal 기원6 또는에 있는 또는 난소 표면7에 인접 면역학 연구 가설 있다. 이후 중간 엽 줄기 세포 세포 접착8에 중요 한 역할을 재생 하는 수많은 수용 체를 표현, 실험 가설을 급속 한 접착을 가진 세포의 인구를 선택 하면 명확 하 게 세포의 인구를 분리 하는 것을 테스트 하도록 설계 되었습니다. 실제로 엽으로 characterizable. 최근, 우리의 그룹 문화의 첫 번째 3 h 문화 접시의 플라스틱 표면에 접착의 급속 한 접착9전시 세포의 순화 된 인구를 얻기 위하여 그들의 용량에 따라 난소 조직에서 MSCs의 파생을 했다. 여기는 난소 조직 으로부터 간 엽 줄기 세포 분리를 위한 개발된 방법에 설명합니다.
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Protocol
이 실험은 4 개의 잡종 여성 개 개 살 균 프로그램에 선택 수술 후 기증의 난소와 함께 수행 되었다. 이 실험은 UNESP-FCAV (프로토콜 번호 026991/13)의 동물의 사용에 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 실험 준비
- 준비 하거나 메 마른 Dulbecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 칼슘 또는 마그네슘의 500 mL를 구매 합니다.
- 준비는 콜라 나 DPBS의 1 mL에 효소의 40 µ g을 혼합 하 여 솔루션을 재고. 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 필터링 하 고 저장 2 mL aliquots-20 ° c.에
- 항생제의 1%와 10% 태아 혈 청 Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 낮은 혈당에서 배양을 준비 합니다.
- 살 균 자료 수집:가 위, 집게, 조직 배양 플라스 크, 요리, 튜브, 그리고 5 mL와 10 mL 펫.
- 표준 셀 문화 실험실 장비를 사용 하 여: 생물 안전 캐비닛 (BSC), 5% CO2 와 38 ° C 원심 분리기에서 설정 셀 문화 인큐베이터.
- BSC를 청소: 70% 소독 장갑 낀 손으로 EtOH, UV 빛을 사용 하 여.
2. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 분리
- 수술 후, 실험실에서 그들의 도착까지 난소 원뿔 튜브에 얼음에 PBS에 계속.
- PBS의 10 mL로 두 100 mm 페 트리 접시를 채우십시오.
- 튜브에서 난소를 제거 하 고 PBS 가진 첫 번째 페 트리 접시에 그들을 전송. 움직임을 혼합 함께 그들을 씻어.
- 부드럽게 난소를 검색 하 고 다른 접시에 놓습니다. 멸 균 핀셋과가 위, 아주 작은 조각, 약 1 m m 크기에서에 조직을 말하다.
- 난소 조직 35 mm 페 트리 접시에 전송 하 고 콜라의 2 개 mL를 추가. 좀 더 조직을 말하다.
- 3 h는 38 ° C에 인큐베이터에서 배양 접시를 놓고 부드럽게 원형 움직임 마다 20 분 페 트리 접시를 흔들.
- 3 h 후 인큐베이터에서 배양 접시를 제거 합니다.
- 15 mL 튜브에 접시의 내용을 전송 합니다. 확장 미디어의 5 mL를 추가 합니다.
- 부드럽게 원심 분리 전에 튜브 반전. 원심에서 2100 x g 7 분 제거 튜브는 상쾌한 고 확장 미디어의 3 mL와 펠 릿을 resuspend.
- T25 병에 펠 릿을 전송 합니다. 5%와 인큐베이터에 병을 배치 3 h 38 ° C에서 CO2 .
참고: 프로시저의 가장 중요 한 부분은 외피의 3 h 후 미디어를 변경 하는. - 인큐베이터에서 병을 제거 하 고 나머지 조직으로 미디어를 제거 합니다. 병에 신선한 확장 미디어의 3 mL를 추가 합니다.
- 미디어 모든 48 h 변경 하 고 관찰 셀룰러 합류에 대 한 병.
참고: 절차의 주요 단계는 그림 1에서 볼 수 있습니다.
3. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 확장
-
셀 통로
- 셀 합류에 도달, 병에서 미디어를 제거 합니다.
- PBS의 3 mL 병을 씻어. PBS를 제거 합니다.
- 트립 신 고 3 분에 38 ° C에 인큐베이터에서 병 부드럽게 탭 분리를 셀 수 있도록 병의 1.5 mL를 추가 합니다.
참고: 셀 합류 약 5-7 d 초기 도금 후에 도달 한다. - 확장 미디어의 3 mL를 추가 하 고 내용을 원뿔 튜브에 전송.
- 원심에서 2100 x g 7 분 제거 튜브는 상쾌한 고 확장 미디어의 1 mL를 추가 합니다.
- 부드럽게 튜브의 내용을 균질.
- 세 고 인큐베이터에 다시 세포와 함께 튜브를 넣어 셀을 수행 하기 위해 샘플의 10 µ L의 약 수를 가져가 라.
- hemocytometer로 믹스의 장소 10 µ L.
-
셀 계산
- 현미경의 10 X 목표를 사용 하 고는 hemocytometer의 눈금선에 초점.
- 5 개의 작은 사각형 (그림 2)에 있는 셀을 계산 합니다.
- 50, 000 밀리 리터 당 셀의 수를 추정 하 여 계산된 수를 곱하면.
4. 난소에서 중간 엽 줄기 세포의 분화
참고: 차별화 분석 힐 외 에 설치 하는 지침에 따라 수행 했다 9.
- 잘, 3 중, 4 잘 문화 접시를 사용 하 여 당 씨 1.0 x 104 셀.
- 확장 미디어의 1 mL를 추가 합니다.
- 부드럽게 원형 움직임으로 접시를 교 반 하십시오.
- 24 시간 후 문화 미디어를 바람직한 차별화 미디어 바꿉니다.
- 대 한 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 분화, 품 어 30 d 유도 미디어 셀, 미디어 교체와 함께 모든 3 디 특정 차별화 키트가 분석이 실험의 각을 위해 사용 되었다.
- Neurogenic 혈통 차별화 유도 미디어 미디어 교체 매 3 d와 함께 10 일에 대 한 셀을 품 어. 여기에서 사용 하는 미디어 DMEM 낮은 포도 당, 2 mM valproic 산, 1 µ M 날린, 10 µ M 산림, 염화 칼륨 5 m m, 5 µ g/mL 인슐린, 그리고 200 µ M 자 hydroxyanisole 포함 되어 있습니다.
- Endoderm 선구자, 5 d 시 약 제조업체의 지침에 따라 endoderm 미디어에서 품 어.
- 원시 생식 세포 계보 차별화 유도 미디어 미디어 교체 매 3 d와 14 d 셀을 품 어. 여기에서 사용 하는 미디어 포함 된 DMEM, 10 %FBS, 1mm 나트륨 pyruvate, 10 ng/mL LIF, 1mm 불필요 한 아미노산, 2 m L-글루타민 m, 5 µ g/mL 인슐린, 0.1 m m β-mercaptoethanol, 60 µ M putrescine, 20 µ g/mL 올려진다, 10 ng/mL 마우스 표 피 성장 인자, 인간의 1 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자, 40 ng/mL 인 glial 세포 선 파생 된 neurotrophic 요인, 및 15 mg/L 페니실린.
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Representative Results
송곳 니 난소에서 중간 엽 줄기 세포 분리:
난소 MSC 격리 절차는 그림 1에 요약 됩니다. 수술, 조직 닦지, 콜라 소화, 그리고 미디어 변화는 문화의 시작 후 3 h, 후 빠른 플라스틱 접착제 속성 상 상속 MSC 인구는 성공적으로 개 난소 조직 으로부터 격리. 빠르게 수확된 셀 문화 접시의 플라스틱 표면에 준수 하 고 전형적인 MSC와 같은 형태 (그림 3)과 형태학 상으로 균질 단층 문화로 성장 했다.
난소 MSC의 특성 생체 외에서
MSC 특성의 목표는 고립 된 셀 표준 MSC 기준에 부합 되도록입니다. 플라스틱, 엽 표면 마커, 긍정적인 탐지 조 혈 표면 표식 부재 뿐만 아니라 mesodermal 차별 받아야 용량 준수 포함 됩니다.
그림 3에서 같이, 난소에서 파생 된 셀 플라스틱에 부착 되었고 전시 MSCs를 정의 하는 첫 번째 기준은 행 구와 같은 형태학. 또한, 고립 된 세포 CD44, CD90, CD105 개 MSC 표식에 대 한 성적 표현을 했다. 또한, MSC 관련 세포 표면 항 원 CD90와 CD44 초기 통로 FACS 분석 및 immunocytochemistry에 의해 발견 했다. CD45와 CD34, 특정 조 혈 모 세포 표면 항 원, 마커의 부재 또한 동일한 기술을 (그림 4)에 의해 확인 되었다. 이 추가 난소 세포는 MSC 관련 phenotype9표현 포함 확인. 개 MSC 특성화에 대 한이 실험에서 사용 된 항 체에 나열 되는 테이블의 자료.
MSCs의 특성의 다음 단계 mesodermal 혈통으로 차별 하는 그들의 능력의 증거를 달성 하는 것입니다. 문화와 혈통 프로그램별 차별화 프로토콜에서 노출 30 일 후 얼룩이 다른 계보 (그림 5A)에 대 한 헌신을 식별 하기 위해 수행 되었다. Osteogenic 혈통에 대 한 헌신은 폰 Kossa 얼룩, 칼슘 예금 확인을 통해 확인 됐다. Chondrogenic 약속 확인 safranin O proteoglycan 얼룩 그리고 adipogenic 약속 확인 기름 빨간 O 지질 얼룩. 이러한 세포의 differentiability의 조사를 계속, 그들이 ectodermic 혈통으로 차별 받을 수 두 neuroectodermal 줄기 세포 표식에 대 한 immunostaining에 의해 표시 된 대로: β-tubulin 그리고 Nestin, 다음의 노출 10 일 (그림 5C) 신경 혈통 차별화 프로토콜에 난소에서 파생 된 MSCs SOX17 및 CD184, 뿐만 아니라 endodermal 혈통, 특정 세포 형태학에 대 한 성적 증명서는 5 일 (그림 5B)에 대 한 특정 분화 프로토콜에 노출 후 관찰 되었다. 마지막으로, 14 일의 노출의 난소 파생 후 MSCs 세균을 세포 유도 미디어, 10 월 4와 DDX4 확인 되었다 (그림 5D). 함께, 이러한 결과 MSCs 특정 분화 프로토콜9에 노출 되 면 난소 조직에서 파생 된에 대 한 차별화의 강력 하 고 다양 한 용량을 지원 합니다.
그림 1 : 격리 절차의 주요 단계. (1) 수술 후 얼음에 PBS 가진 무 균 튜브에 난소를 전송. (2) 난소, 세척 하기 위하여 그들은 PBS 가진 100 mm 접시에 전송 한다. (3) 작은 조각, 약 1 m m 크기에서에 조직을 말하다. (4) 조직에서 세포를 해방 하기 위하여 35 mm 판 조직의 조각을 전송 하 고 인큐베이터에서 3 h 소화에 콜라를 추가 합니다. (5) 원심 분리에 대 한 원뿔 관에 접시의 내용을 전송 합니다. (6) 접시 T25 병에 펠 릿 및 문화의 첫 번째 3 h 후 3 헤 (7)에 대 한 품 어, 문화 미디어 변경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Hemocytometer. 계산에 5 개의 작은 사각형은 빨간색으로 표시 됩니다.
그림 3 : 세포 형태학. 때 미디어 문화 중간 엽 세포, 섬유 아 세포와 같은 형태를 전시의 균질 인구 결과의 시작 후 3 h 변경 되었습니다. 그와 반대로, 첫 번째 미디어 변경 48 h 후 완료 되 면 섬유 아 세포와 같은 세포 외 다른 세포 유형 관찰할 수 있습니다. 눈금 막대 = 1000 µ m. 이 그림 힐 외 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 난소 MSC의 분자 프로 파일. (A)는 고립 된 세포 전시 3 MSC 마커 (CD90, CD105, CD44) 실시간 PCR에 의해 긍정 되는 고전적인 MSC 마커 프로필. (B) 단백질 분석, CD44 긍정적인 셀, 그리고 그들은 2 개의 조 혈 마커 (CD34 및 CD45)의 표현 부족. 눈금 막대 = 70 µ m. 이 그림 힐 외 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 난소 MSC의. 격리 된 셀 (A) mesodermal 계보를 분화 할 수 있었다 (osteogenic, chondrogenic 그리고 adipogenic; 눈금 막대 = 70 µ m). 또한, 세포 모두 (B) endodermal 선구자로 분화 할 수 있었다 (눈금 막대 = 70 µ m) 및 (C) neurogenic 계보 (눈금 막대 = 50 µ m). 흥미롭게도, 셀 (D) 원시 생식 세포 분화를, 난소 중간 엽 줄기 세포에 대 한 차별화의 넓은 용량을 입증 받았다. 이 그림 힐 외 에서 수정 되었습니다. 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 증거 MSCs ovariectomy 후 생물 학적 폐기물 이라고 여겨진다 개 난소 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다 제공 합니다. 사실은 많은 세포 유형 난소에서 찾을 수 있습니다, 우리 구와 같은 형태와 단층에서 성장 하는 셀을 성공적으로 선택, 플라스틱에 그들의 급속 한 준수에 따라 MSCs를 선택 하는 프로토콜을 제안 했다.
골 수에서 MSCs의 파생의 첫 번째 보고서는 문화11;의 첫 번째 48 h 동안 MSCs의 플라스틱 접착 용량에 따라 그러나,이 방법은 이종 인구 phenotypically 및 분리 기능, 적어도 골12에 대 한 잠재력을가지고 보고 되었습니다. 제안 된 문화 메서드는 또한 플라스틱 접착 용량으로 셀을 선택 하 고 있는 바람직한 셀 정렬의 필요성 없이 많은 세포 유형, 조직에서 중간 엽 세포를 분리. 사실은 세포 접착8에 중요 한 역할을 재생 하는 수많은 수용 체를 표현 하는 중간 엽 줄기 세포, 급속 한 접착을 가진 셀의 인구 선택 했다, 그것은에서 더 균질 인구 귀 착될 것입니다 그 가설 이었다는 첫 번째 통로, 신뢰할 수 있는 MSC 프로필입니다. 대표 결과 짧은 기간 플라스틱 접착 시험 고급 구절에 대 한 대기의 필요성 없이 첫 대목에서 MSCs의 형태학 상으로 균질 인구를 분리 하는 데 사용할 수 있습니다 또는 정렬 셀 증거를 제공 합니다.
이 프로토콜에서 중요 한 단계는 문화의 시작 후 3 h 미디어를 변경 하는. 대표적인 결과 섹션 에서처럼 개 난소에서 얻은 줄기 세포 조건에 3 MSCs의 특성에 대 한 설립: 그들은 섬유와 같은 형태를 전시, MSC 마커의 존재에 대 한 긍정적인 했다 고 했다 osteogenic, adipogenic 및 chondrogenic 혈통으로 계보 같은 엽으로 차별화 하는 수 있습니다. 이 실험에서 고립 세포 endodermal 선구자, ectodermal 계보, 및 원시 생식 세포 계보에도 성공적으로 분화 되었다. 셀 초기 도금 후 약 5-7 일 합류를 도달 한다. 고급 나이 가진 동물에서 세포 수 있습니다 젊은 동물의 그들 보다는 더 느리게 성장 하 고, 그의 적은 셀 플라스틱을 준수 수 있습니다. 이러한 경우에는 미디어에서 FBS의 농도 15%로 늘릴 수 있습니다.
따라서, 더 빠른 준수 용량 셀에 따라 MSCs에 대 한 선택, 유선형, 저렴 하 고 효과적인 절차를 나타냅니다. 치료 관점에서이 세포 감 별 법의 그들의 넓은 범위 때문에 특히 재생 의학에 대 한 유망한 도구 나타내는 강조 하기 위해 가장 중요 하다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 친절 하 게 제공 하는 난소 UNESP FCAV의 개 살 균 프로그램을 인정 합니다. 이 작품은 FAPESP (프로세스 번호 2013/14293-0)와 망 토에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
| Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
| DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
| FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
| CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
| CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
| CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
| CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
| Nestin | Milipore | MAB353 | |
| β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
| DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |
References
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