Summary
Her, beskriver vi en metode for isolasjon, utvidelse og differensiering av mesenchymal stamceller fra hjørnetann ovarian vev.
Abstract
Interessert i stamceller (MSCs) har økt det siste tiåret på grunn av sin brukervennlighet isolasjon, utvidelse og kultur. Studier har nylig vist brede differensiering kapasitet som disse cellene har. Eggstokken representerer en lovende kandidat for cellen-basert behandling grunn av det faktum at den er rik på MSCs, og at det er ofte forkastet etter ovariectomy operasjoner som biologisk avfall. Denne artikkelen beskriver fremgangsmåter for isolering, utvidelse, og differensiering av MSCs avledet fra hjørnetann eggstokken, uten nødvendigheten av celle-sortering teknikker. Denne protokollen representerer et viktig verktøy for regenerativ medisin på grunn av bred anvendelse av disse svært deriverbare cellene i kliniske forsøk og terapeutiske bruker.
Introduction
Antall publiserte studier som fokus på stamceller har økt betydelig de siste ti årene, en forskningsarbeidet som har vært drevet av den kollektive mål å utforske kraftig regenerativ medisin terapier. Stilk celler har to primære definerende markører: self - renovering og differensiering. Stamceller er ansvarlig for vanlig vev omsetning og har en mer begrenset kapasitet av differensiering i forhold til embryonale stamceller1. Nylig mange studier har vist en rekke differensiering av MSCs, og et tema under diskusjon er om forskjellene mellom embryonale og voksen stamceller finnes på alle2.
Ovarium overflate epitel er en uengasjert lag av celler, relativt mindre differensiert, som uttrykker begge markører epitel og mesenchymal3, beholde evnen til å differensiere i ulike typer celler svar Miljøsignaler4. Den nøyaktige plasseringen av stamceller i eggstokken er ikke velkjente; imidlertid har det blitt foreslått at bipotential progenitors i tunica albuginea gi opphav til bakterie celler5. Immunologiske studier har en hypotese om at disse cellene har en stromal opprinnelse6 eller befinner deg i eller proksimale til eggstokkene overflaten7. Siden mesenchymal stamceller express mange reseptorer som spiller en viktig rolle i celle vedheft8, ble et eksperiment utviklet for å teste hypotesen at du velger en populasjon av celler med rask vedheft ville isolere en populasjon av celler klart characterizable som mesenchymal i naturen. Nylig rapportert vår gruppe avledning av MSCs fra eggstokkene vev basert på deres antall vedheft til plast overflaten av kultur parabol på den første 3 h av kultur, for å få en renset populasjon av celler viser rask vedheft9. Her beskriver vi utviklet metoden for mesenchymal stamceller isolert fra eggstokkene vevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette eksperimentet ble utført med eggstokkene av fire kjøter kvinnelige hunder donert etter valgfag kirurgi på et hjørnetann sterilisering program. Dette eksperimentet ble godkjent av den etiske komiteen for bruk av dyr i UNESP-FCAV (protocol nr. 026991/13).
1. eksperimentelle forberedelse
- Forberede eller kjøpe 500 mL steril Dulbecco fosfat-bufret saltvann (DPBS) uten kalsium og magnesium.
- Forberede en collagenase jeg lager løsning ved å blande 40 µg av enzymet i 1 mL av DPBS. Filtrere bruke filtere 0,2 µm sprøyten og lagre 2 mL dele på 20 ° C.
- Forberede kultur media fra Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) lav glukose med 10% fosterets serum og 1% av antibiotika.
- Samle steril materiale: saks og tang, en vev kultur kolbe, retter, rør og 10 mL og 5 mL pipetter.
- Bruk standard celle kultur laboratorieutstyr: en biologiske sikkerhetskabinett kabinett (BSC), en celle kultur inkubator satt på 5% CO2 og 38 ° C og en sentrifuge.
- Rengjør BSC: med hansker hender, steriliseres med 70% EtOH, med UV lys.
2. isolering av Mesenchymal stamceller fra eggstokken
- Etter operasjonen, spesielt eggstokkene PBS på is i en konisk tube, før ankomsten på lab.
- Fylle to 100 mm Petri retter med 10 mL PBS.
- Fjern eggstokkene fra røret og overføre dem til første Petriskål med PBS. Vask dem med blande bevegelser.
- Forsiktig hente eggstokken og legg den i en annen tallerken. Sterilt pinsett og saks, hakke vevet i veldig små biter, ca 1 mm i størrelse.
- Overføre ovarian vevet til 35 mm Petriskål og legge 2 mL collagenase. Hakke vevet litt mer.
- Plasser Petriskål i kuvøse på 38 ° C for 3t og forsiktig risting Petriskål med sirkulære bevegelser hvert 20 min.
- Etter 3 h, fjerne Petriskål settefiskanlegg.
- Overføre innholdet i rett til en 15 mL tube. Legge til 5 mL utvidelse medier.
- Forsiktig Inverter røret før sentrifugering. Sentrifuge røret 2100 x g for 7 min. Fjern nedbryting og resuspend pellets med 3 mL utvidelse medier.
- Overføre pellet til en T25 flaske. Plasser flasken i inkubator med 5% CO2 på 38 ° C 3 h.
Merk: Den viktigste delen av prosedyren er å endre media etter 3 timer med inkubering. - Fjern flasken fra inkubator og fjerne media med gjenværende vevet. Legge til 3 mL frisk utvidelse medier i flasken.
- Endre media hver 48t og observere flasken for mobilnettet samløpet.
Merk: De viktigste trinnene i fremgangsmåten kan observeres i figur 1.
3. utvidelse av Mesenchymal stamceller fra eggstokken
-
Cellen passasje
- Når cellene nå samløpet, fjerne mediet fra flasken.
- Vask flaske med 3 mL PBS. Fjerne PBS.
- Legge til 1,5 mL trypsin og sette flasken i kuvøse på 38 ° C til 3 min. forsiktig trykk flasken å cellene koble.
Merk: Celler skal nå samløpet ca 5 - 7 d etter den første plating. - Legg 3 mL utvidelse medier og overføre innholdet til en konisk rør.
- Sentrifuge røret 2100 x g for 7 min. Fjern nedbryting og tilsett 1 mL av utvidelse medier.
- Forsiktig homogenize innholdet i røret.
- Ta en aliquot av 10 µL av prøve å utføre teller og legge røret med celler tilbake i inkubator.
- Sted 10 µL av blandingen inn i hemocytometer.
-
Teller cellene
- Bruk visningskroppen 10 X mål og fokusere på rutenettlinjene i hemocytometer.
- Tell cellene i fem små kvadrater (figur 2).
- Multiplisere det opptalte antallet av 50.000 å anslå hvor mange celler per milliliter.
4. differensiering av Mesenchymal stamceller fra eggstokken
Merk: Differensiering analyser ble utført i henhold til retningslinjene i bakken et al. 9.
- Frø 1.0 x 104 celler per brønn, tre eksemplarer, med en 4-brønnen rett.
- Legg 1 mL av utvidelse medier.
- Forsiktig agitere parabolen med sirkulære bevegelser.
- Etter 24 timer, kan du erstatte kultur media med ønskelig differensiering media.
- For osteogenic, adipogenic og chondrogenic differensiering, ruge cellene med induksjon media for 30 d, media erstatning hver 3 d. bestemt differensiering kits ble brukt for hver av disse analyser.
- For neurogenic avstamning differensiering, ruge celler for 10 d i induksjon media, media erstatning hver 3 d. Medier som brukes her finnes DMEM lav glukose, 2 mM valproic acid, 1 µM hydrocortisone, 10 µM forskolin, 5 mM kalium klorid, 5 µg/mL insulin og 200 µM butylated hydroxyanisole.
- For endoderm forløpere, ruge for 5 d i endoderm media per reagens produsentens instruksjoner.
- For primordial bakterie celle avstamning differensiering, ruge cellene i induksjon media for 14 d, media erstatning hver 3 d. Medier som brukes her finnes DMEM, 10% FBS, 1 mM natrium pyruvate, 10 ng/mL LIF, 1 mM unødvendige aminosyrer, 2 mM L-glutamin, 5 µg/mL insulin, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 60 µM putrescine, 20 µg/mL transferrin, 10 ng/mL musen epidermal vekstfaktor, 1 ng/mL menneskelige grunnleggende fibroblast vekstfaktor, 40 ng/mL menneskelige glial celle linje-avledet nevrotropisk faktor, og 15 mg/L penicillin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mesenchymal stamceller isolert fra hjørnetann eggstokk:
Ovarian MSC isolasjon prosedyren summeres i figur 1. Etter kirurgi, vev hakking, collagenase fordøyelsen og en media endring 3t etter begynnelsen av kulturen var antatte MSC innbyggere med rask plast-klebende egenskaper med hell isolere fra hjørnetann ovarian vev. Høstet cellene raskt overholdt plast overflaten av kultur parabol og vokste til en morphologically homogen monolayer kultur med typiske MSC-lignende morfologi (Figur 3).
Karakteristikk av eggstokkene MSC In Vitro
Målet med MSC karakteristikk er å sikre at isolert celler overholder MSC standardkriteriene. Disse inkluderer tilslutning til plast, en positiv oppdagelsen av mesenchymal overflate markører, og et fravær av blodkreft overflate markører, samt evnen til å gjennomgå mesodermal differensiering.
Som vist i Figur 3, ovarian-avledet celler var tilhenger plast og utstilt en fibroblast-lignende morfologi, oppfyller den første kriteriet som definerer MSCs. Videre viste isolert cellene uttrykk for transkripsjoner for hjørnetann MSC markører CD44, CD90 og CD105. I tillegg ble MSC-spesifikk celle overflaten antigener CD90 og CD44 oppdaget av tidlig passering FACS analyse og immunocytochemistry. Fravær av markører CD45 og CD34, som er blodkreft-spesifikk celle overflaten antigener, ble også bekreftet av de samme teknikkene (Figur 4). Dette ytterligere bekreftet at eggstokken inneholder celler som uttrykker en MSC-spesifikke fenotypen9. Antistoffer som ble brukt i dette eksperimentet for hjørnetann MSC karakteristikk er oppført i den Tabellen of Materials.
Det neste trinnet i karakterisering av MSCs er å oppnå bevis evne til å skille ut mesodermal linjene. Etter 30 dager og kultur i slektslinje kundespesifikk differensiering protokoller, ble flekker utført for å identifisere en forpliktelse til forskjellige linjene (figur 5A). En forpliktelse til osteogenic linjen ble bekreftet gjennom Von Kossa flekker, som identifiserte kalsium innskudd. Safranin O proteoglycan flekker bekreftet chondrogenic engasjement, og olje Red O lipid flekker bekreftet adipogenic engasjement. Fortsetter etterforskningen av differentiability av disse cellene, kunne de gjennomgå differensiering inn ectodermic linjen, som vist av immunostaining for to neuroectodermal stamcelleforskningen markører: β-tubulin og Nestin, etter eksponering av eggstokk-avledet MSCs til nevronale avstamning differensiering protokollen for 10 dager (figur 5C). Transkripsjoner for SOX17 og CD184, samt celle morphologies gjelder for endodermal slekten, ble observert etter eksponering for bestemte differensiering protokoller i 5 dager (figur 5B). Endelig, etter 14 dager etter eksponering av eggstokkene-avledet MSCs til bakterie celle induksjon media, OCT 4 og DDX4 ble identifisert (figur 5 d). Sammen støtter disse resultatene en robust og mangfoldig kapasitet av differensiering for MSCs avledet fra eggstokkene vev, utsettes for bestemte differensiering protokoller9.
Figur 1 : Hovedtrinnene isolasjon prosedyren. (1) etter operasjonen, overføre eggstokkene til sterilt rør med PBS, på is. (2) for å vaske eggstokkene, skal de overføres til en 100 mm plate med PBS. (3) hakke vevet i små biter, ca 1 mm i størrelse. (4) for å frigjøre cellene fra vevet, overføre biter av vev til 35 mm plater og legge collagenase for en 3t fordøyelsen i inkubator. (5) overføre innholdet på platen til en konisk rør for sentrifugering. (6) plate pellet i en T25 flaske og ruge for 3 h. (7) etter den første 3 h kultur, endrer kultur media. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Hemocytometer. De fem små kvadratene telles er merket i rødt.
Figur 3 : Celle morfologi. Når media ble endret 3t etter begynnelsen av kulturen resulterte det i en homogen befolkning på mesenchymal celler, som viste en fibroblast-lignende morfologi. Tvert imot, når den første media endringen er gjort etter 48t kan andre celletyper foruten fibroblast som cellene observeres. Baren skala = 1000 µm. Dette tallet har blitt endret fra Hill et al. 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Molekylære profil av eggstokkene MSC. (A) den isolerte celler utstilt en klassisk MSC markør profil, er positivt for tre MSC markører av sanntids PCR (CD90, CD105 og CD44). (B) av protein analyse, CD44 var positive i disse cellene, og de manglet uttrykk for to blodkreft markører (CD34 og CD45). Baren skala = 70 µm. Dette tallet har blitt endret fra Hill et al. 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Differensiering av eggstokkene MSC. Isolert cellene var i stand til å skille ut (A) mesodermal linjene (chondrogenic, osteogenic, og adipogenic, baren skala = 70 µm). Videre cellene var i stand til å skille ut begge (B) endodermal prekursorer (baren skala = 70 µm) og (C) neurogenic linjene (baren skala = 50 µm). Interessant, gjennomgikk cellene (D) primordial bakterie celledifferensiering, viser et bredt antall differensiering for eggstokkreft mesenchymal stamceller. Dette tallet har blitt endret fra Hill et al. 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her gir vi bevis for at MSCs kan være isolert fra hjørnetann ovarian vev, som regnes biologisk avfall etter ovariectomy. På grunn av at mange celletyper kan bli funnet i eggstokken, foreslått vi en protokoll for å velge MSCs basert på deres raske tilslutning til plast, som ble valgt celler som vokste i en monolayer med en fibroblast-lignende morfologi.
Første rapport av avledning av MSCs fra benmargen var basert på typer kapasitet av MSCs under den første 48t kultur11; Det har imidlertid blitt rapportert at denne metoden har potensial til å isolere en heterogen befolkning, svært og funksjonelt, minst for benmarg12. Metoden foreslått kultur også merker celler av typer kapasitet og isolerer mesenchymal celler fra en vev som har mange celletyper, uten nødvendigheten av sortering ønskelig cellene. Skyldes det faktum at stamceller express mange reseptorer som spiller en viktig rolle i celle vedheft8, var hypotesen at hvis en populasjon av celler med rask vedheft ble valgt, det vil resultere i en mer homogen befolkning på den første passering, med en pålitelig MSC-profil. Representant resultatene gir bevis for at en kortere varighet typer analysen kan brukes til å isolere morphologically homogen innbyggere MSCs i første passering, uten nødvendigheten av å vente på mer avanserte passasjer eller celle sortering.
Et viktig skritt i denne protokollen er å endre media 3t etter begynnelsen av kulturen. Som vist i representant resultatinndelingen, stamceller hentet fra hjørnetann eggstokkene møtte tre kriterier etablert for karakterisering av MSCs: de viste en fibroblast-lignende morfologi, var positive for tilstedeværelsen av MSC markører og ble stand til å skille ut slik mesenchymal linjene som osteogenic, adipogenic og chondrogenic linjene. Celler isolert i dette eksperimentet var også lykkes differensiert i endodermal prekursorer, ectodermal overleveringslinjer og primordial bakterie celle overleveringslinjer. Cellene skal nå samløpet ca 5-7 dager etter den første plating. Cellene fra dyr med alder kan vokse saktere enn unge dyr, og av disse, færre celler kan overholde plast. I slike tilfeller kan du øke konsentrasjonen av FBS i media til 15%.
Derfor representerer utvalget for MSCs basert på cellene med rask tilslutning kapasitet en billig, strømlinjeformet og effektiv fremgangsmåte. Fra et terapeutisk perspektiv er det viktigste å markere at disse cellene representerer et lovende verktøy for regenerativ medisin, spesielt på grunn av deres rekke differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter hjørnetann sterilisering programmet på UNESP-FCAV for vennlig å gi eggstokkene. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra FAPESP (prosess nr 2013/14293-0) og KAPPER.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
| Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
| DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
| FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
| CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
| CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
| CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
| CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
| Nestin | Milipore | MAB353 | |
| β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
| DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |
References
- Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).
- Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
- Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
- Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).
- Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
- Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145 (2004).
- Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
- Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).
- Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
- Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
- Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).
