Summary
Aqui, descrevemos um método para o isolamento, expansão e diferenciação de células-tronco mesenquimais de tecido ovariano canina.
Abstract
Interesse em células-tronco mesenquimais (MSCs) aumentou na última década devido a sua facilidade de expansão de isolamento e cultura. Recentemente, estudos têm demonstrado a capacidade de diferenciação de largura que estas células possuem. O ovário representa um candidato promissor para terapias baseadas em células, devido ao fato de que é rica em MSCs e que ela frequentemente é descartada após cirurgias de ovariectomia como resíduos biológicos. Este artigo descreve os procedimentos para o isolamento, a expansão, e diferenciação de MSCs derivado do ovário canino, sem a necessidade de ordenação de células técnicas. Este protocolo representa uma importante ferramenta para a medicina regenerativa devido a ampla aplicabilidade destas células altamente diferenciável em ensaios clínicos e terapêuticos, usa.
Introduction
O número de estudos publicados que foco sobre células-tronco tem aumentado substancialmente na última década, um esforço de investigação que tem sido alimentado pelo objetivo coletivo de descobrir terapias da medicina regenerativa poderosa. Células-tronco têm dois marcadores definição primárias: autorenovação e diferenciação. Células-tronco mesenquimais são responsáveis por volume de negócios de tecido normal e têm uma capacidade mais restrita de diferenciação em comparação com células-tronco embrionárias1. Recentemente, muitos estudos têm mostrado uma vasta gama de diferenciação do MSCs, e um tema em discussão é se existem diferenças entre as células-tronco embrionárias e adultas em todos os2.
O epitélio de superfície ovarium é uma camada não confirmada de células, relativamente menos diferenciada, que expressa ambos os marcadores epiteliais e mesenquimais3, mantendo a capacidade de se diferenciarem em diferentes tipos de células em resposta a sinais ambientais4. A localização exata de células-tronco no ovário não é bem conhecida; no entanto, tem sido proposto que bipotential progenitores na túnica albugínea originar células germinativas5. Estudos imunológicos têm a hipótese de que estas células têm uma origem do estroma6 ou estão localizados em ou proximal para a superfície do ovário7. Uma vez que as células-tronco mesenquimais express numerosos receptores que desempenham um papel importante na aderência de célula8, um experimento foi concebido para testar a hipótese de que a seleção de uma população de células com a rápida adesão iria isolar uma população de células claramente characterizable como mesenquimais na natureza. Recentemente, nosso grupo relatou a derivação de MSCs de tecido ovariano com base na sua capacidade de aderência à superfície plástica do prato cultura nas primeiras 3 horas de cultura, a fim de obter uma população purificada de células exibindo rápida adesão9. Aqui, descrevemos o método desenvolvido por isolamento de células-tronco mesenquimais do tecido do ovário.
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Protocol
Esta experiência foi realizada com os ovários de quatro cães femininos rafeiros doados após a cirurgia eletiva em um programa de esterilização canina. Este experimento foi aprovado pelo Comitê de ética no uso de animais da UNESP-FCAV (protocolo n º 026991/13).
1. preparação experimental
- Preparar ou comprar 500 mL de fosfato salino de estéril Dulbecco (DPBS) sem cálcio ou magnésio.
- Preparar uma colagenase armazeno solução através da mistura de 40 µ g da enzima em 1 mL de DPBS. Filtrar usando um filtro de seringa 0,2 µm e armazenar alíquotas de 2 mL a-20 ° C.
- Prepare os meios de cultura a partir médio (DMEM) baixos de glicose do Eagle modificado de Dulbecco com 10% de soro fetal e 1% de antibióticos.
- Coletar o material esterilizado: tesoura e pinça, um frasco de cultura de tecidos, pratos, tubos e pipetas de 10 mL e 5 mL.
- Usar equipamento de laboratório de cultura de célula padrão: uma câmara de segurança biológica (CSB), uma incubadora de cultura celular fixado em 5% de CO2 e 38 ° C e uma centrífuga.
- Limpar o BSC: com as mãos enluvadas, esterilize-a com 70% EtOH, usando luzes UV.
2. isolamento de células-tronco mesenquimais do ovário
- Após a cirurgia, manter os ovários em PBS no gelo em um tubo cônico, até sua chegada ao laboratório.
- Preencha dois pratos de Petri de 100 mm com 10 mL de PBS.
- Remover os ovários de tubo e transferi-los para o primeiro prato de Petri com PBS. Lave-os com os movimentos de mistura.
- Delicadamente, recuperar o ovário e coloque-o no outro prato. Com uma pinça estéril e tesoura, mince o tecido em pedaços muito pequenos, cerca de 1 mm de tamanho.
- Transferir o tecido para um prato de Petri de 35mm e adicionar 2 mL de colagenase. Picar o tecido um pouco mais.
- Coloque o prato de Petri na incubadora a 38 ° C por 3 h e agite suavemente a placa de Petri com movimentos circulares a cada 20 min.
- Após 3h, retire o prato de Petri da incubadora.
- Transfira o conteúdo do prato para um tubo de 15 mL. Adicione 5 mL de mídia de expansão.
- Inverta suavemente o tubo antes da centrifugação. Centrifugar o tubo a 2100 x g durante 7 min. remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 3 mL de mídia de expansão.
- Transferi o sedimento para uma garrafa de T25. Coloque a garrafa na incubadora com 5% CO2 a 38 ° C por 3 h.
Nota: A parte mais importante do procedimento é mudar a mídia após 3 h de incubação. - Retire a garrafa da incubadora e remova a mídia com o tecido restante. Adicione 3 mL de mídia expansão fresco para a garrafa.
- Mudar a cada 48 h mídia e observar a garrafa para celular confluência.
Nota: As principais etapas do processo podem ser observadas na Figura 1.
3. expansão de células-tronco mesenquimais do ovário
-
Passagem de células
- Quando as células chegam a confluência, remova a mídia do frasco.
- Lave o frasco com 3 mL de PBS. Remova a PBS.
- Adicione 1,5 mL de tripsina e colocar a garrafa na incubadora a 38 ° C por 3 min. Bata levemente o frasco para ajudar as células a se separar.
Nota: Células devem alcançar confluência aproximadamente 5 - 7 d após o chapeamento inicial. - Adicionar 3 mL de mídia de expansão e transferir o conteúdo para um tubo cônico.
- Centrifugar o tubo a 2100 x g durante 7 min. remover o sobrenadante e adicionar 1 mL de mídia de expansão.
- Homogeneizar cuidadosamente o conteúdo do tubo.
- Tome uma alíquota de 10 µ l da amostra para realizar a célula contando e colocar o tubo com as células de volta na incubadora.
- Lugar de 10 µ l da mistura para o hemocytometer.
-
Contar as células
- Use o objectivo de X 10 do microscópio e concentrar as linhas de grade do hemocytometer.
- Conte as células em cinco pequenos quadrados (Figura 2).
- Multiplique o número contado por 50.000 para estimar o número de células por mililitro.
4. diferenciação de células-tronco mesenquimais do ovário
Nota: Diferenciação ensaios foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas em Hill et al . 9.
- Semente de 1,0 x 104 células por poço, em triplicado, usando um prato de cultura 4-bem.
- Adicione 1 mL de mídia de expansão.
- Agite suavemente o prato com movimentos circulares.
- Após 24 h, substitua os meios de cultura com os meios de diferenciação desejável.
- Para osteogênica, adipogenic e chondrogenic de diferenciação, incubam as células com os meios de indução para 30 d, com substituição de mídia cada 3 kits de diferenciação específica d. foram utilizados para cada um destes ensaios.
- Para a diferenciação da linhagem neurogênica, Incube as celulas para 10 d na mídia da indução, com a substituição de mídia cada 3 d. A mídia utilizada aqui contidos DMEM baixa glicose, ácido valproico de 2 mM, 1 hidrocortisona µM, 10 µM forskolin, cloreto de potássio de 5 mM, 5 µ g/mL insulina e 200 µM butil hidroxianisolo.
- Para os precursores de endoderme, incube 5D em mídia endoderme conforme as instruções do fabricante reagente.
- Para a diferenciação da linhagem primordial de células germinativas, Incube as celulas na mídia indução para 14 d, com substituição de mídia cada 3 d. A mídia utilizada aqui contidos DMEM, 10% FBS, piruvato de sódio 1 mM, 10 ng/mL LIF, aminoácidos não essenciais de 1 mM, 2 mM L-glutamina, 5 µ g/mL insulina, 0,1 mM β-Mercaptoetanol, 60 putrescina µM, 20 transferrina µ g/mL, 10 ng/mL do mouse fator de crescimento epidérmico, humano de 1 ng/mL fator de crescimento fibroblástico básico, 40 ng/mL humanos gliais celular fator neurotrófico derivado de linha e penicilina de 15 mg/L.
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Representative Results
Isolamento de células-tronco mesenquimais de ovário canino:
O procedimento de isolamento de MSC ovário está resumido na Figura 1. Após a cirurgia, tecido de picagem, digestão de colagenase e uma mudança de mídia 3 h após o início da cultura, uma população de MSC putativa com propriedades de plástico adesivo rápidas foi com êxito isolada de tecido ovariano canino. As células colhidas rapidamente aderiram à superfície plástica do prato cultura e se transformou em uma cultura de monocamada morfologicamente homogêneo com morfologia típica de MSC-como (Figura 3).
Caracterização de ovário MSC In Vitro
O objetivo da caracterização da MSC é zelar para que células isoladas em conformidade com critérios de MSC. Estes incluem aderência ao plástico, uma detecção de marcadores de superfície mesenquimais, positivos e uma ausência de marcadores de superfície hematopoiéticas, bem como a capacidade de submeter-se a diferenciação do mesoderma.
Como mostrado na Figura 3, derivado de ovário células foram expostas e aderente ao plástico uma morfologia semelhantes a fibroblastos, cumprindo o primeiro critério que define o MSCs. Além disso, as células isoladas mostraram a expressão de transcritos para os marcadores MSC caninos CD44, CD90 e CD105. Além disso, os antígenos de superfície específicos MSC célula CD90 e CD44 foram detectados por imunocitoquímica e análise inicial de FACS passagem. A ausência de marcadores de CD45 e CD34, que são antígenos de superfície de células hematopoiéticas específicos, também foi confirmada pelas mesmas técnicas (Figura 4). Isto ainda mais confirmado que o ovário contém células expressando um fenótipo de MSC específicos9. Os anticorpos que foram utilizados neste experimento para caracterização de MSC canina estão listados no Tabela de materiais.
O próximo passo na caracterização do MSCs é alcançar a prova da sua capacidade de se diferenciarem em linhagens mesodérmicas. Após 30 dias de exposição e cultura em protocolos de diferenciação da linhagem-específicos, coloração foi realizada para identificar um compromisso de linhagens diferentes (Figura 5A). Um compromisso de linhagem osteogênica foi confirmado através de Von Kossa, coloração, que identificou os depósitos de cálcio. Safranina O proteoglicano coloração confirmou o compromisso de chondrogenic, e a coloração de lipídios óleo vermelho O confirmou adipogenic compromisso. Continuando a investigação da diferenciabilidade destas células, eles foram capazes de sofrer diferenciação em linhagem dos ectodermic, como mostrado por imunocoloração para dois marcadores de células estaminais neuroectodérmico: β-tubulina e Nestin, após a exposição de derivado de ovário MSCs no protocolo de diferenciação de linhagem neuronal por 10 dias (Figura 5). Transcrições para SOX17 e CD184, bem como morfologias de célula específicas para a linhagem de endodermal, foram observadas após exposição a protocolos específicos de diferenciação por 5 dias (Figura 5B). Finalmente, após 14 dias de exposição do ovário-derivado MSCs para germe célula meios de indução, 4 de outubro e DDX4 foram identificados (Figura 5). Juntos, estes resultados suportam uma robusta e diversificada capacidade de diferenciação para MSCs derivados de tecido ovariano, quando expostos a protocolos de diferenciação específica9.
Figura 1 : Etapas principais do processo de isolamento. (1) após a cirurgia, transferi os ovários para tubos estéreis com PBS, no gelo. (2) a fim de lavar os ovários, eles devem ser transferidos para uma placa de 100mm com PBS. (3) picar o tecido em pedaços pequenos, cerca de 1 mm de tamanho. (4) a fim de libertar as células do tecido, transferir as peças de tecido para placas de 35 mm e adicionar colagenase para uma digestão de 3h na incubadora. (5) transferi o conteúdo da placa para um tubo cônico para centrifugação. (6) placa a pelota em um frasco T25 e incubar durante 3 h. (7) após as primeiras 3 horas de cultura, mudar os meios de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Hemocytometer. As cinco pequenas praças a serem contados são marcadas em vermelho.
Figura 3 : Celular morfologia. Quando a mídia foi alterada 3 h após o início da cultura que resultou em uma população homogênea de células mesenquimais, que exibiu uma morfologia de fibroblasto tipo. Pelo contrário, quando a primeira mudança de mídia é feita após 48 h outros tipos de células além das células dos fibroblastos, como podem ser observados. Barra de escala = 1.000 µm. Esta figura foi modificada de Hill et al . 9. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Perfil molecular de ovário MSC. (A) o isoladas células exibiram um perfil clássico do marcador MSC, sendo positivo para três marcadores MSC por PCR em tempo real (CD90, CD105 e CD44). (B) pela análise de proteína, CD44 foi positivo nessas células, e faltava-lhes a expressão de dois marcadores hematopoiéticas (CD34 e CD45). Barra de escala = 70 µm. Esta figura foi modificada de Hill et al . 9. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Diferenciação de ovário MSC. As células isoladas foram capazes de se diferenciarem em (A) mesodérmicas linhagens (chondrogenic, osteogênica e adipogenic; barra de escala = 70 µm). Além disso, as células foram capazes de se diferenciarem em ambos precursores de endodermal (B) (barra de escala = 70 µm) e (C) linhagens neurogênicos (barra de escala = 50 µm). Curiosamente, as células foram submetidos a diferenciação de primordial de células germinativas (D), demonstrando uma ampla capacidade de diferenciação de células-tronco mesenquimais no ovário. Esta figura foi modificada de Hill et al . 9. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós fornecemos evidências que MSCs podem ser isolados de tecido ovariano canino, que é considerado lixo biológico após ovariectomia. Devido ao fato de que muitos tipos de células podem ser encontrados no ovário, propusemos um protocolo para selecionar MSCs baseadas sua rápida aderência ao plástico, que com sucesso selecionado células que cresceram em uma monocamada com uma morfologia de fibroblasto tipo.
O primeiro relatório da derivação do MSCs da medula óssea baseou-se na capacidade de adesão de plástico os MSCs durante as primeiras 48 horas de cultura11; no entanto, foi relatado que este método tem o potencial para isolar uma população heterogênea, fenotipicamente e funcionalmente, pelo menos para medula óssea12. O método de cultura proposto também seleciona células pela capacidade de adesão de plástico e isola as células mesenquimais de um tecido que tem muitos tipos de células, sem a necessidade de classificar as células desejáveis. Devido ao fato de que as células-tronco mesenquimais express numerosos receptores que desempenham um papel importante na aderência de célula8, foi hipotetisado que se uma população de células com a rápida adesão foram selecionada, resultaria em uma população mais homogênea para o primeira passagem, com um perfil MSC confiável. Os resultados representativos fornecem evidências de que um ensaio de aderência de plástico de duração mais curto pode ser usado para isolar uma população morfologicamente homogênea de MSCs na primeira passagem, sem a necessidade de esperar por passagens mais avançadas ou classificação de células.
Um passo crítico no presente protocolo é mudar a mídia 3 h após o início da cultura. Como mostrado na seção resultados representativos, as células-tronco obtidas a partir de ovários caninos reuniu os três critérios estabelecidos para a caracterização do MSCs: eles exibiram uma morfologia de fibroblasto tipo, foram positivos para a presença de marcadores MSC e foram capaz de se diferenciar em tais linhagens mesenquimais como osteogênicas, linhagens adipogenic e chondrogenic. Células isoladas nesta experiência também com sucesso foram diferenciadas em precursores endodermal, linhagens ectodérmicos e linhagens de células de germinativas primordiais. As células devem alcançar confluência aproximadamente 5-7 dias após o chapeamento inicial. As células de animais com idade avançada podem crescer mais lentamente do que aqueles de animais jovens, e desses, menos células podem aderir ao plástico. Nesses casos, a concentração de FBS na mídia pode ser aumentada para 15%.
Portanto, a seleção para MSCs baseado em células com capacidade de aderência mais rápida representa um procedimento de baixo custo, simplificado e eficaz. Do ponto de vista terapêutico, é muito importante salientar que estas células representam uma ferramenta promissora para a medicina regenerativa, especialmente por causa de sua ampla gama de diferenciação.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o programa de esterilização canina na UNESP-FCAV para gentilmente fornecendo os ovários. Este trabalho foi financiado por doações da FAPESP (processo n º 2013/14293-0) e a CAPES.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
| Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
| DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
| FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
| CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
| CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
| CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
| CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
| Nestin | Milipore | MAB353 | |
| β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
| DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |
References
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