Summary
Häri, beskriver vi en metod för isolering, expansion och differentiering av mesenkymala stamceller från Hundarnas äggstocksvävnad.
Abstract
Intresset mesenkymala stamceller (MSC) har ökat under det senaste decenniet på grund av sin användarvänlighet isolering, expansion och kultur. Studier har nyligen visat brett differentiering kapacitet som dessa celler besitter. Äggstocken representerar en lovande kandidat för cellbaserade terapier på grund av att den är rik på MSCs och som det ofta slängs efter ovariektomi operationer som biologiskt avfall. Denna artikel beskriver förfaranden för isolering, expansion, och differentiering av MSCs härrör från Hundarnas äggstocken, utan nödvändigheten av cell-sortering tekniker. Detta protokoll utgör ett viktigt verktyg för regenerativ medicin på grund av bred tillämpligheten av dessa mycket deriverbar celler i kliniska och terapeutiska använder.
Introduction
Antalet publicerade studier som fokuserar på stamceller har ökat avsevärt under det senaste decenniet, en forskningsinsats som har förstärkts av den kollektiva mål att upptäcka kraftfulla regenerativ medicin terapier. Stamceller har två primära definierande markörer: self - renovering och differentiering. Mesenkymala stamceller ansvarar för regelbunden vävnad omsättning och har en mer begränsad kapacitet av differentiering jämfört med embryonala stamceller1. Nyligen många studier har visat ett brett utbud av differentiering av MSCs, och ett ämne som diskuteras är huruvida det finns skillnader mellan embryonala och vuxna stamceller på alla2.
Ovarium ytan epitelet är en obekräftad lager av celler, relativt mindre differentierade, som uttrycker både epitelial och mesenkymala markörer3, behålla förmåga att differentieras till olika typer av celler som svar på Miljösignaler4. Den exakta placeringen av stamceller i äggstocken är inte känt; Det har dock föreslagits att bipotential stamfäder i tunica albuginea ger upphov till könsceller5. Immunologiska studier har hypotesen att dessa celler har en stromal ursprung6 eller befinner dig i eller proximala till äggstocken yta7. Eftersom mesenkymala stamceller express många receptorer som spelar en viktig roll i cell adhesion8, var ett experiment avsedd att testa hypotesen att välja en population av celler med snabb vidhäftning skulle isolera en population av celler klart characterizable som mesenkymala i naturen. Nyligen rapporterade vår grupp härledningen av MSCs från äggstocksvävnad utifrån deras kapacitet av vidhäftning till plast ytan av kultur skålen i första 3 h kultur, för att erhålla en renad population av celler uppvisar snabb vidhäftning9. Här beskriver vi den utvecklade metoden för mesenkymala stamceller isolering från äggstocksvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta experiment utfördes med äggstockarna av fyra mongrel kvinnliga hundar donerade efter elektiv kirurgi på en hund sterilisering program. Detta experiment godkändes av den etiska kommittén om användning av djur av UNESP-FCAV (protokoll nr 026991/13).
1. experimentell förberedelse
- Laga eller köpa 500 mL steril Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS) utan kalcium eller magnesium.
- Förbereda en kollagenas jag stamlösning genom att blanda 40 µg av enzym i 1 mL av DPBS. Filtrera med hjälp av ett 0,2 µm spruta filter och lagra 2 mL alikvoter vid-20 ° C.
- Förbered kultur från Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) låg glukos med 10% fostrets serum och 1% av antibiotika.
- Samla sterila material: sax och pincett, en vävnadskultur kolv, rätter, rör och 10 mL och 5 mL pipetter.
- Använd standard cell kultur laboratorieutrustning: biologiska säkerhetsdragskåp (BSC), en cell kultur inkubator inställd på 5% CO2 och 38 ° C, och en centrifug.
- Rengöra BSC: med handskar på händerna, sterilisera det med 70% EtOH, använda UV-lampor.
2. isolering av mesenkymala stamceller från äggstocken
- Efter operation, hålla äggstockarna i PBS på is i ett koniskt rör, tills anländer till labbet.
- Fyll två 100 mm petriskålar med 10 mL PBS.
- Ta bort äggstockarna från röret och överföra dem till den första petriskål med PBS. Tvätta dem med blandning rörelser.
- Försiktigt Hämta äggstocken och placera den i en annan skål. Med steril pincett och sax, finhacka vävnaden i mycket små bitar, cirka 1 mm i storlek.
- Överför äggstocksvävnad till en 35 mm petriskål och tillsätt 2 mL av kollagenas. Finhacka vävnaden lite mer.
- Placera petriskål i inkubatorn vid 38 ° C för 3 h och skaka försiktigt petriskål med cirkulära rörelser varje 20 min.
- Efter 3 tim bort petriskål från inkubatorn.
- Över innehållet i skålen till en 15 mL tub. Tillsätt 5 mL av expansion media.
- Vänd försiktigt röret innan centrifugering. Centrifugera röret vid 2100 x g för 7 min. ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten med 3 mL expansion media.
- Överföra pelleten till en T25 flaska. Placera flaskan i inkubatorn med 5% CO2 vid 38 ° C i 3 h.
Obs: Den viktigaste delen av förfarandet är att ändra media efter 3 timmars inkubering. - Ta bort flaskan från inkubatorn och media med den återstående vävnaden. Tillsätt 3 mL färsk expansion media till flaskan.
- Ändra media varje 48 h och observera flaskan för cellulära sammanflödet.
Obs: De viktigaste stegen i förfarandet kan observeras i figur 1.
3. utbyggnad av mesenkymala stamceller från äggstocken
-
Cell passage
- När cellerna når sammanflödet, ta bort medier från flaskan.
- Tvätta flaska med 3 mL PBS. Ta bort PBS.
- Tillsätt 1,5 mL trypsin och sätta flaskan i inkubatorn vid 38 ° C för 3 min. Knacka försiktigt på flaskan för att hjälpa cellerna att lossa.
Obs: Celler bör nå sammanflödet ca 5 - 7 d efter inledande plätering. - Tillsätt 3 mL expansion media och överför innehållet till en konisk slang.
- Centrifugera röret vid 2100 x g för 7 min. ta bort supernatanten och tillsätt 1 mL expansion media.
- Försiktigt homogenisera innehållet i röret.
- Ta en alikvot av 10 µL av provet utföra cell räkna och lägga röret med cellerna tillbaka i inkubatorn.
- Plats 10 µL av blandningen i hemocytometer.
-
Räknar cellerna
- Använda mikroskopets 10 X-objektiv och fokusera på linjerna av hemocytometer.
- Räkna cellerna i fem små fyrkanter (figur 2).
- Multiplicera antalet räknade med 50.000 att uppskatta antalet celler per milliliter.
4. differentiering av mesenkymala stamceller från äggstocken
Obs: Differentiering analyser utfördes enligt riktlinjerna i Hill et al. 9.
- Utsäde 1,0 x 104 celler per brunn, i tre exemplar, med hjälp av en 4-väl kultur maträtt.
- Tillsätt 1 mL expansion media.
- Skaka försiktigt skålen med cirkulära rörelser.
- Efter 24 h, ersätta kultur media med önskvärt differentiering media.
- För osteogent, adipogena och chondrogenic differentiering, inkubera cellerna med induktion media för 30 d, med media replacement användes varje 3 d. specifika differentiering kit för var och en av dessa analyser.
- För neurogen härstamning differentiering, inkubera cellerna för 10 d i induktion media, med media replacement varje 3 d. Media som används här innehöll DMEM låg glukos, 2 mM valproinsyra, 1 µM hydrokortison, 10 µM forskolin, 5 mM kaliumklorid, 5 µg/mL insulin och 200 µM butylhydroxianisol.
- För endoderm prekursorer, inkubera i 5 d i endoderm media enligt reagens tillverkarens instruktioner.
- Primordiala könsceller härstamning differentiering, inkubera cellerna i induktion media för 14 d, med media replacement varje 3 d. Media som används här innehöll DMEM, 10% FBS, 1 mM natrium pyruvat, 10 ng/mL LIF, 1 mM onödiga aminosyror, 2 mM L-glutamin, 5 µg/mL insulin, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 60 µM dimetylsulfat, 20 µg/mL transferrin, 10 ng/mL mus epidermal tillväxtfaktor, 1 ng/mL humant Basic fibroblast tillväxtfaktor, 40 ng/mL mänskliga glial cell linje som härrör neurotrofa faktor, och 15 mg/L penicillin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mesenkymala stamceller isolering från Hundarnas äggstocken:
Förfarandet för isolering av äggstockscancer MSC sammanfattas i figur 1. Efter kirurgi, vävnad malning, kollagenas matsmältning och en media förändring 3 h efter början av kulturen var en förmodad MSC befolkning med snabba plast självhäftande egenskaper framgångsrikt isolerad från Hundarnas äggstocksvävnad. Skördade cellerna snabbt följs plastytan av kultur skålen och växte till en morfologiskt homogen enskiktslager kultur med typiska MSC-liknande morfologi (figur 3).
Karakterisering av äggstockscancer MSC In Vitro
Målet med MSC karakterisering är att säkerställa att isolerade celler överensstämmer med MSC standardkriterier. Dessa inkluderar adherencen till plast, en positiv identifiering av mesenkymala yta markörer, och en avsaknad av hematopoetiska yta markörer, samt kapacitet att genomgå mesodermala differentiering.
I figur 3visas cystor-derived celler var anhängare till plasten och utställda en fibroblast-liknande morfologi, uppfylla det första kriteriet som definierar MSCs. Dessutom visade de isolera cellerna uttrycket av avskrifter på Hundarnas markörer i MSC CD44, CD90 och CD105. Dessutom upptäcktes MSC-specifik cell ytantigener CD90 och CD44 av tidig passage FACS analys och immuncytokemi. Avsaknad av markörerna CD45 och CD34, som är hematopoetiska-specifik cell ytantigener, bekräftades också av samma tekniker (figur 4). Detta bekräftade vidare att äggstocken innehåller celler som uttrycker en MSC-specifik fenotyp9. De antikroppar som användes i detta experiment för hundarnas MSC karakterisering listas i den Tabell för material.
Nästa steg i karakterisering av MSCs är att uppnå bevis på deras förmåga att differentieras till bröstkörtlarna härstamningar. Efter 30 dagar av exponering och kultur i härstamning-specifika differentiering protokoll utfördes färgning för att identifiera ett engagemang för olika härstamningar (figur 5A). Ett åtagande att osteogent släktlinje bekräftades genom Von Kossa färgning, som identifierade kalkavlagringar. Safranin O proteoglykan färgning bekräftade chondrogenic åtagande, och olja röd O lipid färgning bekräftade adipogena engagemang. Fortsätter utredningen av differentierbarhet av dessa celler, de skulle kunna genomgå differentiering in ectodermic härstamning, som framgår av immunfärgning för två neuroektodermala stamceller markörer: β-tubulin och Nestin, efter exponering av äggstock-derived MSCs i neuronala härstamning differentiering protokollet om 10 dagar (figur 5 c). Avskrifter för SOX17 och CD184, liksom cell morfologier specifika för de endodermala härstamning, observerades efter exponering för specifika differentiering protokoll i 5 dagar (figur 5B). Slutligen, efter 14 dagar efter exponering av äggstockscancer-härledda MSCs till germ cell induktion media, okt 4 och DDX4 identifierades (figur 5 d). Dessa resultat stöder tillsammans, en robust och mångsidig kapacitet på differentiering för MSCs härrör från äggstocksvävnad, när de utsätts för viss differentiering protokoll9.
Figur 1 : Main steg av förfarandet isolering. (1) efter operation, överföra äggstockarna till sterila tuber med PBS och på is. (2) för att tvätta äggstockarna, bör de överföras till en 100 mm platta med PBS. (3) färs vävnaden i små bitar, cirka 1 mm i storlek. (4) i syfte att befria cellerna från vävnaden, överför bitar av vävnad till 35 mm plattor och tillsätt kollagenas för en 3 h matsmältningen i inkubatorn. (5) överföra innehållet i plattan till ett koniskt rör för centrifugering. (6) plattan pelleten i en T25 flaska och inkubera i 3 h. (7) efter första 3 h av kultur, ändra kultur media. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Hemocytometer. De fem små fyrkanter ska räknas är markerade i rött.
Figur 3 : Cell morfologi. När media bytte 3 h efter början av den kultur som det resulterade i en homogen population av mesenkymala celler, som uppvisade en fibroblast-morfologi. Tvärtom, när den första media förändringen sker efter 48 h kan andra celltyper förutom fibroblast-liknande cellerna observeras. Skalstapeln = 1000 µm. Denna siffra har ändrats från Hill et al. 9. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Molekylär profil av äggstockscancer MSC. (A) den isolerade celler uppvisade en klassisk MSC markör profil, att vara positiv för tre MSC markörer av realtids-PCR (CD90, CD105 och CD44). (B) av proteinanalys, CD44 var positiv i cellerna, och de saknade uttrycket av två hematopoetiska markörer (CD34 och CD45). Skalstapeln = 70 µm. Denna siffra har ändrats från Hill et al. 9. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Differentiering av äggstockscancer MSC. De isolerade cellerna skulle kunna differentieras till (A) mesodermala härstamningar (chondrogenic, Osteogena, och adipogena; skalstapeln = 70 µm). Dessutom kunde cellerna differentieras till båda (B) endodermal prekursorer (skalstapeln = 70 µm) och (C) neurogen härstamningar (skalstapeln = 50 µm). Intressant, genomgick cellerna (D) primordiala könsceller differentiering, visar en bred kapacitet på differentiering för ovariell Bindvävsstamceller. Denna siffra har ändrats från Hill et al. 9. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri bevisa vi att MSCs kan isoleras från Hundarnas äggstocksvävnad, som anses biologiskt avfall efter ovariektomi. På grund av att många celltyper kan hittas i äggstockarna, föreslog vi ett protokoll Markera MSCs baserat på deras snabba adherence till plast, som framgångsrikt markerade celler som växte i en enskiktslager med en fibroblast-liknande morfologi.
Den första rapporten från härledningen av MSCs från benmärg baserades på MSCs plast vidhäftning kapacitet under de första 48 h i kultur11. Det har dock rapporterats att denna metod har potential att isolera en heterogen befolkning, fenotypiskt och funktionellt, åtminstone för benmärg12. Metoden föreslagna kultur också markerar celler av plast vidhäftning kapacitet och isolerar mesenkymala celler från en vävnad som har många celltyper, utan nödvändigheten av sortering önskvärt cellerna. På grund av att mesenkymala stamceller express många receptorer som spelar en viktig roll i cell adhesion8, det var en hypotes om att om en population av celler med snabb vidhäftning valdes ut, skulle det resultera i en mer homogen population på den första passage, med en pålitlig MSC-profil. De representativa resultat ger bevis för att en kortare varaktighet plast vidhäftning test kan användas för att isolera ett morfologiskt homogen population av MSCs vid första passagen, utan nödvändigheten av att vänta på mer avancerade passager eller cell sortering.
Ett viktigt steg i detta protokoll är att ändra media 3 h efter början av kulturen. I avsnittet representativa resultat visas de stamceller som erhållits från Hundarnas äggstockarna träffade de tre kriterier som fastställts för karakterisering av MSCs: de uppvisade en fibroblast morfologi, var positiva för förekomsten av MSC markörer och var kunna differentieras till sådana mesenkymala härstamningar som osteogent, adipogena och chondrogenic härstamningar. Celler som isolerats i detta experiment var också framgångsrikt differentieras efter primordiala könsceller utvecklingslinjerna, ektodermala härstamningar och endodermal prekursorer. Cellerna bör nå sammanflödet cirka 5-7 dagar efter den inledande pläteringen. Celler från djur med hög ålder kan växa långsammare än hos unga djur, och av dem, färre celler kan följa plast. I dessa fall kan koncentrationen av FBS i media ökas till 15%.
Valet för MSCs baserat på cellerna med snabbare följsamhet kapacitet utgör därför, en billig, strömlinjeformad och effektiv procedur. Ur ett terapeutiskt perspektiv är det mest viktigt att framhålla att dessa celler representerar ett lovande verktyg för regenerativ medicin, särskilt på grund av deras stora sortiment av differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner hund sterilisering programmet vid UNESP-FCAV för vänligt att ge äggstockarna. Detta arbete stöds av bidrag från FAPESP (process nr 2013/14293-0) och uddar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
| Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
| DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
| FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
| CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
| CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
| CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
| CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
| Nestin | Milipore | MAB353 | |
| β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
| DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |
References
- Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).
- Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
- Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
- Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).
- Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
- Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145 (2004).
- Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
- Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).
- Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
- Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
- Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).
