Summary
Ici, on décrit une méthode pour l’isolation, l’expansion et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses du tissu ovarien canin.
Abstract
Intérêt pour les cellules souches mésenchymateuses (CSM) a augmenté ces dix dernières années en raison de leur facilité d’isolement, l’expansion et la culture. Récemment, des études ont démontré la capacité de différenciation large que ces cellules possèdent. L’ovaire représente un candidat prometteur pour les thérapies à base de cellules due au fait que c’est riche en MSCs et qu’elle est fréquemment ignorée après chirurgies ovariectomie comme un déchet biologique. Cet article décrit les procédures pour l’isolement, l’expansion, et différenciation des MSCs dérivée de l’ovaire canine, sans la nécessité du tri des cellules techniques. Ce protocole représente un outil important pour la médecine régénérative en raison de la large applicabilité de ces cellules fortement différentiables dans les essais cliniques et applications thérapeutiques.
Introduction
Le nombre d’études publiées qui mettant l’accent sur les cellules souches a considérablement augmenté ces dix dernières années, un effort de recherche qui a été alimenté par l’objectif commun de découverte des thérapies de médecine régénérative puissant. Les cellules souches ont deux marqueurs définissant primaires : auto - rénovation et la différenciation. Cellules souches mésenchymateuses sont responsables de chiffre d’affaires de tissu ordinaire et ont une capacité plus restreinte de la différenciation par rapport aux cellules souches embryonnaires1. Récemment, plusieurs études ont montré une large gamme de différenciation de MSCs, et un sujet en discussion est de savoir si il existe des différences entre les cellules souches embryonnaires et adultes à tous les2.
L’épithélium de surface ovarium est une couche non validée de cellules, relativement moins différenciée, qui exprime les deux marqueurs épithéliaux et mésenchymateux3, conservant la capacité de se différencier en différents types de cellules en réponse à signaux environnementaux4. L’emplacement exact des cellules souches dans l’ovaire n’est pas connue ; Toutefois, il a été proposé que bipotential progéniteurs dans l’albuginée donnent naissance à des cellules germinales5. Les études immunologiques ont émis l’hypothèse que ces cellules ont une origine stromales6 ou sont situés dans ou proximale à la surface de l’ovaire7. Étant donné que les cellules souches mésenchymateuses exprimant des récepteurs nombreuses qui jouent un rôle important dans la cellule adhérence8, une expérience a été conçue pour tester l’hypothèse selon laquelle la sélection d’une population de cellules avec adhérence rapide isolerait clairement une population de cellules caractérisable comme mésenchymateuses dans la nature. Récemment, notre groupe a signalé la dérivation de MSCs de tissu ovarien basée sur leur capacité d’adhérence à la surface en plastique de la boîte de Petri pendant les 3 premières heures de la culture, afin d’obtenir une population purifiée de cellules présentant une adhérence rapide9. Nous décrivons ici la méthode développée pour l’isolement de cellules souches mésenchymateuses du tissu ovarien.
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Protocol
Cette expérience a été réalisée avec les ovaires de quatre chiennes bâtards donnés après interventions chirurgicales non urgentes à un programme de stérilisation canine. Cette expérience a été approuvée par le Comité d’éthique sur l’utilisation des animaux de UNESP-FCAV (protocole n° 026991/13).
1. préparation expérimentale
- Préparer ou acheter 500 mL tampon phosphate salin de stérile Dulbecco (SPD) sans calcium ou de magnésium.
- Préparer une collagénase j’ai solution mère en mélangeant 40 µg de l’enzyme dans 1 mL de SPD. Filtrer à l’aide d’un filtre de seringue 0,2 µm et stocker des parties aliquotes de 2 mL à-20 ° C.
- Préparer les milieux de culture de moyen (DMEM) faible concentration de glucose de l’aigle modifié de Dulbecco avec sérum de foetus de 10 % et 1 % des antibiotiques.
- Recueillir le matériel stérile : ciseaux et pinces, un flacon de culture tissulaire, plats, tubes et pipettes de 10 mL et 5 mL.
- Utiliser les équipements de laboratoire de culture cellulaire standard : une hotte de sécurité biologique (BSC), un incubateur de culture cellulaire fixé à 5 % de CO2 et 38 ° C et à une centrifugeuse.
- Nettoyer le BSC : avec des mains gantées, stériliser avec 70 % EtOH, à l’aide de lampes UV.
2. isolement des cellules souches mésenchymateuses de l’ovaire
- Après l’opération, garder les ovaires dans du PBS sur la glace dans un tube à fond conique, jusqu'à leur arrivée au laboratoire.
- Remplir deux boîtes de pétri 100 mm avec 10 mL de PBS.
- Retirer les ovaires du tube et de les transférer à la première boîte de pétri avec du PBS. Lavez-les avec mélange de mouvements.
- Doucement récupérer l’ovaire et placez-le dans un autre plat. Avec des ciseaux et des pinces stériles, émincer le tissu en très petits morceaux, environ 1 mm de taille.
- Transfert du tissu ovarien à un 35 mm boîte de Pétri et ajouter 2 mL de collagénase. Émincer le tissu un peu plus.
- Placez la boîte de pétri dans l’incubateur à 38 ° C pendant 3 h et secouez légèrement le plat de pétri avec des mouvements circulaires toutes les 20 min.
- Après 3 h, sortir la boîte de pétri de l’incubateur.
- Transférer le contenu de la capsule dans un tube de 15 mL. Ajouter 5 mL de médias de l’expansion.
- Retourner doucement le tube avant la centrifugation. Centrifuger le tube à 2100 x g pendant 7 min. retirer le surnageant et resuspendre le culot avec 3 mL de médias de l’expansion.
- Transférer le culot dans une bouteille de T25. Placez la bouteille dans l’incubateur avec 5 % CO2 à 38 ° C pendant 3 h.
Remarque : La partie la plus importante de la procédure est de changer les médias après 3 h d’incubation. - Enlever la bouteille de l’incubateur et les médias avec le tissu restant. Ajouter 3 mL de médias expansion fraîche dans la bouteille.
- Modifier les médias toutes les 48 h et observer la bouteille pour confluence cellulaire.
NOTE : Les principales étapes de la procédure peuvent être observées dans la Figure 1.
3. l’expansion des cellules souches mésenchymateuses de l’ovaire
-
Passage de la cellule
- Lorsque les cellules atteignent la confluence, retirez le support de la bouteille.
- Laver la bouteille avec 3 mL de PBS. Retirez le PBS.
- Ajouter 1,5 mL de trypsine et mettre la bouteille dans l’incubateur à 38 ° C pendant 3 min. tapoter doucement le flacon pour aider les cellules à se détacher.
Remarque : Les cellules devraient atteindre confluence environ 5 - 7 d après les ensemencements initiaux. - Ajouter 3 mL des médias de l’expansion et transférer le contenu dans un tube à fond conique.
- Centrifuger le tube à 2100 x g pendant 7 min. retirer le surnageant et ajouter 1 mL de médias de l’expansion.
- Doucement, homogénéiser le contenu du tube.
- Prélever une partie aliquote de 10 µL de l’échantillon pour effectuer la cellule de comptage et de remettre le tube avec les cellules dans l’incubateur.
- Placer 10 µL du mélange dans l’hémocytomètre.
-
Comptage des cellules
- Utiliser l’objectif du microscope 10 X et se concentrer sur les lignes de la grille de l’hémocytomètre.
- Compter les cellules dans cinq petits carrés (Figure 2).
- Multipliez le nombre compté par 50 000 pour estimer le nombre de cellules par millilitre.
4. différenciation des cellules souches mésenchymateuses de l’ovaire
Remarque : La différenciation des analyses ont été effectuées conformément aux lignes directrices établies en Hill et al. 9.
- Semences 1,0 x 104 cellules par puits, en trois exemplaires, à l’aide d’une boîte de Petri de 4 puits.
- Ajouter 1 mL de médias de l’expansion.
- Agiter délicatement le plat avec des mouvements circulaires.
- Après 24h, remplacez les milieux de culture par les médias de différenciation souhaitable.
- Pour ostéogénique, adipocytaire et différenciation chondrogéniques, incuber les cellules avec les médias d’induction pendant 30 jours, avec remplacement de médias chaque 3 kits de différenciation spécifique d. ont été utilisées pour chacun de ces tests.
- Pour la différenciation de la lignée neurogène, incuber les cellules pendant 10 jours dans les médias de l’induction, avec remplacement de médias tous les 3 jours. Les milieux utilisés ici contenaient DMEM faible concentration de glucose, acide valproïque 2 mM, 1 hydrocortisone µM, 10 µM forskoline, chlorure de potassium de 5 mM, 5 µg/mL d’insuline et 200µm butylhydroxyanisol.
- Pour les précurseurs de l’endoderme, incuber pendant 5 jours dans les médias selon les instructions du fabricant réactif endoderme.
- Pour la différenciation de cellules germinales primordiales de lignage, incuber les cellules dans les médias d’induction pendant 14 jours, avec remplacement de médias tous les 3 jours. Les milieux utilisés ici contenant DMEM, 10 % FBS, pyruvate de sodium 1 mM, 10 ng/mL FRV, acides aminés non essentiels de 1 mM, 2 mM de L-glutamine, 5 µg/mL d’insuline, du β-mercaptoéthanol 0,1 mM, 60 putrescine µM, 20 transferrine µg/mL, 10 ng/mL souris facteur épidermique de croissance, 1 ng/mL homme facteur de croissance basique des fibroblastes, 40 ng/mL homme glial cell facteur neurotrophique dérivé et la pénicilline de 15 mg/L.
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Representative Results
Isolement de cellules souches mésenchymateuses par ovaire Canine :
La technique d’isolation MSC ovarienne est résumée dans la Figure 1. Après chirurgie, tissu hacher, digestion de collagénase et un changement de support 3 h après le début de la culture, une population de MSC putative avec propriétés de plastique adhésif rapides a été avec succès isolée de tissu ovarien canin. Les cellules récoltées rapidement adhéré à la surface en plastique de la boîte de Petri et a grandi dans une culture monocouche morphologiquement homogène avec la morphologie typique de MSC-like (Figure 3).
Caractérisation des ovaire MSC In Vitro
Caractérisation de MSC vise à faire en sorte que les cellules isolées sont conformes aux critères standards de MSC. Il s’agit d’adhésion au plastique, une détection positive de marqueurs de surface mésenchymateuses et l’absence de marqueurs de surface hématopoïétiques, ainsi que la capacité de subissent une différenciation mésodermiques.
Comme illustré à la Figure 3, cellules d’origine ovarienne étaient adhérentes au plastique et exposé une morphologie des fibroblastes, remplissant le premier critère qui définit MSCs. En outre, les cellules isolées ont montré l’expression des relevés de notes pour les marqueurs des MSC canines CD44 CD90 et CD105. En outre, les antigènes de surface spécifique MSC cellule CD90 et CD44 ont été détectés par immunocytochimie et premières analyses FACS de passage. L’absence des marqueurs CD45 et CD34, qui sont des antigènes de surface de cellules hématopoïétiques spécifiques, a été également confirmée par les mêmes techniques (Figure 4). Cela a encore confirmé que l’ovaire contienne les cellules exprimant un phénotype de MSC spécifique9. Les anticorps qui ont été utilisés dans cette expérience pour la caractérisation de MSC canine sont répertoriés dans le Table des matières.
La prochaine étape dans la caractérisation de MSCs est d’obtenir la preuve de leur capacité à se différencier en lignées mésodermiques. Après 30 jours d’exposition et de la culture dans les protocoles de différenciation de la lignée spécifique, la coloration a été réalisée afin d’identifier un engagement de lignées différentes (Figure 5 a). Un engagement à la lignée ostéogénique a été confirmé par le biais de Von Kossa coloration, qui a identifié les dépôts de calcium. Safranine O protéoglycane coloration a confirmé l’engagement de chondrogéniques, et Oil Red O lipides coloration a confirmé l’engagement d’adipocytaire. Poursuivant l’enquête de la dérivabilité de ces cellules, ils purent subissent une différenciation dans la lignée ectodermique, tel qu’illustré par immunomarquage pour deux marqueurs de cellules souches neuroectodermique : β-tubuline et Nestin, après une exposition MSCs ovaire dérivé du protocole de la différenciation neuronale lignée pendant 10 jours (Figure 5). Transcriptions pour SOX17 et CD184, ainsi que morphologies cellulaires spécifiques à la lignée endodermique, ont été observées après une exposition à des protocoles spécifiques de différenciation pendant 5 jours (Figure 5 b). Enfin, après 14 jours d’exposition des ovaires dérivés MSCs au germe cellulaire médias induction, 4 OCT et DDX4 ont été identifiés (Figure 5). Ensemble, ces résultats confirment une capacité solide et diversifiée de différenciation pour MSCs dérivées de tissus ovariens, lorsqu’ils sont exposés à la différenciation spécifique protocoles9.
Figure 1 : Étapes principales de la procédure d’isolement. (1) après la chirurgie, transfert les ovaires à tubes stériles avec du PBS, sur la glace. (2) pour laver les ovaires, elles devraient être transférées à une plaque de 100 mm avec du PBS. (3) découper le tissu en petits morceaux, environ 1 mm de taille. (4) afin de libérer les cellules des tissus, transférer les morceaux de tissus aux plaques de 35 mm et ajouter collagénase pour une digestion de 3 h dans l’incubateur. (5) transférer le contenu de la plaque dans un tube conique pour la centrifugation. (6) le culot dans une bouteille de T25 sur plaque et incuber pendant 3 h (7) après les 3 premières heures de la culture, changer les milieux de culture. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Hémocytomètre. Les cinq petits carrés pour être comptés sont marqués en rouge.
Figure 3 : Cellule morphologie. Quand les médias a été changé 3 h après le début de la culture, qu'elle a donné lieu à une population homogène de cellules mésenchymateuses, qui présentaient une morphologie des fibroblastes. Au contraire, lorsque le premier changement de support est fait après 48 h sans compter que les cellules fibroblastes, autres types de cellules peuvent être observés. La barre d’échelle = 1 000 µm. Ce chiffre a été modifié par Hill et al. 9. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Profil moléculaire de l’ovaire MSC. (A) isolées des cellules présentaient un profil classique de marqueur MSC, étant positifs pour trois marqueurs MSC par PCR en temps réel (CD90, CD105 et CD44). (B) par l’analyse des protéines, CD44 était positif dans ces cellules, et ils n’avaient pas l’expression de deux marqueurs hématopoïétiques (CD34 et CD45). La barre d’échelle = 70 µm. Ce chiffre a été modifié par Hill et al. 9. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Différenciation des ovaire MSC. Les cellules isolées pouvaient se différencier en lignées mésodermiques (A) (chondrogéniques, ostéogénique et adipocytaire ; la barre d’échelle = 70 µm). En outre, les cellules étaient capables de se différencier en deux précurseurs endodermiques (B) (la barre d’échelle = 70 µm) et (C) lignées neurogènes (la barre d’échelle = 50 µm). Fait intéressant, les cellules ont subi la différenciation des cellules germinales primordiales (D), démontrant une grande capacité de différenciation pour les cellules souches mésenchymateuses ovariennes. Ce chiffre a été modifié par Hill et al. 9. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ci-après nous fournir la preuve que MSCs peuvent être isolés du tissu ovarien canin, qui est considéré comme un déchet biologique après une ovariectomie. Dû au fait que plusieurs types de cellules se trouvent dans l’ovaire, nous avons proposé un protocole pour sélectionner MSCs basés sur leur adhésion rapide au plastique, qui a sélectionné les cellules qui s’est développée en une monocouche avec une morphologie des fibroblastes.
Le premier rapport de la dérivation de MSCs de moelle osseuse était fondé sur la capacité d’adhérence en plastique des MSCs durant le premières 48 h de culture11; Toutefois, il a été signalé que cette méthode a le potentiel pour isoler une population hétérogène, phénotypiquement et fonctionnellement, au moins pour12de la moelle osseuse. La méthode de culture proposé également sélectionne les cellules en capacité d’adhérence en plastique et isole les cellules mésenchymateuses partir d’un tissu qui a de nombreux types de cellules, sans la nécessité de trier les cellules souhaitables. Dû au fait que les cellules souches mésenchymateuses exprimant des récepteurs nombreuses qui jouent un rôle important dans la cellule adhérence8, il a émis l’hypothèse que si une population de cellules avec adhérence rapide ont été sélectionnée, il se traduirait par une population plus homogène à la premier passage, avec un profil fiable de MSC. Les résultats représentatifs prouvent qu’un test d’adhérence plastique durée plus court peut être utilisé pour isoler une population morphologiquement homogène de MSCs dans le premier passage, sans la nécessité d’attendre que des passages plus avancés ou tri de cellules.
Une étape cruciale dans le présent protocole est de changer les médias 3 h après le début de la culture. Comme indiqué dans la section résultats représentatifs, les cellules souches provenant d’ovaires canins satisfait aux trois critères établis pour la caractérisation de MSCs : ils présentaient une morphologie des fibroblastes, se sont révélés positifs pour la présence de marqueurs MSC et ont été capable de se différencier en ces lignées mésenchymateuses comme ostéogéniques, lignées adipocytaire et chondrogéniques. Cellules isolées dans cette expérience sont différencient également avec succès en précurseurs endodermiques, lignées ectodermiques et des lignées de cellules germinales primordiales. Les cellules devraient atteindre confluence environ 5-7 jours après l’ensemencement initial. Les cellules des animaux présentant un âge avancé peuvent croître plus lentement que ceux des jeunes animaux, et de ceux, moins de cellules peuvent adhérer au plastique. Dans ces cas, la concentration de FBS dans les médias peut être augmentée à 15 %.
Par conséquent, la sélection pour MSCs basé sur les cellules avec une capacité d’adhérence plus rapide représente une procédure peu coûteuse, simplifiée et efficace. D’un point de vue thérapeutique, il est plus important de souligner que ces cellules représentent un outil prometteur pour la médecine régénérative, notamment en raison de leur large gamme de différenciation.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le programme de stérilisation canine à UNESP-FCAV pour aimablement les ovaires. Ce travail a été soutenu par des subventions de la FAPESP (processus no 2013/14293-0) et CAPES.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
| Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
| DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
| FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
| CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
| CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
| CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
| CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
| Nestin | Milipore | MAB353 | |
| β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
| DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |
References
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