Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Afledning og differentiering af Canine æggestokkene mesenkymale stamceller

doi: 10.3791/58163 Published: December 16, 2018

Summary

Heri, beskriver vi en metode til isolering, udvidelse og differentiering af mesenkymale stamceller fra canine æggestokkene væv.

Abstract

Interesse i mesenchymale stamceller (msc) er steget i det sidste årti på grund af deres lethed af isolation, ekspansion og kultur. For nylig, har undersøgelser vist bred differentiering kapacitet, at disse celler besidder. Æggestokken repræsenterer en lovende kandidat til celle-baserede behandlinger skyldes, at det er rig på MSC'er, og at det ofte kasseres efter ovariectomy operationer som biologisk affald. I denne artikel beskrives procedurer for isolation, ekspansion, og differentiering af MSCs afledt af canine æggestokkene, uden nødvendigheden af celle-sortering teknikker. Denne protokol udgør et vigtigt redskab for regenerativ medicin på grund af den brede anvendelighed af disse meget differentiable celler i kliniske forsøg og terapeutiske bruger.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Antallet af offentliggjorte undersøgelser, at fokus på stamceller er steget betydeligt i det sidste årti, en forskningsindsats, der har fået næring af det kollektive mål for at opdage kraftfulde regenerativ medicin behandlinger. Stamceller har to primære definerende markører: self - renovering og differentiering. Mesenkymale stamceller er ansvarlige for regelmæssig væv omsætning og har en mere begrænset kapacitet på differentiering i forhold til embryonale stamceller1. For nylig, mange undersøgelser har vist en bred vifte af differentiering af MSC'er, og et emne under diskussionen er om forskelle mellem embryonale og voksne stamceller findes på alle2.

Ovarium overflade epitel er en uforpligtede lag af celler, relativt mindre differentierede, som udtrykker både epitel og mesenchymale markører3, bevarer evnen til at skelne i forskellige typer af celler som reaktion på miljømæssige signaler4. Den nøjagtige placering af stamceller i æggestokken er ikke kendt; Det er blevet foreslået, at bipotential ophav i tunica albuginea giver anledning til kønsceller5. Immunologiske undersøgelser har den hypotese, at disse celler har en stromale oprindelse6 eller er placeret i eller proksimalt for æggestokken overflade7. Da mesenkymale stamceller express talrige receptorer, der spiller en vigtig rolle i celle vedhæftning8, var et eksperiment designet til at teste hypotesen om, at du vælger en befolkning af celler med hurtige vedhæftning ville isolere en befolkning af celler klart characterizable som mesenchymale i naturen. For nylig, vores gruppe rapporteret afledning af MSCs fra æggestokkene væv baseret på deres kapacitet af adhæsion kultur parabol i de første 3 h af kultur, plastik overflade for at opnå en renset befolkning af cellerne udviser hurtig vedhæftning9. Her beskriver vi udviklede metoden for mesenkymale stamceller isoleret fra æggestokkene væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dette eksperiment blev udført med æggestokkene af fire køter kvindelige hunde doneret efter elektiv kirurgi på en canine sterilisation program. Dette eksperiment blev godkendt af den etiske komité om brugen af dyr af UNESP-FCAV (protokol nr. 026991/13).

1. eksperimentel forberedelse

  1. Forberede eller købe 500 mL sterilt Dulbecco fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) uden calcium eller magnesium.
  2. Forberede en collagenase jeg lagerfører løsning ved at blande 40 µg enzym i 1 mL DPBS. Filtrere ved hjælp af en 0,2 µm sprøjte filter, og gemme 2 mL alikvoter ved-20 ° C.
  3. Forberede dyrkningsmedier fra Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) lav glucose med 10% føtal serum og 1% af antibiotika.
  4. Indsamle sterile materialer: saks og pincet, en vævskultur kolbe, retter, rør og 10 mL og 5 mL pipetter.
  5. Bruge standard celle kultur laboratorieudstyr: en biologisk sikkerhed kabinet (BSC), en celle kultur inkubator fastsat til 5% CO2 og 38 ° C og en centrifuge.
  6. Rengør BSC: med behandskede hænder, sterilisere det med 70% EtOH, ved hjælp af UV lys.

2. isolering af mesenkymale stamceller fra æggestokken

  1. Efter kirurgi, hold æggestokkene i PBS på is i en konisk rør, indtil ankommer til laboratoriet.
  2. Fylde to petriskåle med 100 mm med 10 mL PBS.
  3. Fjerne æggestokkene fra røret og overføre dem til den første petriskål med PBS. Vaske dem med blande bevægelser.
  4. Forsigtigt hente æggestokken og læg det i en anden skål. Med sterile pincetter og saks, hakkekød vævet ind i meget små stykker, ca 1 mm i størrelse.
  5. Overføre den æggestokkene væv til en 35 mm petriskål og der tilsættes 2 mL collagenase. Hakkekød vævet lidt mere.
  6. Placer petriskålen i inkubator ved 38 ° C til 3 h og Ryst forsigtigt petriskål med cirkulære bevægelser hvert 20 min.
  7. Efter 3 timer, fjerne petriskålen fra rugemaskinen.
  8. Overføre indholdet af skålen til en 15 mL tube. Der tilsættes 5 mL af ekspansion medier.
  9. Forsigtigt invertere tube inden centrifugering. Der centrifugeres tube på 2100 x g i 7 min. Fjern supernatanten og resuspenderes med 3 mL af ekspansion medier.
  10. Overføre toerstoffet til en T25 flaske. Placere flasken i kuvøse med 5% CO2 ved 38 ° C til 3 h.
    Bemærk: Den vigtigste del af proceduren, er at ændre medierne efter 3 h inkubation.
  11. Fjerne flasken fra rugemaskinen og fjerne medier med de resterende væv. Tilføj 3 mL frisk ekspansion medier til flasken.
  12. Ændre medierne hver 48 h og observere flasken for cellulære sammenløb.
    Bemærk: De vigtigste trin i proceduren kan ses i figur 1.

3. udvidelse af mesenkymale stamceller fra æggestokken

  1. Celle passage
    1. Når cellerne kommer til sammenløbet, fjerne medier fra flasken.
    2. Vask flaske med 3 mL PBS. Fjerne PBS.
    3. Der tilsættes 1,5 mL trypsin og sætte flasken i inkubator ved 38 ° C i 3 min. forsigtigt trykke flaske til at hjælpe cellerne til at løsne.
      Bemærk: Celler bør nå sammenløbet ca 5 - 7 d efter den indledende plating.
    4. Tilføj 3 mL af ekspansion medier og overføre indholdet til en konisk slange.
    5. Der centrifugeres tube på 2100 x g i 7 min. Fjern supernatanten og tilsættes 1 mL af ekspansion medier.
    6. Forsigtigt homogeniseres indholdet af røret.
    7. Tage en alikvot af 10 µL af prøven udføre celle optælling og lægge røret med cellerne tilbage i inkubatoren.
    8. Sted 10 µL af blandingen ind i hemocytometer.
  2. Tælling af celler
    1. Bruge den lup 10 X mål og fokusere på gitterlinjer i hemocytometer.
    2. Tælle celler i fem små firkanter (figur 2).
    3. Multiplicer de optalte antallet af 50.000 til at estimere antallet af celler pr. milliliter.

4. differentiering af mesenkymale stamceller fra æggestokken

Bemærk: Differentiering assays blev udført efter retningslinier i Hill et al. 9.

  1. Frø 1,0 x 104 celler pr. brønd, i tre eksemplarer, ved hjælp af en 4-godt kultur parabol.
  2. Der tilsættes 1 mL af ekspansion medier.
  3. Forsigtigt agitere parabol med cirkulære bevægelser.
  4. Efter 24 timer, skal du erstatte kultur medier med ønskeligt differentiering medier.
  5. For osteogenic, adipogenic og chondrogenic differentiering, inkuberes celler med induktion medierne for 30 d, med medier udskiftning hver 3 d. specifikke differentiering kits blev brugt for hver af disse assays.
  6. Neurogen lineage differentiering, Ruger celler for 10 d induktion medier og med medier udskiftning hver 3 d. Medier anvendt her indeholdt DMEM lav glucose, 2 mM valproinsyre, 1 µM hydrocortison, 10 µM forskolin, 5 mM kaliumchlorid, 5 µg/mL insulin og 200 µM direktivet butylhydroxyanisol.
  7. For endoderm prækursorer, inkuberes i 5 d i endoderm medier ifølge reagens producentens anvisninger.
  8. Primordiale kønsceller lineage differentiering, Ruger celler i induktion medier til 14 d, med medier udskiftning hver 3 d. Medier anvendt her indeholdt DMEM, 10% FBS, 1 mM natrium pyruvat, 10 ng/mL LIF, 1 mM uvæsentlige aminosyrer, 2 mM L-glutamin, 5 µg/mL insulin, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 60 µM putrescine, 20 µg/mL transferrin, 10 ng/mL mus epidermal vækstfaktor, 1 ng/mL menneskelige Basic fibroblast vækstfaktor, 40 ng/mL menneskelige glial celler linje-afledte neurotrope faktor, og 15 mg/L penicillin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mesenkymale stamceller isoleret fra Canine æggestok:

Æggestokkene MSC isolation procedure er sammenfattet i figur 1. Efter kirurgi, væv hakning, collagenase fordøjelse og en media ændring 3 h efter begyndelsen af kulturen var en formodede MSC befolkning med hurtige plast klæbende egenskaber med held isoleret fra canine æggestokkene væv. De høstede celler hurtigt overholdt plast overfladen af kultur parabol og voksede til en morfologisk homogene éncellelag kultur med typiske MSC-lignende morfologi (figur 3).

Karakterisering af æggestokkene MSC In Vitro

Målet med MSC karakterisering er at sikre, at isolerede celler er i overensstemmelse med standard MSC kriterier. Disse omfatter overholdelse af plast, en positiv påvisning af mesenchymale overflade markører, og en manglende hæmatopoietisk celleoverflademarkører samt kapacitet til at gennemgå mesodermale differentiering.

Som vist i figur 3, æggestokkene-afledte celler var vedhængende plast og udstillet en fibroblast-lignende morfologi, opfylde det første kriterium, der definerer MSCs. Desuden, de isolerede celler viste udtryk for afskrifter for de canine MSC markører CD44, CD90 og CD105. Derudover blev MSC-specifikke celle overflade antigener CD90 og CD44 opdaget af tidlig passage FACS analyse og immuncytokemi. Fravær af markører CD45 og CD34, som hæmatopoietisk-specifikke celle overflade antigener, blev også bekræftet af de samme teknikker (figur 4). Dette bekræftes yderligere, at æggestokkene indeholder celler, der udtrykker en MSC-specifikke fænotype9. De antistoffer, der blev brugt i dette eksperiment for canine MSC karakterisering er opført i den Tabel of Materials.

Det næste skridt i karakterisering af MSCs er at opnå bevis for deres evne til at differentiere i mesodermale lineages. Efter 30 dage efter eksponering og kultur i slægt-specifikke differentiering protokoller, blev farvning udført for at identificere en forpligtelse til forskellige slægter (figur 5A). En forpligtelse til osteogenic slægt var bekræftet gennem Von Kossa farvning, som identificeret kalkaflejringer. Safranin O proteoglycan farvning bekræftet chondrogenic engagement, og olie røde O lipid farvning bekræftet adipogenic engagement. Fortsætter undersøgelsen af differentiability af disse celler, de var i stand til at gennemgå differentiering af ectodermic slægt, som vist ved immunfarvning for to neuroectodermal stamceller markører: β-tubulin og Nestin, efter udsættelse for æggestok-afledte MSCs neuronal lineage differentiering protokol i 10 dage (figur 5 c). Udskrifter til SOX17 samt CD184 og celle morfologier specifikke til den endodermal slægt, blev observeret efter eksponering for specifikke differentiering protokoller i 5 dage (figur 5B). Endelig, efter 14 dage efter eksponering af æggestokkene-afledte MSC'er til Kim celle induktion medier, okt 4 og DDX4 blev identificeret (fig. 5 d). Sammen, understøtter disse resultater en robust og varieret kapacitet på differentiering for MSCs stammer fra æggestokkene væv, når de udsættes for bestemte differentiering protokoller9.

Figure 1
Figur 1 : Main trin af proceduren isolation. (1) efter operationen, skal du overføre æggestokkene til sterile rør med PBS, på is. (2) for at vaske æggestokkene, skal de overføres til en 100 mm plade med PBS. (3) hakkekød væv i små stykker, ca 1 mm i størrelse. (4) for at befri cellerne fra vævet, overføre stykker af væv til 35 mm plader og tilføje collagenase for en 3 h fordøjelsen i rugemaskinen. (5) overføre indholdet af pladen til en konisk slange til centrifugering. (6) plade pellet i en T25 flaske og Inkuber i 3 h. (7) efter de første 3 h af kultur, ændre kultur medier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Hemocytometer. De fem små firkanter der skal tælles, er markeret med rødt.

Figure 3
Figur 3 : Celle morfologi. Når medierne blev ændret 3 h efter begyndelsen af kulturen resulterede det i en homogen population af mesenchymale celler, som udstillede en fibroblast-lignende morfologi. Tværtimod, når den første medier ændring er gjort efter 48 h kan andre celletyper foruden fibroblast-lignende celler observeres. Skalalinjen = 1.000 µm. Dette tal er blevet ændret fra Hill et al. 9. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Molecular profil af æggestokkene MSC. (A) den isolerede celler udstillet en klassisk MSC markør profil, at være positive for tre MSC markører af real-time PCR (CD90, CD105 og CD44). (B) af proteinanalyse, CD44 var positive i disse celler, og de manglede udtryk for to hæmatopoietisk markører (CD34 og CD45). Skalalinjen = 70 µm. Dette tal er blevet ændret fra Hill et al. 9. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Differentiering af æggestokkene MSC. De isolerede celler var i stand til at differentiere i (A) mesodermale lineages (chondrogenic, osteogenic, og adipogenic; skalalinjen = 70 µm). Desuden cellerne var i stand til at differentiere i begge (B) endodermal prækursorer (skalalinjen = 70 µm) og (C) neurogen lineages (skalalinjen = 50 µm). Interessant, undergik cellerne (D) primordiale kønsceller differentiering, demonstrerer en bred kapacitet på differentiering til æggestokkene mesenkymale stamceller. Dette tal er blevet ændret fra Hill et al. 9. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Heri dokumentere vi at MSC'er kan isoleres fra canine æggestokkene væv, der betragtes som biologisk affald efter ovariectomy. At mange celletyper kan findes i æggestokken, foreslog vi en protokol for at vælge MSCs baseret på deres hurtige overholdelse af plast, som med held har valgt celler, der voksede i en éncellelag med en fibroblast-lignende morfologi.

Den første rapport af afledning af MSC fra knoglemarven var baseret på plast vedhæftning kapacitet af MSCs i løbet af de første 48 timer af kultur11; Det er blevet rapporteret, at denne metode har potentiale til at isolere en heterogen population, fænotype og funktionelt, mindst i knoglemarven12. Metoden foreslåede kultur også vælger celler af plast vedhæftning kapacitet og isolerer mesenchymale celler fra et væv, der har mange celletyper, uden nødvendigheden af sortering ønskeligt cellerne. At mesenkymale stamceller express talrige receptorer, der spiller en vigtig rolle i celle vedhæftning8, det var den hypotese, at hvis en befolkning af celler med hurtige vedhæftning blev udvalgt, ville det resultere i en mere homogen befolkning på den første passage, med en pålidelig MSC profil. De repræsentative resultater giver bevis for, at en kortere varighed plast vedhæftning assay kan bruges til at isolere en morfologisk homogen population af MSC'er i den første passage uden nødvendighed af at vente mere avancerede passager eller celle sortering.

Et afgørende skridt i denne protokol er at ændre media 3 h efter begyndelsen af kulturen. Som vist i afsnittet repræsentative resultater, Stamceller udvundet canine æggestokkene mødte de tre kriterierne for karakterisering af MSCs: de udstillede en fibroblast-lignende morfologi, var positive for forekomst af MSC markører, og blev stand til at differentiere i sådanne mesenchymale lineages som osteogenic, adipogenic og chondrogenic slægter. Celler isoleret i dette eksperiment var også held med differentierede endodermal prækursorer, ectodermal lineages og primordiale kønsceller lineages. Cellerne skal nå sammenløbet ca 5-7 dage efter den oprindelige plating. Celler fra dyr med en fremskreden alder kan vokse langsommere end hos unge dyr, og af dem, færre celler kan overholde plast. I disse tilfælde kan koncentrationen af FBS i medierne øges til 15%.

Udvalg for MSCs baseret på celler med hurtigere overholdelse kapacitet udgør derfor, en billig, strømlinet og effektiv procedure. Fra et terapeutisk synspunkt er det mest vigtigt at fremhæve, at disse celler udgør et lovende redskab for regenerativ medicin, især på grund af deres brede sortiment af differentiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender canine sterilisation programmet på UNESP-FCAV for venligst at give æggestokkene. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra FAPESP (proces no. 2013/14293-0) og KAPPER.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. Academic Press. 513-527 (2013).
  2. Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5, (11), 873-878 (2004).
  3. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22, (2), 255-288 (2001).
  4. Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213, (3), 581-588 (2007).
  5. Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3, (1), 17 (2005).
  6. Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93, (8), 2594-2601 (2010).
  7. Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428, (6979), 145 (2004).
  8. Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28, (8), 875-884 (2000).
  9. Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50, (6), 12391 (2017).
  10. Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
  11. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16, (3), 381-390 (1966).
  12. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12, (9), 1335-1347 (1997).
Afledning og differentiering af Canine æggestokkene mesenkymale stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).More

Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter