Summary
Hierin beschrijven we een methode voor de isolatie, de uitbreiding en de differentiatie van mesenchymale stamcellen van canine eierstokweefsel.
Abstract
Belangstelling voor mesenchymale stamcellen (MSCs) is toegenomen in de afgelopen tien jaar vanwege hun gemak van isolatie, uitbreiding en cultuur. Onlangs, hebben studies aangetoond de brede differentiatie capaciteit die deze cellen bezitten. De eierstok vertegenwoordigt een veelbelovende kandidaat voor cel-gebaseerde therapieën wijten aan het feit dat het is rijk aan MSCs en dat het is vaak weggegooid na ovariotomie chirurgie als biologisch afval. Dit artikel beschrijft de procedures voor de isolatie, de uitbreiding, en differentiatie van MSCs afgeleid van de Hoektand eierstok, zonder de noodzaak voor het sorteren van de cel technieken. Dit protocol vormt een belangrijk instrument voor regeneratieve geneeskunde vanwege de brede toepasbaarheid van deze zeer differentieerbare cellen in klinische proeven en therapeutisch gebruikt.
Introduction
Het aantal gepubliceerde studies die focus op stamcellen sterk toegenomen in het afgelopen decennium, een onderzoek dat heeft zijn aangewakkerd door het gezamenlijke doel om krachtige regeneratieve geneeskunde therapie te ontdekken. Stamcellen hebben twee primaire definiërende Markeringen: zelf - vernieuwing en differentiatie. Mesenchymale stamcellen zijn verantwoordelijk voor regelmatige weefsel omzet en hebben een beperktere capaciteit van differentiatie in vergelijking met embryonale stamcellen1. Onlangs veel studies hebben aangetoond een breed scala van differentiatie van MSCs, en een onderwerp onder discussie is nagegaan of verschillen tussen embryonale en volwassen stamcellen bestaat bij alle2.
Het ovarium oppervlakte-epitheel is een niet-doorgevoerde laag van cellen, relatief minder gedifferentieerd, die spreekt van beide markeringen epitheliale en mesenchymale3, behoud van het vermogen om te differentiëren in verschillende soorten cellen in reactie op Milieusignalen4. De exacte locatie van stamcellen in het vruchtbeginsel is niet goed bekend; echter wordt er geopperd dat de vermelding van de bipotential in de tunica albuginea aanleiding tot kiemcellen5 geven. Immunologische studies hebben veronderstelde dat deze cellen een stromale oorsprong6 hebben of gevestigd in of proximale naar de oppervlakte van de eierstok7 zijn. Aangezien mesenchymale stamcellen express talrijke receptoren die een belangrijke rol in cel adhesie8 spelen, was een experiment ontworpen voor het testen van de hypothese dat het selecteren van een bevolking van cellen met snelle hechting duidelijk een bevolking van cellen wilt isoleren characterizable als Mesenchyme in de natuur. Onze fractie rapporteerde onlangs, de afleiding van MSCs van eierstokweefsel op basis van hun capaciteit van hechting op het kunststof oppervlak van de schotel van de cultuur in de eerste 3 h van cultuur, met het oog op een gezuiverde bevolking van cellen exposeren snelle hechting9. Hier beschrijven we de ontwikkelde methode om mesenchymale stamcellen te isoleren van de eierstokweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit experiment werd uitgevoerd met de eierstokken van vier bastaard teefjes gedoneerd na electieve chirurgie bij een Honds sterilisatie programma. Dit experiment werd goedgekeurd door de ethische commissie voor het gebruik van dieren voor UNESP-FCAV (protocol nr. 026991/13).
1. experimentele voorbereiding
- Bereiden of koop 500 mL steriele Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder calcium of magnesium.
- Bereiden van een collagenase ik stockoplossing door het mengen van 40 µg van het enzym in 1 mL DPBS. Filteren met behulp van een filter van de spuit 0,2 µm en sla 2 mL aliquots bij-20 ° C.
- De voedingsbodems van Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) lage glucose met foetaal serum 10% en 1% van antibiotica voor te bereiden.
- Verzamelen van steriele materialen: schaar en pincet, een kolf van weefselkweek, gerechten, buizen en 10 mL en 5 mL pipetten.
- Gebruik standaard cel cultuur laboratoriumapparatuur: een biologische veiligheidskast (BSC), een cel cultuur incubator vastgesteld op 5% CO2 en 38 ° C en een centrifuge.
- De BSC schoon: met gehandschoende handen, steriliseren met 70% EtOH, met behulp van UV-licht.
2. isolatie van mesenchymale stamcellen uit de eierstok
- Na de operatie, houden de eierstokken in PBS op ijs in een conische buis, tot hun aankomst in het lab.
- Vul twee 100 mm petrischalen met 10 mL PBS.
- Verwijderen van de eierstokken van de buis en deze overbrengen naar de eerste petrischaal met PBS. Wassen ze met het mengen van bewegingen.
- Voorzichtig halen de eierstok en leg deze in een andere schotel. Gehakt met steriel pincet en schaar, het weefsel in zeer kleine stukjes, ongeveer 1 mm groot.
- De eierstokweefsel overbrengen in een 35 mm petrischaal en voeg 2 mL van collagenase. Het weefsel een beetje meer blad.
- Plaats de petrischaal in de incubator bij 38 ° C gedurende 3 uur en zachtjes schud de petrischaal met rondgaande bewegingen iedere 20 min.
- Na 3U, door de petrischaal te verwijderen in de incubator.
- De inhoud van de schotel overbrengen in een tube van 15 mL. Voeg 5 mL van de media van de uitbreiding.
- Voorzichtig omkeren de buis voor centrifugeren. Centrifugeer de buis bij 2100 x g gedurende 7 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 3 mL uitbreiding media.
- De pellet overbrengen in een fles van T25. Plaats de fles in de incubator met 5% CO2 bij 38 ° C gedurende 3 uur.
Opmerking: Het belangrijkste deel van de procedure is om te veranderen de media na 3 uur incubatie. - Verwijder de fles uit de incubator en verwijder het medium met het resterende weefsel. Voeg 3 mL verse uitbreiding media aan de fles.
- Wijzig de media elke 48 h en observeren van de fles voor cellulaire samenvloeiing.
Opmerking: De belangrijkste stappen van de procedure kunnen worden waargenomen in Figuur 1.
3. uitbreiding van mesenchymale stamcellen uit de eierstok
-
Cel passage
- Wanneer de cellen samenvloeiing bereiken, verwijder het medium van de fles.
- Wassen van de fles met 3 mL PBS. Verwijder de PBS.
- Voeg 1,5 mL trypsine en zet de fles in de incubator bij 38 ° C gedurende 3 minuten zachtjes Tik op de fles om te helpen de cellen om los te maken.
Opmerking: De cellen moeten samenvloeiing ongeveer 5 - 7 d na het eerste laagje bereiken. - Voeg 3 mL uitbreiding media en de inhoud overbrengen naar een conische buis.
- Centrifugeer de buis bij 2100 x g gedurende 7 min. Verwijder het supernatant en voeg 1 mL uitbreiding media.
- Meng voorzichtig de inhoud van de tube.
- Neem een aliquoot deel van 10 µL van het monster uit te voeren van cel tellen en zet de buis met de cellen terug in de incubator.
- Plaats 10 µL van het mengsel in de hemocytometer.
-
De cellen tellen
- Gebruik van de Microscoop 10 X doelstelling en focus op de rasterlijnen van de hemocytometer.
- De cellen in vijf kleine vierkantjes (Figuur 2) tellen.
- Vermenigvuldig het getelde aantal door 50.000 om het aantal cellen per milliliter te schatten.
4. differentiatie van mesenchymale stamcellen uit de eierstok
Opmerking: Differentiatie testen werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren die zijn vastgelegd in de heuvel et al. 9.
- Zaad 1.0 x 104 cellen per putje, in drievoud, met behulp van een 4-well cultuur schotel.
- Voeg 1 mL uitbreiding media.
- Zachtjes doorroeren de schotel met rondgaande bewegingen.
- Na 24u, door de media cultuur te vervangen door de media wenselijk differentiatie.
- Voor osteogenic, adipogenic, en chondrogenic de differentiatie, Incubeer de cellen met de inductie media voor 30 d, met vervangen van de opslagmedia elke 3 d. specifieke differentiatie kits voor elk van deze tests werden gebruikt.
- Incubeer de cellen voor 10 d in de inductie media, met het vervangen van de opslagmedia elke 3 d voor neurogene lineage differentiatie. De hier gebruikte media bevatte DMEM lage glucose, 2 mM valproic zuur 1 µM hydrocortison, 10 µM forskolin, kaliumchloride van 5 mM, 5 µg/mL insuline en 200 µM Butylhydroxyanisool hydroxyanisool.
- Incubeer gedurende 5 d in endoderm media volgens de instructies van de fabrikant van het reagens voor endoderm precursoren.
- Incubeer de cellen in de media van de inductie voor 14 d, met vervangen van de opslagmedia elke 3 d voor primordiale kiem lineage celdifferentiatie. De hier gebruikte media bevatte DMEM, 10% FBS, 1 mM natrium pyruvaat, 10 ng/mL LIF, niet-essentiële aminozuren van 1 mM, 2 mM L-glutamine, 5 µg/mL insuline, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 60 µM putrescine, 20 µg Mo/mL transferrine, 10 ng/mL muis epidermale groeifactor, 1 ng/mL menselijke fundamentele fibroblast groeifactor, 40 ng/mL mens gliale cellen lijn-afgeleide neurotrophic factor, en 15 mg/L penicilline.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mesenchymale stamcellen isolatie van Canine eierstok:
De eierstokken MSC isolatie procedure is samengevat in Figuur 1. Na chirurgie, weefsel hakken, collagenase spijsvertering en een media-wijziging 3 uur na het begin van de cultuur werd een vermeende MSC met snelle kunststof-lijm eigenschappen met succes geïsoleerd van canine eierstokweefsel. De geoogste cellen snel vastgehouden aan het plastic oppervlak van de cultuur-schotel en groeide uit tot een morfologisch homogene enkelgelaagde cultuur met een typische morfologie van de MSC-achtige (Figuur 3).
Karakterisering van ovariële MSC In Vitro
Het doel van de karakterisering van het MSC is om ervoor te zorgen dat geïsoleerde cellen aan de criteria van de kwaliteitsnorm MSC voldoen. Het gaat hierbij om naleving van kunststof, een positieve detectie van mesenchymale oppervlakte markers, en een gebrek aan hematopoietische oppervlakte markeringen, evenals de capaciteit om mesodermal differentiatie ondergaan.
Zoals blijkt uit Figuur 3, ovariële-afgeleide cellen waren aanhangend aan het plastic en tentoongestelde een fibroblast-achtige morfologie, voldoen aan het eerste criterium waarin MSCs. Bovendien, de geïsoleerde cellen bleek de expressie van afschriften van de Hoektand MSC-markeringen, CD44, CD90 en CD105. Bovendien, werden MSC-specifieke cel oppervlakte antigenen CD90 en CD44 ontdekt door vroege passage FACS analyse en immunocytochemie. Het ontbreken van de markers, CD45 en CD34, die oppervlakte antigenen van hematopoietische-specifieke cel zijn, werd ook bevestigd door dezelfde technieken (Figuur 4). Dit verder bevestigd dat de eierstok bevat cellen uiten van een MSC-specifieke fenotype9. De antilichamen die werden gebruikt in dit experiment voor canine MSC karakterisering staan de Tabel of Materials.
De volgende stap in de karakterisering van MSCs is te bereiken van bewijs van hun vermogen om te differentiëren in mesodermal geslachten. Na 30 dagen van de blootstelling en cultuur in de differentiatie van het geslacht-specifieke protocollen, werd kleuring uitgevoerd ter identificatie van een verbintenis tot verschillende geslachten (figuur 5A). Een verbintenis tot het osteogenic geslacht werd bevestigd door Von Kossa kleuring, die geïdentificeerd kalkaanslag. Safranine O Proteoglycaan kleuring bevestigd chondrogenic inzet en adipogenic inzet olie Red O lipide kleuring bevestigd. Voortzetting van het onderzoek van de differentieerbaarheid van deze cellen, zij konden ondergaan van differentiatie in de ectodermic afstamming, zoals blijkt uit immunokleuring van twee neuroectodermal stamcel Markeringen: β-tubuline en Nestin, na blootstelling van eierstok-afgeleide MSCs bij het protocol van de differentiatie van neuronale lineage gedurende 10 dagen (figuur 5C). Afschriften voor SOX17 en CD184, evenals de cel morphologies specifiek voor de endodermal afstamming, werden waargenomen na blootstelling aan specifieke differentiatie protocollen voor 5 dagen (figuur 5B). Ten slotte, na 14 dagen na blootstelling van ovariële afkomstige MSCs aan germ cel inductie media, 4 okt en DDX4 werden geïdentificeerd (figuur 5D). Deze resultaten ondersteunen samen, een robuuste en veelzijdige capaciteit van differentiatie voor MSCs afgeleid van eierstokweefsel, wanneer blootgesteld aan specifieke differentiatie protocollen9.
Figuur 1 : Voornaamste stappen van de procedure isolatie. (1) na de operatie, door de eierstokken te overbrengen in steriele buizen met PBS, op ijs. (2) om de eierstokken te wassen, moeten ze worden overgedragen aan een 100 mm plaat met PBS. (3) het blad van het weefsel in kleine stukjes, ongeveer 1 mm groot. (4) om te bevrijden van de cellen van het weefsel, de stukjes weefsel overbrengen in 35 mm platen en collagenase voor een 3U spijsvertering toevoegen in de incubator. (5) het overbrengen van de inhoud van de plaat naar een conische buis voor centrifugeren. (6) plaat de pellet in een fles van T25 en incubeer gedurende 3 h. (7) na de eerste 3 h van de cultuur, de voedingsbodems wijzigen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Hemocytometer. De vijf kleine vierkantjes worden geteld zijn rood gemarkeerd.
Figuur 3 : Cel morfologie. Toen de media 3 h werd veranderd na het begin van de cultuur resulteerde het in een homogene populatie van mesenchymale cellen, die de morfologie van een fibroblast-achtige tentoongesteld. Integendeel, wanneer de eerste media verandering na 48u gebeurt andere celtypes naast de cellen van de fibroblast-achtige waarneembaar. De schaal bar = 1.000 µm. Dit cijfer is gewijzigd van heuvel et al. 9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Moleculaire Profiel van ovariële MSC. (A) de geïsoleerde cellen tentoongesteld een klassieke MSC marker profiel, positief voor drie MSC markeringen door PCR in real time (CD90, CD105 en CD44). (B) door eiwit analyse, was in die cellen CD44 positief, en zij misten de expressie van twee hematopoietische markers (CD34 en CD45). De schaal bar = 70 µm. Dit cijfer is gewijzigd van heuvel et al. 9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Differentiatie van ovariële MSC. De geïsoleerde cellen waren bekwaam om te onderscheiden in (A) mesodermal geslachten (chondrogenic, osteogenic, en adipogenic; de schaal bar = 70 µm). Bovendien, de cellen waren bekwaam om te onderscheiden in beide endodermal (B)-precursoren (de schaal bar = 70 µm) en (C) neurogene lineages (de schaal bar = 50 µm). Interessant, onderging de cellen (D) primordiale kiem celdifferentiatie, aan te tonen een grote capaciteit van differentiatie voor ovariële mesenchymale stamcellen. Dit cijfer is gewijzigd van heuvel et al. 9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We bieden hierin blijkt dat MSCs geïsoleerd van canine ovariaal weefsel, die wordt beschouwd als biologisch afval na ovariotomie kunnen zijn. Wijten aan het feit dat vele celtypes worden in de eierstok gevonden kunnen, voorgesteld hebben wij een protocol om te selecteren op basis van hun snelle naleving van kunststof, die met succes cellen selecteren die groeide in een enkelgelaagde met een fibroblast-achtige morfologie MSCs.
Het eerste verslag van de afleiding van MSCs uit beenmerg was gebaseerd op de capaciteit van de kunststof hechting van de MSCs gedurende de eerste 48 uur van cultuur11; Er is echter gemeld dat deze methode het potentieel heeft om het isoleren van een heterogene populatie, fenotypische en functioneel, ten minste voor het beenmerg12. De voorgestelde cultuur-methode ook worden cellen geselecteerd door kunststof hechting capaciteit en isoleert mesenchymale cellen van een weefsel dat veel celtypen, zonder de noodzaak heeft voor het sorteren van de wenselijke cellen. Wijten aan het feit dat de mesenchymale stamcellen express talrijke receptoren die een belangrijke rol in cel adhesie8 spelen, was het veronderstelde dat als een bevolking van cellen met snelle hechting werden geselecteerd, het zou resulteren in een meer homogene populatie op de eerste passage, met een betrouwbare MSC-profiel. De representatieve resultaten leveren het bewijs dat een kortere duur kunststof adhesie test kan worden gebruikt voor het isoleren van een morfologisch homogene populatie van MSCs op de eerste passage, zonder de noodzaak van het wachten voor meer geavanceerde passages of cel sorteren.
Een cruciale stap in dit protocol is het wijzigen van de media 3 uur na het begin van de cultuur. Zoals u in de sectie representatieve resultaten, de stamcellen verkregen canine eierstokken ontmoette de drie criteria voor de karakterisering van MSCs: ze tentoongesteld een fibroblast-achtige morfologie, waren positief voor de aanwezigheid van MSC markers, en waren bekwaam om te onderscheiden in dergelijke mesenchymale lineages als osteogenic, adipogenic en chondrogenic geslachten. Cellen in dit experiment geïsoleerd waren ook met succes onderscheid gemaakt tussen endodermal precursoren, ectodermal lineages en primordial geslachtscellen geslachten. De cellen moeten samenvloeiing ongeveer 5-7 dagen na het eerste laagje bereiken. De cellen van dieren met een gevorderde leeftijd langzamer dan die van jonge dieren kunnen groeien en die minder cellen kunnen houden aan het plastic. In deze gevallen kan de concentratie van FBS in de media worden verhoogd tot 15%.
Daarom is de selectie voor MSCs op basis van de cellen met een snellere naleving van capaciteit een goedkope, gestroomlijnde en efficiënte procedure. Vanuit therapeutisch gezichtspunt is het meest belangrijk om te benadrukken dat deze cellen een veelbelovend instrument voor regeneratieve geneeskunde, vooral vanwege hun brede waaier van differentiatie vormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen het canine sterilisatie programma op UNESP-FCAV voor het vriendelijk het verstrekken van de eierstokken. Dit werk werd gesteund door subsidies van het FAPESP (proces nr. 2013/14293-0) en CAPES.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
| Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
| DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
| FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
| CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
| CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
| CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
| CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
| Nestin | Milipore | MAB353 | |
| β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
| DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |
References
- Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).
- Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
- Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
- Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).
- Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
- Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145 (2004).
- Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
- Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).
- Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
- Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
- Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).
