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Developmental Biology

व्युत्पत्ति और कुत्ते डिम्बग्रंथि Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव

doi: 10.3791/58163 Published: December 16, 2018

Summary

इस के साथ साथ, हम अलगाव, विस्तार, और कुत्ते डिंबग्रंथि ऊतक से mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के लिए एक विधि का वर्णन ।

Abstract

mesenchymal स्टेम सेल में ब्याज (MSCs) अलगाव, विस्तार, और संस्कृति के अपने आसानी के कारण पिछले एक दशक से अधिक बढ़ गया है । हाल ही में, अध्ययन व्यापक भिंनता क्षमता है कि इन कोशिकाओं के अधिकारी का प्रदर्शन किया है । अंडाशय कोशिका के लिए एक होनहार उंमीदवार का प्रतिनिधित्व करता है आधारित चिकित्सा तथ्य यह है कि यह MSCs में समृद्ध है और यह अक्सर जैविक अपशिष्ट के रूप में ovariectomy सर्जरी के बाद खारिज कर दिया है के कारण । यह लेख अलगाव, विस्तार, और कुत्ते अंडाशय से व्युत्पंन MSCs के अंतर के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है, कोशिका छंटाई तकनीक की आवश्यकता के बिना । यह प्रोटोकॉल नैदानिक परीक्षणों और चिकित्सीय उपयोगों में इन अत्यधिक differentiable कोशिकाओं की व्यापक प्रयोज्यता की वजह से अपक्षयी चिकित्सा के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ।

Introduction

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प्रकाशित अध्ययनों कि स्टेम सेल पर ध्यान केंद्रित की संख्या काफी पिछले एक दशक से अधिक बढ़ गया है, एक अनुसंधान प्रयास है कि शक्तिशाली अपक्षयी चिकित्सा चिकित्सा की खोज के सामूहिक लक्ष्य से ईंधन दिया गया है । स्टेम सेल दो प्राथमिक परिभाषित मार्करों: स्व नवीकरण और भेदभाव है । Mesenchymal स्टेम सेल नियमित रूप से ऊतक कारोबार के लिए जिंमेदार है और भेदभाव की एक अधिक प्रतिबंधित क्षमता है जब भ्रूण स्टेम कोशिकाओं1की तुलना में । हाल ही में, कई अध्ययनों से पता चला है MSCs के भेदभाव की एक विस्तृत श्रृंखला है, और चर्चा के तहत एक विषय है कि क्या भ्रूण और वयस्क स्टेम कोशिकाओं के बीच मतभेद सभी2में मौजूद हैं ।

ovarium सतह उपकला कोशिकाओं की एक प्रतिबद्ध परत, अपेक्षाकृत कम विभेदित है, जो दोनों उपकला और mesenchymal मार्करों3व्यक्त करता है, के जवाब में कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार में अंतर करने की क्षमता को बनाए रखने पर्यावरण सिग्नल4. अंडाशय में स्टेम कोशिकाओं का सही स्थान अच्छी तरह से ज्ञात नहीं है; तथापि, यह प्रस्ताव किया गया है कि tunica albuginea में bipotential progenitors रोगाणु कोशिकाओं को जन्म दे5. प्रतिरक्षा अध्ययनों की कल्पना की है कि इन कोशिकाओं को एक stromal मूल6 या में स्थित है या अंडाशय सतह7के लिए समीपस्थ हैं । के बाद से mesenchymal स्टेम सेल कई रिसेप्टर्स कि कोशिका आसंजन8में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा व्यक्त करते हैं, एक प्रयोग की परिकल्पना है कि तेजी से आसंजन के साथ कोशिकाओं की आबादी का चयन कोशिकाओं की आबादी स्पष्ट रूप से अलग होगा का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था प्रकृति में mesenchymal के रूप में characterizable । हाल ही में, हमारे समूह संस्कृति के पहले 3 ज में संस्कृति पकवान की प्लास्टिक की सतह के लिए आसंजन की उनकी क्षमता के आधार पर डिम्बग्रंथि ऊतक से MSCs के व्युत्पत्ति की सूचना दी, तेजी से आसंजन9प्रदर्शन कोशिकाओं की एक शुद्ध जनसंख्या प्राप्त करने के लिए । यहां, हम mesenchymal के लिए विकसित विधि का वर्णन डिम्बग्रंथि ऊतक से स्टेम सेल अलगाव ।

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Protocol

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यह प्रयोग चार mongrel मादा कुत्तों के अंडाशय एक कुत्ते नसबंदी कार्यक्रम में ऐच्छिक सर्जरी के बाद दान के साथ किया गया था । इस प्रयोग को एथिक्स कमेटी द्वारा UNESP-FCAV (प्रोटोकाल no. 026991/13) के पशुओं के उपयोग पर मंजूरी दी गई ।

1. प्रायोगिक तैयारी

  1. तैयार या कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना बाँझ Dulbecco के फॉस्फेट-बफर खारा (DPBS) के ५०० मिलीलीटर खरीद ।
  2. DPBS के 1 मिलीलीटर में एंजाइम के ४० µ जी मिश्रण से एक collagenase मैं शेयर समाधान तैयार करें । एक ०.२ µm सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर करें, और 2 मिलीलीटर aliquots पर-20 ° c संग्रहीत ।
  3. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम से संस्कृति मीडिया तैयार (DMEM) कम ग्लूकोज 10% भ्रूण सीरम और एंटीबायोटिक दवाओं के 1% के साथ.
  4. बाँझ सामग्री ले लीजिए: कैंची और संदंश, एक ऊतक संस्कृति कुप्पी, बर्तन, ट्यूबों, और 10 मिलीलीटर और 5 मिलीलीटर पिपेट.
  5. का प्रयोग करें मानक सेल संस्कृति प्रयोगशाला उपकरण: एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी), एक सेल संस्कृति मशीन 5% सह2 और ३८ डिग्री सेल्सियस पर सेट है, और एक केंद्रापसारक ।
  6. बीएससी साफ: दस्ताने हाथों के साथ, यह ७०% ेतोः के साथ निष्फल, यूवी रोशनी का उपयोग कर ।

2. अंडाशय से Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं का अलगाव

  1. सर्जरी के बाद, एक शंकु ट्यूब में बर्फ पर पंजाब में अंडाशय रखने के लिए, प्रयोगशाला में उनके आगमन तक.
  2. पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ २ १०० mm पेट्री व्यंजन भरें ।
  3. ट्यूब से अंडाशय निकालें और उन्हें पंजाबियों के साथ पहली पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण । उन्हें मिश्रण आंदोलनों के साथ धो लें ।
  4. धीरे अंडाशय पुनः प्राप्त करने और इसे एक और पकवान में जगह है । बाँझ चिमटी और कैंची के साथ, बहुत छोटे टुकड़ों में ऊतक कीमा, लगभग आकार में 1 मिमी.
  5. डिम्बग्रंथि ऊतक एक ३५ mm पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण और collagenase के 2 मिलीलीटर जोड़ें । एक छोटे से अधिक ऊतक कीमा ।
  6. 3 एच के लिए ३८ डिग्री सेल्सियस पर मशीन में पेट्री पकवान प्लेस और धीरे परिपत्र आंदोलनों हर 20 मिनट के साथ पेट्री पकवान हिला ।
  7. 3 घंटे के बाद, मशीन से पेट्री डिश निकालें ।
  8. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए पकवान की सामग्री स्थानांतरण । विस्तार मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  9. धीरे केंद्रापसारक से पहले ट्यूब उलटा । 7 मिनट के लिए २१०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक supernatant निकालें और विस्तार मीडिया के 3 मिलीलीटर के साथ गोली resuspend ।
  10. एक T25 बोतल के लिए गोली स्थानांतरण । 3 एच के लिए ३८ ° c पर 5% CO2 के साथ मशीन में बोतल प्लेस ।
    नोट: प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है के बाद मीडिया को बदलने के लिए 3 मशीन के एच ।
  11. मशीन से बोतल निकालें और शेष ऊतक के साथ मीडिया को हटा दें । बोतल के लिए ताजा विस्तार मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
  12. मीडिया हर ४८ ज बदलें और सेलुलर संगम के लिए बोतल का निरीक्षण ।
    नोट: प्रक्रिया के मुख्य चरण चित्र 1में स्वीकार्य हो सकते हैं ।

3. अंडाशय से Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं का विस्तार

  1. सेल मार्ग
    1. जब कोशिकाएँ संगम तक पहुँचती हैं तो मीडिया को बोतल से निकाल दें.
    2. पंजाब के 3 मिलीलीटर के साथ बोतल धो लें । पंजाबियों को हटा दें ।
    3. trypsin के १.५ मिलीलीटर जोड़ें और 3 मिनट के लिए ३८ डिग्री सेल्सियस पर मशीन में बोतल डाल । धीरे बोतल नल कोशिकाओं को अलग करने के लिए मदद करते हैं ।
      नोट: कोशिकाओं प्रारंभिक चढ़ाना के बाद लगभग 5-7 d संगम तक पहुंच जाना चाहिए ।
    4. विस्तार मीडिया के 3 मिलीलीटर जोड़ें और एक शंकु ट्यूब के लिए सामग्री हस्तांतरण ।
    5. 7 मिनट के लिए २१०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक supernatant निकालें और विस्तार मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    6. धीरे ट्यूब की सामग्री homogenize ।
    7. नमूने के 10 µ एल के एक aliquot लेने के लिए सेल गिनती करने के लिए और वापस मशीन में कोशिकाओं के साथ ट्यूब डाल दिया ।
    8. इस मिश्रण के 10 µ l को hemocytometer में रखें ।
  2. कोशिकाओं की गिनती
    1. माइक्रोस्कोप की 10x उद्देश्य का उपयोग करें और hemocytometer की ग्रिड लाइनों पर ध्यान केंद्रित ।
    2. पांच छोटे चौकों (चित्रा 2) में कोशिकाओं की गणना ।
    3. प्रति milliliter कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए ५०,००० द्वारा गिना संख्या गुणा ।

4. अंडाशय से Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं का भेदभाव

नोट: विभेद परख हिल एट अल में स्थापित दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया । 9.

  1. बीज १.० x 104 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से, तपसिल में, एक 4-अच्छी तरह से संस्कृति पकवान का उपयोग कर ।
  2. विस्तार मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. धीरे परिपत्र आंदोलनों के साथ पकवान आंदोलन ।
  4. 24 एच के बाद, वांछनीय भेदभाव मीडिया के साथ संस्कृति मीडिया की जगह ।
  5. osteogenic, adipogenic, और chondrogenic भेदभाव के लिए, 30 डी के लिए प्रेरण मीडिया के साथ कोशिकाओं मशीन, मीडिया के प्रतिस्थापन के साथ हर 3 डी विशिष्ट भेदभाव किट इन परख के प्रत्येक के लिए इस्तेमाल किया गया ।
  6. तंत्रिकाजन्य वंश भेदभाव के लिए, प्रेरण मीडिया में 10 डी के लिए कोशिकाओं मशीन, मीडिया के प्रतिस्थापन के साथ हर 3 डी । यहां इस्तेमाल किए गए मीडिया में DMEM कम ग्लूकोज, 2 एमएम वैल्पोरिक एसिड, 1 µ एम hydrocortisone, 10 µ एम forskolin, 5 एमएम पोटेशियम क्लोराइड, 5 µ जी/एमएल इंसुलिन, और २०० µ एम butylated hydroxyanisole शामिल हैं ।
  7. अन्तः पुरोगामी के लिए, अन्तः मीडिया में 5 डी के लिए रिएजेंट निर्माता के निर्देशों के अनुसार मशीन ।
  8. मौलिक रोगाणु कोशिका वंश भेदभाव के लिए, 14 डी के लिए प्रेरण मीडिया में कोशिकाओं की मशीन, मीडिया के प्रतिस्थापन के साथ हर 3 डी । मीडिया यहां इस्तेमाल किया DMEM, 10% FBS, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट निहित, 10 एनजी/एमएल लिफ, 1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 2 मिमी एल-glutamine, 5 µ जी/एमएल इंसुलिन, ०.१ मिमी β-mercaptoethanol, ६० µ m putrescine, 20 µ g/एमएल कैल्सीटोनिन, 10 एनजी/एमएल माउस एपिडर्मल वृद्धि कारक, 1 एनजी/ बेसिक fibroblast ग्रोथ फैक्टर, ४० एनजी/एमएल मानव glial सेल लाइन-व्युत्पंन neurotrophic फैक्टर, और 15 मिलीग्राम/L पेनिसिलिन ।

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Representative Results

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Mesenchymal कुत्ते अंडाशय से स्टेम सेल अलगाव:

डिम्बग्रंथि MSC आइसोलेशन प्रक्रिया चित्रा 1में संक्षेप है । सर्जरी के बाद, ऊतक नख़रेबाज़, collagenase पाचन, और एक मीडिया संस्कृति की शुरुआत के बाद 3 ज बदल, तेजी से प्लास्टिक चिपकने वाला गुण के साथ एक ख्यात एमएससी जनसंख्या सफलतापूर्वक कुत्ते डिम्बग्रंथि ऊतक से अलग किया गया था । फसल की कोशिकाओं तेजी से संस्कृति पकवान की प्लास्टिक की सतह का पालन किया और ठेठ एमएससी की तरह आकृति विज्ञान (चित्रा 3) के साथ एक आकृति विज्ञान सजातीय monolayer संस्कृति में पले ।

डिंबग्रंथि एमएससी के लक्षण वर्णन इन विट्रो में

एमएससी लक्षण वर्णन के लक्ष्य को सुनिश्चित करना है कि पृथक कोशिकाओं मानक एमएससी मानदंडों के अनुरूप है । ये प्लास्टिक का पालन, mesenchymal सतह मार्करों का एक सकारात्मक पता लगाने, और टेम सतह मार्करों की अनुपस्थिति, साथ ही mesodermal भेदभाव से गुजरना करने की क्षमता शामिल हैं ।

चित्रा 3में दिखाया गया है, डिंबग्रंथि व्युत्पंन कोशिकाओं प्लास्टिक के लिए अनुयाई थे और एक fibroblast की तरह आकृति विज्ञान का प्रदर्शन, MSCs परिभाषित करता है कि पहली कसौटी को पूरा करने. इसके अलावा, अलग कोशिकाओं कुत्ते एमएससी मार्करों CD44, CD90, और CD105 के लिए टेप की अभिव्यक्ति दिखाई । इसके अलावा, एमएससी-विशिष्ट कोशिका सतह एंटीजन CD90 और CD44 प्रारंभिक बीतने FACS विश्लेषण और immunocytochemistry द्वारा पता लगाया गया । मार्करों CD45 और CD34, जो टेम-विशिष्ट कोशिका सतह एंटीजन हैं की अनुपस्थिति भी एक ही तकनीक (चित्रा 4) द्वारा पुष्टि की गई थी. यह आगे की पुष्टि की है कि अंडाशय एक एमएससी-विशिष्ट phenotype9व्यक्त कोशिकाओं हैं । एंटीबॉडी कि कुत्ते एमएससी लक्षण वर्णन के लिए इस प्रयोग में प्रयुक्त सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं ।

MSCs के लक्षण वर्णन में अगले कदम के लिए उनके mesodermal वंश में अंतर करने की क्षमता का सबूत प्राप्त है । जोखिम और संस्कृति के वंश में 30 दिनों के बाद विशिष्ट भेदभाव प्रोटोकॉल, धुंधला करने के लिए विभिंन प्रजातियों के लिए एक प्रतिबद्धता की पहचान करने के लिए प्रदर्शन किया गया था (आंकड़ा 5 ए) । osteogenic वंश के लिए एक प्रतिबद्धता वॉन Kossa धुंधला के माध्यम से पुष्टि की थी, जो कैल्शियम जमा की पहचान की । Safranin हे proteoglycan धुंधलाने पुष्टि chondrogenic वचनबद्धता, आणि तेल लाल हे लिपिड धुंधलाने पुष्टि adipogenic वचनबद्धता. इन कोशिकाओं के differentiability की जांच जारी रखने, वे ectodermic वंश में भेदभाव से गुजरना कर रहे थे, के रूप में दो neuroectodermal स्टेम सेल मार्करों के लिए immunostaining द्वारा दिखाया गया: β-tubulin और Nestin, के जोखिम के बाद अंडाशय-10 दिनों (चित्रा 5C) के लिए ंयूरॉन वंश भेदभाव प्रोटोकॉल को MSCs व्युत्पंन । SOX17 और CD184 के लिए टेप, साथ ही सेल endodermal वंश के लिए विशिष्ट morphologies, 5 दिनों (चित्रा 5B) के लिए विशिष्ट भिंनता प्रोटोकॉल के लिए जोखिम के बाद मनाया गया । अंत में, डिम्बग्रंथि के जोखिम के 14 दिनों के बाद रोगाणु सेल प्रेरण मीडिया को व्युत्पंन MSCs, 4 अक्टूबर और DDX4 (चित्रा 5d) की पहचान की गई । एक साथ, इन परिणामों के एक मजबूत और MSCs डिम्बग्रंथि ऊतक से व्युत्पंन के लिए भेदभाव की विविधता की क्षमता का समर्थन, जब विशिष्ट भिंनता प्रोटोकॉल9के संपर्क में ।

Figure 1
चित्रा 1 : आइसोलेशन प्रक्रिया के मुख्य चरण । (1) सर्जरी के बाद, पंजाबियों के साथ बाँझ ट्यूबों के लिए अंडाशय स्थानांतरण, बर्फ पर. (2) अंडाशय धोने के लिए, वे पंजाब के साथ एक १०० mm प्लेट को हस्तांतरित किया जाना चाहिए । (3) छोटे टुकड़ों में ऊतक कीमा, लगभग आकार में 1 मिमी । (4) के लिए ऊतक से कोशिकाओं को मुक्त करने के लिए, ३५ mm प्लेटों ऊतक के टुकड़े हस्तांतरण और मशीन में एक 3 एच पाचन के लिए collagenase जोड़ें । (5) प्लेट की सामग्री एक शंकु ट्यूब के लिए केंद्रापसारक के लिए स्थानांतरण । (6) प्लेट एक T25 बोतल में गोली और 3 घंटे के लिए मशीन (7) संस्कृति के पहले 3 ज के बाद, संस्कृति मीडिया बदल जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : Hemocytometer । गिने जाने वाले पांच छोटे चौराहों को लाल रंग में चिन्हित किया गया है ।

Figure 3
चित्रा 3 : कक्ष आकृति विज्ञान । जब मीडिया 3 एच संस्कृति यह mesenchymal कोशिकाओं है, जो एक fibroblast की तरह आकृति विज्ञान का प्रदर्शन की एक सजातीय जनसंख्या के परिणामस्वरूप की शुरुआत के बाद बदल गया था । इसके विपरीत, जब पहली बार मीडिया परिवर्तन के बाद किया जाता है ४८ एच अन्य कोशिका प्रकार के अलावा fibroblast कोशिकाओं को मनाया जा सकता है. स्केल बार = १,००० µm । यह आंकड़ा हिल एट अल से संशोधित किया गया है । 9. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : डिंबग्रंथि एमएससी की आणविक प्रोफ़ाइल । () पृथक कोशिकाओं को एक क्लासिक एमएससी मार्कर प्रोफ़ाइल का प्रदर्शन किया, वास्तविक समय पीसीआर (CD90, CD105, और CD44) द्वारा तीन एमएससी मार्करों के लिए सकारात्मक जा रहा है । () प्रोटीन विश्लेषण के द्वारा, CD44 उन कोशिकाओं में सकारात्मक था, और वे दो टेम मार्करों (CD34 और CD45) की अभिव्यक्ति की कमी थी । स्केल बार = ७० µm । यह आंकड़ा हिल एट अल से संशोधित किया गया है । 9. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : डिंबग्रंथि एमएससी के भेदभाव । पृथक कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम थे () mesodermal वंश (chondrogenic, osteogenic, और adipogenic; स्केल बार = ७० µm). इसके अलावा, कोशिकाओं दोनों में अंतर करने में सक्षम थे (B) endodermal पुरोगामी (स्केल बार = ७० µm) और (C) तंत्रिकाजन्य वंश (स्केल बार = ५० µm). दिलचस्प है, कोशिकाओं () मौलिक रोगाणु कोशिका भेदभाव, डिंबग्रंथि mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के लिए भेदभाव की एक व्यापक क्षमता का प्रदर्शन किया गया । यह आंकड़ा हिल एट अल से संशोधित किया गया है । 9. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

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इस के साथ साथ हम सबूत है कि MSCs कुत्ते डिंबग्रंथि ऊतक, जो ovariectomy के बाद जैविक अपशिष्ट माना जाता है से अलग किया जा सकता है प्रदान करते हैं । तथ्य यह है कि कई कोशिका प्रकार अंडाशय में पाया जा सकता है के कारण, हम एक fibroblast की तरह आकृति विज्ञान के साथ एक monolayer में पले कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक चयनित प्लास्टिक के लिए उनके तेजी से पालन के आधार पर MSCs का चयन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रस्ताव किया ।

अस्थि मज्जा से MSCs के व्युत्पत्ति की पहली रिपोर्ट संस्कृति11के पहले ४८ ज के दौरान MSCs की प्लास्टिक आसंजन क्षमता पर आधारित थी; हालांकि, यह बताया गया है कि इस विधि के लिए एक विषम आबादी को अलग करने की क्षमता है, phenotypically और कार्यात्मक, अस्थि मज्जा के लिए कम से12। प्रस्तावित संस्कृति विधि भी प्लास्टिक आसंजन क्षमता द्वारा कोशिकाओं का चयन करता है और एक ऊतक है कि कई कोशिका प्रकार है, वांछनीय कोशिकाओं छंटाई की आवश्यकता के बिना से mesenchymal कोशिकाओं को अलग । तथ्य यह है कि mesenchymal स्टेम कोशिकाओं कई रिसेप्टर्स कि सेल आसंजन8में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा एक्सप्रेस के कारण, यह कल्पना की थी कि अगर तेजी से आसंजन के साथ कोशिकाओं की आबादी का चयन किया गया, यह एक अधिक सजातीय जनसंख्या में परिणाम होगा एक विश्वसनीय एमएससी प्रोफ़ाइल के साथ पहला मार्ग, । प्रतिनिधि परिणाम सबूत है कि एक छोटी अवधि प्लास्टिक आसंजन परख के लिए पहले मार्ग पर MSCs के एक आकृति विज्ञान सजातीय आबादी को अलग किया जा सकता है, और अधिक उंनत मार्ग या सेल छंटाई के लिए इंतज़ार कर की आवश्यकता के बिना प्रदान करते हैं ।

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम संस्कृति की शुरुआत के बाद मीडिया 3 ज बदलने के लिए है । के रूप में प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में दिखाया गया है, स्टेम सेल कुत्ते अंडाशय से प्राप्त तीन MSCs के लक्षण वर्णन के लिए स्थापित मानदंड से मुलाकात की: वे एक fibroblast की तरह आकृति विज्ञान का प्रदर्शन किया, एमएससी मार्करों की उपस्थिति के लिए सकारात्मक थे, और थे osteogenic, adipogenic और chondrogenic वंश के रूप में ऐसी mesenchymal वंश में अंतर करने में सक्षम । इस प्रयोग में पृथक कोशिकाओं को भी सफलतापूर्वक endodermal पुरोगामी, ectodermal वंश, और मौलिक रोगाणु कोशिका वंश में अंतर किया गया । कोशिकाओं को प्रारंभिक चढ़ाना के बाद लगभग 5-7 दिनों तक संगम पर पहुँचना चाहिए. एक उंनत उंर के साथ पशुओं से कोशिकाओं को और अधिक युवा पशुओं की तुलना में धीरे से बढ़ सकता है, और उन लोगों की, कम कोशिकाओं प्लास्टिक का पालन कर सकते हैं । इन मामलों में, मीडिया में FBS की एकाग्रता को 15% तक बढ़ाया जा सकता है ।

इसलिए, अधिक तेजी से पालन क्षमता के साथ कोशिकाओं के आधार पर MSCs के लिए चयन एक सस्ती, सुव्यवस्थित और प्रभावी प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है । एक चिकित्सकीय परिप्रेक्ष्य से, यह सबसे महत्वपूर्ण है उजागर करने के लिए कि इन कोशिकाओं को अपक्षयी दवा के लिए एक आशाजनक उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, विशेष रूप से भेदभाव की अपनी विस्तृत श्रृंखला की वजह से ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक UNESP में कुत्ते नसबंदी कार्यक्रम स्वीकार करते है FCAV के लिए कृपया अंडाशय प्रदान । यह काम FAPESP (प्रोसेस नो. 2013/14293-0) और CAPES से अनुदान द्वारा समर्थित था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

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References

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Cite this Article

Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).More

Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).

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