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Developmental Biology

Derivazione e differenziazione delle cellule mesenchimali ovarico canini

doi: 10.3791/58163 Published: December 16, 2018

Summary

Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento, espansione e differenziazione delle cellule staminali mesenchimali da tessuto ovarico canino.

Abstract

Interesse in cellule staminali mesenchimali (MSCs) è aumentato nell'ultimo decennio grazie alla loro facilità di isolamento, espansione e cultura. Recentemente, gli studi hanno dimostrato la capacità di vasta differenziazione che queste cellule possiedono. Ovaia rappresenta un candidato di promessa per le terapie basate sulle cellule dovuto al fatto che è ricco di MSCs e che viene spesso ignorata dopo interventi chirurgici ovariectomia come rifiuti biologici. Questo articolo vengono descritte le procedure per l'isolamento, espansione e differenziazione di cellule staminali mesenchimali derivate dall'ovaia canino, senza la necessità di ordinamento delle cellule tecniche. Questo protocollo rappresenta un importante strumento per la medicina rigenerativa a causa l'ampia applicabilità di queste cellule altamente differenziabile in studi clinici e usi terapeutici.

Introduction

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Il numero degli studi pubblicati che lo stato attivo sulle cellule staminali è aumentato notevolmente nell'ultimo decennio, uno sforzo di ricerca che è stato alimentato dall'obiettivo collettivo di scoprire terapie potente medicina rigenerativa. Le cellule staminali hanno due marcatori definizione primari: auto - rinnovamento e differenziazione. Cellule staminali mesenchimali sono responsabili del suo fatturato regolare del tessuto e hanno una più limitata capacità di differenziazione rispetto alle cellule staminali embrionali1. Recentemente, molti studi hanno dimostrato una vasta gamma di differenziazione di cellule staminali mesenchimali, e un argomento in discussione è se esistono differenze tra cellule staminali embrionali ed adulte a tutti2.

L'epitelio di superficie ovarium è un commit strato di cellule, relativamente meno differenziato, che esprime entrambi marcatori epiteliali e mesenchimali3, mantenendo la capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellule in risposta a segnali ambientali4. La posizione esatta delle cellule staminali nell'ovaia non è ben nota; Tuttavia, è stato proposto che bipotential progenitori in tunica albuginea dare origine a cellule germinali5. Gli studi immunologici hanno ipotizzato che queste cellule hanno un origine stromal6 o si trovano in o prossimale alla superficie dell'ovaia7. Poiché le cellule staminali mesenchimali esprimono numerosi recettori che svolgono un ruolo importante nella cellula adesione8, un esperimento è stato progettato per verificare l'ipotesi che la selezione di una popolazione di cellule con adesione rapida isolerebbero chiaramente una popolazione di cellule caratterizzabili come mesenchymal in natura. Recentemente, il nostro gruppo ha riferito la derivazione di cellule staminali mesenchimali da tessuto ovarico basata sulla loro capacità di aderenza alla superficie plastica del piatto cultura dei primi 3 h di cultura, al fine di ottenere una popolazione purificata delle cellule che esibiscono adesione rapida9. Qui, descriviamo il metodo sviluppato per l'isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto ovarico.

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Protocol

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Questo esperimento è stato effettuato con le ovaie di quattro cani femminili ibridi ha donati dopo chirurgia elettiva in un programma di sterilizzazione canini. Questo esperimento è stato approvato dal comitato etico sull'uso degli animali di UNESP-FCAV (protocollo n. 026991/13).

1. preparazione sperimentale

  1. Preparare o acquistare 500 mL di soluzione tampone fosfato sterile di Dulbecco (DPBS) senza calcio o magnesio.
  2. Preparare una collagenasi stock soluzione mescolando 40 µ g di enzima in 1 mL di DPBS. Filtrare usando un filtro di siringa 0,2 µm e conservare le 2 mL aliquote a-20 ° C.
  3. Preparare i terreni di coltura da glucosio basso di medium (DMEM) dell'Aquila di Dulbecco modificato con 10% siero fetale e l'1% degli antibiotici.
  4. Raccogliere materiali sterili: forbici e pinze, una boccetta di coltura del tessuto, piatti, tubi e pipette da 10 mL e 5 mL.
  5. Utilizzare attrezzature di laboratorio di cultura cella standard: una cappa di sicurezza biologica (BSC), un'incubatrice di coltura cellulare impostata in una centrifuga e 38 ° C e 5% CO2 .
  6. Pulire il BSC: con le mani guantate, sterilizzarlo con 70% EtOH, utilizzando luci UV.

2. isolamento di cellule staminali mesenchimali da ovaio

  1. Dopo l'intervento chirurgico, mantenere le ovaie in PBS sul ghiaccio in un tubo conico, fino al loro arrivo al laboratorio.
  2. Riempire due capsule di Petri 100 mm con 10 mL di PBS.
  3. Rimuovere le ovaie dal tubo e trasferirli il primo piatto di Petri con PBS. Lavarli con movimenti di miscelazione.
  4. Delicatamente recuperare l'ovaio e inserirlo in un altro piatto. Con forbici e pinzette sterili, tritare il tessuto in pezzi molto piccoli, circa 1 mm di dimensione.
  5. Trasferire il tessuto ovarico a un 35 mm di Petri e aggiungere 2 mL di collagenasi. Tritare il tessuto un po' di più.
  6. Posizionare la piastra di Petri nell'incubatore a 38 ° C per 3 h e agitare delicatamente la capsula di Petri con movimenti circolari ogni 20 min.
  7. Dopo 3 h, è necessario rimuovere la capsula di Petri dall'incubatrice.
  8. Trasferire il contenuto del piatto per un tubo da 15 mL. Aggiungere 5 mL di media espansione.
  9. Capovolgere delicatamente la provetta prima centrifugazione. Centrifugare la provetta a 2100 x g per 7 minuti rimuovere il surnatante e risospendere il sedimento con 3 mL di media espansione.
  10. Trasferire il pellet per una bottiglia di T25. Posizionare la bottiglia nell'incubatore con 5% CO2 a 38 ° C per 3 h.
    Nota: La parte più importante della procedura è quello di cambiare il supporto dopo 3 h di incubazione.
  11. Rimuovere la bottiglia dall'incubatrice e rimuovere il supporto con il tessuto rimanente. Aggiungere 3 mL di media espansione fresco alla bottiglia.
  12. Modificare i media ogni 48 h e osservare la bottiglia per cellulare confluenza.
    Nota: Le fasi principali della procedura possono essere osservate nella Figura 1.

3. espansione di cellule staminali mesenchimali da ovaio

  1. Passaggio delle cellule
    1. Quando le cellule raggiungono la confluenza, rimuovere il supporto dalla bottiglia.
    2. Lavare la bottiglia con 3 mL di PBS. Rimuovere il PBS.
    3. Aggiungere 1,5 mL di tripsina e mettere la bottiglia in incubatrice a 38 ° C per 3 min. Picchiettare delicatamente la bottiglia per aiutare le cellule a staccare.
      Nota: Le celle dovrebbero raggiungere la confluenza circa 5 - 7 d dopo la placcatura iniziale.
    4. Aggiungere 3 mL di media espansione e trasferire il contenuto in una provetta conica.
    5. Centrifugare la provetta a 2100 x g per 7 minuti rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di media espansione.
    6. Mescolare delicatamente il contenuto della provetta.
    7. Prendere un'aliquota di 10 µ l di campione per eseguire cella conteggio e rimettere il tubo con le cellule in incubatrice.
    8. Posto 10 µ l della miscela nell'emocitometro.
  2. Contando le cellule
    1. Utilizzare obiettivo del microscopio 10X e concentrarsi sulle linee della griglia dell'emocitometro.
    2. Contare le celle in cinque piccole piazze (Figura 2).
    3. Moltiplicare il numero contato per 50.000 per stimare il numero di cellule per millilitro.

4. la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali da ovaio

Nota: Analisi di differenziazione sono state eseguite secondo le linee guida stabilite in Hill et al. 9.

  1. Cellule di4 seme 1.0 x 10 per pozzetto, in triplice copia, utilizzando una piastra di coltura 4 pozzetti.
  2. Aggiungere 1 mL di media espansione.
  3. Agitare delicatamente il piatto con movimenti circolari.
  4. Dopo 24 h, sostituire i terreni di coltura con i media di differenziazione desiderabile.
  5. Per osteogenica, adipogenico e differenziazione condrogenica, incubare le cellule con il supporto di induzione per 30D, con sostituzione dei supporti ogni 3 kit di differenziazione specifica d. sono stati utilizzati per ciascuno di questi test.
  6. Per differenziazione di lignaggio neurogena, incubare le cellule per 10 d nei media ad induzione, con sostituzione dei supporti ogni d 3. I supporti utilizzati qui contenevano DMEM basso del glucosio, acido valproico 2 mM, 1 idrocortisone µM, 10 µM forskolin, cloruro di potassio di 5 mM, 5 µ g/mL insulina e 200 µM idrossianisolo butilato.
  7. Per precursori endoderma, incubare per 5 d media endoderma secondo le istruzioni del produttore dei reagenti.
  8. Per il differenziamento di cellule germinali primordiali lignaggio, incubare le cellule nei media di induzione per 14 d, con sostituzione dei supporti ogni d 3. I supporti utilizzati qui contenute DMEM 10% FBS, piruvato di sodio di 1 mM, LIF, aminoacidi non essenziali di 1 mM, 2 mM L-Glutammina, 5 µ g/mL insulina, 0,1 mM β-mercaptoetanolo, putrescina di 60 µM, transferrina di 20 µ g/mL, 10 ng/mL del mouse fattore di crescita epidermico, 1 ng/mL umano 10 ng/mL fattore di crescita di base del fibroblasto, 40 ng/mL umani glial cell fattore neurotrophic linea-derivato e penicillina 15 mg/L.

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Representative Results

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Isolamento di cellule staminali mesenchimali da ovaio canino:

La procedura di isolamento MSC ovarica è riassunto nella Figura 1. Dopo chirurgia, tessuto tritacarne, digestione della collagenosi e un cambiamento di media 3 h dopo l'inizio della cultura, una popolazione di MSC putativa con rapida plastica-adesivo proprietà era correttamente isolata da tessuto ovarico canino. Le cellule prelevate rapidamente aderito alla superficie plastica della piastra di coltura ed è cresciuto in una cultura morfologicamente omogeneo monostrato con morfologia tipica di MSC-like (Figura 3).

Caratterizzazione di MSC ovarico In Vitro

L'obiettivo della caratterizzazione di MSC è per garantire che le cellule isolate sono conformi ai criteri standard di MSC. Questi includono l'aderenza di plastica, un rilevamento positivo degli indicatori mesenchymal della superficie e un'assenza di marcatori di superficie ematopoietici, nonché la capacità di subire la differenziazione mesodermal.

Come mostrato nella Figura 3, cellule ovariche erano aderenti alla plastica ed esibita una morfologia fibroblasto-come, che soddisfano il primo criterio che definisce MSCs. Inoltre, le cellule isolate hanno mostrato l'espressione delle trascrizioni per gli indicatori MSC canini CD44, CD90 e CD105. Inoltre, MSC specifici antigeni superficiali CD90 e CD44 sono stati rilevati dall'analisi di FACS passaggio precoce e immunocytochemistry. L'assenza dei marcatori CD45 e CD34, che sono gli antigeni di superficie delle cellule ematopoietiche-specifiche, è stata anche confermata dalle stesse tecniche (Figura 4). Questo è ulteriormente confermato che l'ovaio contiene le cellule che esprimono un fenotipo di MSC specifico9. Gli anticorpi che sono stati utilizzati in questo esperimento per la caratterizzazione di MSC canini sono elencati nella Tabella materiali.

Il passo successivo nella caratterizzazione delle MSCs è raggiungere la prova della loro capacità di differenziarsi in linee cellulari mesodermal. Dopo 30 giorni di esposizione e cultura nei protocolli di differenziazione di stirpe-specific, macchiatura è stata effettuata per identificare un impegno a diversi lignaggi (Figura 5A). Un impegno verso la linea osteogenica è stato confermato attraverso Von Kossa macchiatura, individuati i giacimenti del calcio. Safranina O proteoglycan colorazione confermato impegno condrogenica e Oil Red O lipidica colorazione confermato adipogenico impegno. Proseguendo l'indagine di differenziabilità di queste cellule, erano in grado di subire la differenziazione verso la linea ectodermica, come mostrato immunostaining per i due marcatori di cellule staminali neuroectodermal: β-tubulina e Nestin, dopo l'esposizione di MSCs ovaia-derivato per il protocollo di differenziazione neuronale lignaggio per 10 giorni (Figura 5). Trascrizioni per SOX17 e CD184, nonché a morfologie delle cellule specifiche del lineage endodermico, sono state osservate dopo l'esposizione a protocolli di differenziazione specifica per 5 giorni (figura 5B). Infine, dopo 14 giorni di esposizione delle ovarico derivato MSCs per germe cella media di induzione, 4 OCT e DDX4 sono stati identificati (Figura 5). Insieme, questi risultati sostengono una solida e diversificata capacità di differenziazione per MSCs derivate da tessuto ovarico, quando esposti a differenziazione specifica protocolli9.

Figure 1
Figura 1 : Le fasi principali della procedura isolamento. (1) dopo la chirurgia, è possibile trasferire le ovaie a tubi sterili con PBS, sul ghiaccio. (2) al fine di lavare le ovaie, siano trasferiti ad una piastra di 100mm con PBS. (3) Tritare il tessuto in piccoli pezzi, dimensioni di circa 1 mm. (4) al fine di liberare le cellule dal tessuto, trasferire i pezzi di tessuto a piastre 35 mm e aggiungere collagenasi per una digestione 3 h nell'incubatrice. (5) trasferire il contenuto della piastra in una provetta conica per centrifugazione. (6) piastra il pellet in una bottiglia di T25 e incubare per 3 h. (7) dopo le prime 3 ore di cultura, cambiare i terreni di coltura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Emocitometro. I cinque piccoli quadrati da contare sono contrassegnati in rosso.

Figure 3
Figura 3 : Morfologia di cell. Quando i media è stato cambiato 3 h dopo l'inizio della cultura ha provocato una popolazione omogenea delle cellule mesenchimali, che ha esibito una fibroblasto-come la morfologia. Al contrario, quando il primo cambiamento di supporto avviene dopo 48 h altri tipi di cellule oltre il fibroblasto-come le cellule possono essere osservati. La barra della scala = 1.000 µm. Questa figura è stata modificata da Hill et al. 9. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Profilo molecolare di ovarico MSC. (A) l'isolato cellule hanno esibito un profilo classico di marcatore MSC, essendo positivo per gli indicatori di PCR in tempo reale (CD90, CD105 e CD44) tre-MSC. (B) dall'analisi della proteina, CD44 è stato positivo in quelle celle, e mancava l'espressione di due marcatori ematopoietici (CD34 e CD45). La barra della scala = 70 µm. Questa figura è stata modificata da Hill et al. 9. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Differenziazione delle MSC ovarica. Le cellule isolate erano in grado di differenziarsi in (A) mesodermal lignaggi (condrogenica, osteogenica e adipogenico; la barra della scala = 70 µm). Inoltre, le cellule erano in grado di differenziarsi in entrambi precursori endodermici (B) (la barra della scala = 70 µm) e (C) neurogene lignaggi (la barra della scala = 50 µm). Interessante, le cellule hanno subito la differenziazione di cellule germinali primordiali (D), dimostrando una vasta capacità di differenziazione di cellule staminali mesenchimali ovariche. Questa figura è stata modificata da Hill et al. 9. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Qui forniamo la prova che MSCs possono essere isolate da tessuto ovarico canino, che è considerato un rifiuto biologico dopo l'ovariectomia. Dovuto al fatto che molti tipi di cellule possono essere trovati nell'ovaia, abbiamo proposto un protocollo per selezionare MSCs basato sulla loro aderenza rapida alla plastica, che ha selezionato correttamente le cellule che si è sviluppato in un monostrato con una morfologia di fibroblasto-come.

Il primo rapporto della derivazione di cellule staminali mesenchimali dal midollo osseo si basava sulla capacità plastica adesione delle MSCs durante le prime 48 ore di cultura11; Tuttavia, è stato segnalato che questo metodo ha il potenziale per isolare una popolazione eterogenea, fenotipicamente e funzionalmente, almeno per midollo osseo12. Il metodo proposto cultura anche seleziona le celle dalla capacità di adesione plastica e consente di isolare cellule mesenchimali da un tessuto che ha molti tipi di cellule, senza la necessità dell'ordinamento le cellule desiderabile. Dovuto al fatto che cellule staminali mesenchimali esprimono numerosi recettori che svolgono un ruolo importante nella cellula adesione8, è stato supposto che se una popolazione di cellule con adesione rapida sono stata selezionata, si tradurrebbe in una popolazione più omogenea presso il primo passaggio, con un profilo MSC affidabile. I rappresentante risultati forniscono la prova che un'analisi di adesione plastica di durata più breve può essere utilizzato per isolare una popolazione morfologicamente omogenea di MSCs al primo passaggio, senza la necessità di aspettare per passaggi più avanzate o cella ordinamento.

Un passaggio fondamentale in questo protocollo è quello di cambiare il supporto 3 h dopo l'inizio della cultura. Come illustrato nella sezione risultati rappresentativi, le cellule staminali ottenute da ovaie canine soddisfatti i tre criteri stabiliti per la caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali: essi hanno esibito una fibroblasto-come la morfologia, erano positivi per la presenza di marcatori MSC e sono stati in grado di differenziarsi in tali lignaggi mesenchymal come osteogenica, adipogenico e condrogenica lignaggi. Le cellule isolate in questo esperimento sono state differenziate con successo anche in precursori endodermici, ectodermiche lignaggi e lignaggi di cellule germinali primordiali. Le cellule devono raggiungere confluenza circa 5-7 giorni dopo la placcatura iniziale. Le cellule dagli animali con età avanzata possono crescere più lentamente rispetto a quelli degli animali giovani, e di quelli, meno cellule possono aderire alla plastica. In questi casi, la concentrazione di FBS nei media può essere aumentata al 15%.

Di conseguenza, la selezione per MSCs basata sulle celle con capacità di aderenza più rapida rappresenta una procedura poco costoso, snella ed efficace. Dal punto di vista terapeutico, è più importante sottolineare che queste cellule rappresentano uno strumento promettente per la medicina rigenerativa, soprattutto a causa della loro vasta gamma di differenziazione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono il programma di sterilizzazione canina a UNESP-FCAV per aver gentilmente fornito le ovaie. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da FAPESP (processo n. 2013/14293-0) e mantelle.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Derivazione e differenziazione delle cellule mesenchimali ovarico canini
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Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).More

Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).

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