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Developmental Biology

導出とイヌの卵巣間葉系幹細胞の分化

doi: 10.3791/58163 Published: December 16, 2018

Summary

ここで、分離、拡張、および犬の卵巣組織から間葉系幹細胞の分化の手法について述べる。

Abstract

間葉系幹細胞 (MSCs) の金利は、分離、拡張、および文化の容易にするため過去 10 年間増加しています。最近、研究はこれらの細胞を持っている広い分化能力を実証しています。卵巣は、MSCs が豊富です、それは頻繁、生物系廃棄物として卵巣摘出手術後破棄されるため細胞ベースの治療のための有望な候補を表します。隔離、拡張のための手順を説明し、細胞選別の必要なし、犬の卵巣由来の分化技術。このプロトコルは、臨床試験のこれらの高い微分可能セルの幅広い適用性のため再生医療のための重要なツールを表し、治療を使用します。

Introduction

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幹細胞に焦点を当てるを過去 10 年間強力な再生医療の治療法の発見の集団の目標によって支えられている研究努力で大幅に増加している発表された研究の数です。幹細胞がある 2 つの主要な定義のマーカー: 自己改修と分化。間葉系幹細胞は正規の組織の売り上げ高し、分化1胚性幹細胞と比較した場合の制限のより強い能力を持っています。最近では、多くの研究は、MSCs の分化の広い範囲を示しているし、の議論の下でトピックがすべて2胎児および成体幹細胞の違いが存在するかどうか。

卵巣表面上皮は、コミットされていない細胞の層、比較的少ない差別化、表現両方上皮と間葉系マーカー3、さまざまな種類の細胞に分化する能力を保持します。環境シグナル4。卵巣の幹細胞の正確な位置はよく知られている; ないです。しかし、逃げずに bipotential 前駆細胞が生殖細胞5に上昇を与えることが提案されている.これらの細胞が間質起源6を持っているまたはまたは卵巣表面7に近位に存在する、免疫学的研究、仮説を立てた。迅速な接着と細胞の人口の選択セルの人口を明確に特定するという仮説を検証する実験が設計された以来、間葉系幹細胞は、細胞接着8で重要な役割を果たす多くの受容体を表現、自然の中に間葉系として characterizable。最近、私たちのグループは、MSCs の迅速な接着9電池の精製された人口を得るために、文化の最初の 3 時間で培養皿のプラスチック表面への密着性の能力に基づく卵巣組織からの派生を報告しました。ここでは、卵巣組織から間葉系幹細胞分離法の開発について述べる.

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Protocol

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この実験は、犬の滅菌プログラムで手術後寄贈 4 雑種メス犬の卵巣を行った。この実験は UNESP-FCAV (プロトコル番号 026991/13) の動物の使用の倫理委員会で承認されました。

1. 実験準備

  1. 準備またはダルベッコ滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) カルシウムやマグネシウムなしの 500 mL を購入します。
  2. 準備、コラゲナーゼの DPBS 1 mL に酵素 40 μ g を混合することによってソリューションをストックします。0.2 μ m のシリンジ フィルターを使用してフィルターを適用し、-20 ° C で 2 mL 因数を格納
  3. ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 低グルコース 10% 胎児血清と抗生物質の 1% から培地を準備します。
  4. 滅菌材料を集める: ハサミ、鉗子、培養フラスコ料理・ チューブ ・ 10 mL と 5 mL のピペットです。
  5. 標準的な細胞培養実験装置を使用して: 生物学的安全キャビネット (BSC)、5% CO2と 38 ° C、および遠心分離機に設定セル文化インキュベーター。
  6. きれいに BSC: 70% に滅菌手袋をはめた手で UV ライトを使用して、エタノール。

2. 卵巣から幹細胞の分離

  1. 手術後、ラボに到着するまで円錐管で氷の上の PBS で卵巣を維持します。
  2. 10 mL の PBS で 2 つの 100 mm ペトリ皿を埋めます。
  3. チューブから卵巣を削除し、PBS で最初のシャーレにそれらを転送します。動きの混合で洗ってください。
  4. 優しく卵巣を取得し、別皿に。滅菌ピンセットとはさみ、約 1 mm サイズの非常に小さな部分に、ティッシュをミンチします。
  5. 35 mm ペトリ皿の卵巣組織を転送し、コラゲナーゼの 2 mL を追加します。もう少し組織をミンチします。
  6. ペトリ皿を 38 ° C で 3 時間のためのインキュベーターで置き、円形の動き 20 分毎でシャーレを軽く振る。
  7. 3 時間後に、インキュベーターからペトリ皿を削除します。
  8. 15 mL チューブに料理の内容を転送します。増殖培地 5 mL を追加します。
  9. 軽く遠心分離前にチューブを反転します。2100 x g で 7 分間削除でチューブに上清を遠心し、増殖培地 3 mL にペレットを再懸濁します。
  10. T25 ボトルにペレットを転送します。5% でインキュベーターでボトルを配置38 ° C 3 時間で CO2
    注: プロシージャの最も重要な部分は、インキュベーションの 3 h 後メディアを変更することです。
  11. インキュベーターからボトルを外し、残りの組織とメディア。新鮮な増殖培地 3 mL をボトルに追加します。
  12. メディアごとの 48 h を変更し、細胞の合流のためのびんを調べます。
    注: プロシージャの主な手順は、図 1に観察できます。

3. 卵巣から幹細胞の拡大

  1. セルの通路
    1. セルが合流点に達したら、ボトルからメディアを削除します。
    2. PBS の 3 ml ボトルを洗います。PBS を削除します。
    3. 1.5 mL のトリプシンおよび 3 分の 38 ° C でインキュベーターでボトルをデタッチする細胞を助けてボトルを軽く入れを追加します。
      注: 電池が合流点約 5 - 7 初期めっき後 d に達する必要があります。
    4. 増殖培地 3 mL を追加し、内容を円錐管に転送します。
    5. 2100 x gで 7 分間削除でチューブに上清を遠心し、増殖培地 1 mL を加えます。
    6. 優しく管の内容をホモジナイズしてください。
    7. カウントのインキュベーターにセルでチューブを入れてセルを実行するサンプルの 10 μ L の因数を取る。
    8. 場所 10 μ、検定にミックス。
  2. セルをカウント
    1. 顕微鏡の対物レンズ 10 倍を使用し、検定のグリッド行に焦点を当てます。
    2. 5 つの小さな正方形 (図 2) のセルをカウントします。
    3. カウント数を 50,000 ミリリットルあたりのセル数を推定するに乗算します。

4. 卵巣からの間葉系幹細胞の分化

注: 分化アッセイのヒルに規定されたガイドラインに従って行われました。9

  1. 好評につき、3 通、4 ウェル培養皿を用いた種子 1.0 × 104セルです。
  2. 拡張メディアの 1 つの mL を追加します。
  3. 円形の動きが付いている皿を振ちましょう。
  4. 24 h 後、培地を望ましい分化メディアに置き換えます。
  5. 骨、脂肪細胞、軟骨細胞分化誘導メディア 30 d で細胞をインキュベート、メディアの交換すべて 3 d. 特定の分化キットはそれぞれこれらのアッセイのため使用されました。
  6. 神経因性の系統分化誘導メディア、メディアの交換すべての 3 d と 10 d の細胞を孵化させなさい。ここで使用するメディアには、DMEM 低血糖 2 mM バルプロ酸、1 μ M ヒドロコルチゾン、10 μ M フォルスコリン、塩化カリウム 5 mM、5 μ G/ml, インスリン, 200 μ M ブチルヒドロキシアニソールが含まれています。
  7. 内胚葉前駆体の 5 d は内胚葉メディア試薬製造元の指示に従って、孵化させなさい。
  8. 始原生殖細胞系への分化、14 d、メディアの交換すべて 3 d で誘導メディア内のセルを孵化させなさい。ここで使用されるメディアに DMEM, 10 %fbs, ピルビン酸ナトリウム 1 mM、10 ng/mL LIF、1 mM 非必須アミノ酸、2 mM L グルタミン、5 μ g/mL インスリン、0.1 mM β-メルカプトエタノール、60 μ M のプトレシン、20 μ G/ml トランスフェリン、10 ng/mL マウス表皮成長因子、1 ng/mL の人間が含まれています。塩基性繊維芽細胞成長因子 40 ng/mL 人間グリア細胞由来神経栄養因子と 15 mg/L ペニシリン。

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Representative Results

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犬の卵巣から幹細胞の分離:

卵巣の MSC 分離手順は、図 1のとおりです。手術、組織のミンチ、コラゲナーゼの消化力、メディア変更文化の初めの後の 3 時間後、急速なプラスチック接着特性と推定される MSC 人口が犬の卵巣組織から正常に分離された.収穫された細胞は培養皿のプラスチック表面に付着かつ典型的な MSC のような形状 (図 3) と形態学的に均質な単一層文化へと成長しました。

卵巣の MSC のキャラクタリゼーション In Vitro

MSC 解析の目標は、隔離されたセルが MSC の基準に適合するようにするためです。プラスチック、間葉系の表面マーカーの検出、造血の表面マーカーの不在と中胚葉分化する能力への付着が含まれます。

卵巣由来細胞がプラスチックに付着、展示の図 3のように、線維芽細胞のような形態、MSCs を定義する最初の条件を満たします。また、隔離されたセルは、犬の MSC マーカー CD44、CD90, CD105 のトラン スクリプトの式を示した。さらに、MSC 固有細胞表面抗原 CD90 と CD44 は初期一節 FACS 解析の試みとして検出されました。CD45 と CD34、特異的造血細胞表面抗原であるマーカーがない場合 (図 4) と同じ方法で確認されました。これはさらに MSC 固有表現型9を発現する細胞が卵巣に含まれていることを確認します。犬の MSC 特性のこの実験で使用された抗体に掲げる、テーブルの材料

MSCs の特性の次のステップは、中胚葉性の系統に分化する能力の証明を達成するためにです。露出と分化系統固有のプロトコルで文化の 30 日後に染色を異なる系統 (図 5 a) へのコミットメントを識別するために行った。カルシウム沈着を識別コッサ染色、を通じて骨系統へのコミットメントを確認しました。軟骨のコミットメントを確認サフラニン O プロテオグリカン染色し、脂肪細胞のコミットメントを確認したオイル赤い O 脂質染色します。2 つの神経外胚葉性幹細胞マーカーの免疫染色で示すように、彼らは ectodermic 系統に分化することができるしましたこれらの細胞の議論の調査を継続し、: β-チューブリンと暴露 Nestin10 日間 (図 5) の神経系統分化プロトコルに卵巣由来 Msc。内胚葉系統に固有の細胞の形態と同様、SOX17 および CD184、トラン スクリプトは、5 日間 (図 5 b) の特定の微分のプロトコルへの暴露後観察されました。最後に、14 日間の暴露卵巣派生後生殖する MSCs の細胞を誘導媒体、10 月 4 日、DDX4 が識別された (図 5)。一緒に、これらの結果は、卵巣組織に由来する特定の分化プロトコル9にさらされる MSCs の分化の強く、多様な能力をサポートします。

Figure 1
図 1: 分離のプロシージャの主な手順です。(手術後 1) 氷の上の PBS の生殖不能の管に卵巣を転送します。(2) 卵巣を洗うに PBS で 100 mm プレートに転送する必要があります。(3) サイズ: 約 1 mm 小さな部分にティッシュをミンチします。(4) 組織から細胞を解放する 35 mm プレートに組織の部分を転送し、インキュベーターで 3 h 消化にコラゲナーゼを追加します。(5) 遠心分離用コニカル チューブにプレートの内容を転送します。(6) プレート コート t25 フラスコ ボトルにペレットとインキュベートする 3 h (7) 文化の最初の 3 時間後、培地を変更します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 検定します。数えられるべき 5 つの小さな正方形は、赤でマークされます。

Figure 3
図 3: 細胞形態。メディア文化の初めの後 3 h が変更されたときの間葉系細胞、線維芽細胞様形態を表わした同質な人口になったそれどころか、最初のメディア変更は 48 時間後に行われる線維芽細胞様細胞のほか、他のセルタイプが観察できます。スケール バー = 1,000 μ m。この図は、ヒルから変更されています。9.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 卵巣の MSC の分子プロファイル。(A) 免震細胞展示古典的な MSC のマーカーのプロファイル、リアルタイム PCR (CD90, CD105 と CD44) による 3 つの MSC マーカー陽性が。(B) タンパク質解析による CD44 陽性であったこれらのセルに、彼らは (CD34 と CD45) 2 つの造血のマーカーの発現を欠いていた。スケール バー = 70 μ m。この図は、ヒルから変更されています。9.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 卵巣の MSC の分化します。隔離されたセル (A) 胚葉系統に分化することができた (軟骨、骨、および脂肪細胞; スケールバー = 70 μ m)。さらに、セル両方 (B) 内皮前駆細胞に分化することができました (スケール バー = 70 μ m) と (C) 神経因性系統 (スケールバー = 50 μ m)。興味深いことに、セルは、(D) 原始生殖細胞の分化、卵巣の間葉系幹細胞の分化の広い容量を示すを施行した.この図は、ヒルから変更されています。9.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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ここ MSCs が卵巣摘出後生物系廃棄物をある犬の卵巣組織から分離でき、証拠を提供します。卵巣に多くの細胞のタイプを見つけることができます、という事実のために、プラスチックは、線維芽細胞のような形態の単分子膜の成長細胞を正常に選択への急速な遵守に基づいて MSCs を選択するプロトコルを提案しました。

MSCs の骨髄からの派生の最初レポートは文化11; の最初の 48 時間の間に、MSCs のプラスチック付着能に基づいていたただし、それ報告されている、このメソッドを分離する異種集団表現型と機能的には、少なくとも骨髄12の可能性。本培養法はまたプラスチック接着能力によってセルを選択し、望ましいセルを並べ替えを必要としない、多くの細胞型が組織から間葉系細胞を分離します。仮説のより同質な人口になる迅速な接着と細胞の人口を選択した場合、間葉系幹細胞は、細胞接着8で重要な役割を果たす多くの受容体を表現、という事実のために、信頼性の高い MSC プロファイルを持つ最初の一節。代表的な結果は、短い期間性プラスチック接着アッセイが待っているより高度な文章を必要としない最初の通路で MSCs の形態学的に同質な人口を分離する使用ことができますまたはソートするセルの証拠を提供します。

このプロトコルの重要なステップは、文化の初めの後メディア 3 h を変更します。MSCs の特性の 3 つの基準代表結果] セクションのように、犬の卵巣から幹細胞に会った: 線維芽細胞のような形態を展示、MSC マーカーの存在を陽性し、されました。骨、脂肪細胞、軟骨細胞の系統としてそのような間葉系の系統に分化することができます。この実験では分離した細胞は内胚葉前駆体、外胚葉系統と始原生殖細胞系列にも正常に区別されました。セルは初期めっき後約 5-7 日に合流点に届きます。高齢の動物から細胞が若い動物のそれらよりもっとゆっくり増えるかもしれませんし、それらのより少ないセルがプラスチックに付着します。これらのケースでメディアに FBS の濃度は、15% に上がります。

したがって、mscs がより迅速な付着容量とセルに基づく選択は、安価な合理的、かつ効果的なプロシージャを表します。治療の観点からは、これらの細胞分化の広い範囲、特にのための再生医療の有望なツールを表すハイライト表示に最も重要です。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

著者は、卵巣を提供する親切 UNESP-FCAV で犬の滅菌プログラムを認めます。この作品は、FAPESP (プロセス号 2013/14293-0) と岬からの補助金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS  Thermo Fisher 14190144
Collagenase I Thermo Fisher 17100017
Tissue flask Corning CLS3056
DMEM low glucose Thermo Fisher 11054020
FBS Thermo Fisher 12484-010
TrypLE express Thermo Fisher 12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit StemCell 5110
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15070063
CD45 AbD Serotec MCA 2035S
CD34 AbD Serotec MCA 2411GA
CD90 AbD Serotec MCA 1036G
CD44 AbD Serotec MCA 1041
Nestin Milipore MAB353
β-Tubulin  Milipore MAB1637
DDX4 Invitrogen PA5 -23378
IgG- FITC AbD Serotec STAR80F
IgG- FITC AbD Serotec STAR120F

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References

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導出とイヌの卵巣間葉系幹細胞の分化
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Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).More

Hill, A. B. T., Hill, J. E. B. T., Bressan, F. F., Miglino, M. A., Garcia, J. M. Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (142), e58163, doi:10.3791/58163 (2018).

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