Summary
Здесь мы описываем метод для изоляции, расширения и дифференцирования мезенхимальных стволовых клеток из собачьего тканей яичника.
Abstract
За последнее десятилетие из-за их легкости изоляции, расширения и культуры возрос интерес к мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Недавно исследования продемонстрировали способность широкий дифференциации, что эти клетки обладают. Яичника представляет перспективный кандидат для терапии на базе ячеек с тем, что он богат MSCs, и что он часто удаляются после овариоэктомии операций как биологические отходы. Эта статья описывает процедуры для изоляции, расширение, и дифференцировки МСК, полученных от собак яичника, без необходимости сортировки клеток методики. Этот протокол является важным инструментом для регенеративной медицины из-за широкой применимости этих крайне дифференцируемая клеток в клинических испытаниях и лечебных целях.
Introduction
Число опубликованных исследований, которые сосредоточиться на стволовые клетки значительно увеличился за последнее десятилетие, исследования, который был вызван коллективной цели обнаружения мощный регенеративной медицины терапии. Стволовые клетки имеют два основных определяющих маркеры: self - ремонт и дифференциации. Мезенхимальные стволовые клетки отвечают за оборот обычных тканей и имеют более ограниченные возможности дифференциации по сравнению с1эмбриональных стволовых клеток. Недавно многие исследования показали широкий спектр дифференциации MSCs, и предметом обсуждения является вопрос о том, существуют ли различия между эмбриональных и взрослых стволовых клеток на все2.
Поверхности эпителия яичника является незафиксированных слой клеток, относительно менее продифференцировано, который выражает как маркеры эпителия и мезенхимальных3, сохраняя способность дифференцироваться в различные типы клеток в ответ на Экологические сигналы4. Точное местоположение стволовых клеток в яичниках не хорошо известна; Однако было предложено, что родоначальниками bipotential в белочной порождают клетки семенозачатка5. Иммунологические исследования предположил, что эти клетки имеют стромальные происхождения6 или расположены в или проксимальной поверхности яичников7. Так как мезенхимальных стволовых клеток выразить множество рецепторов, которые играют важную роль в ячейке сцепления8, эксперимент был разработан для проверки гипотезы, что выбор популяция клеток с Быстрое сцепление будет изолировать население клеток четко characterizable как мезенхимальных в природе. Недавно наша группа сообщила дифференцирование MSCs из тканей яичника, основанные на их способности адгезии к поверхности пластика культуры блюдо в течение первых 3 ч культуры, с целью получения очищенного населения экспонируется Быстрое сцепление9клеток. Здесь мы описываем разработанный метод для изоляции мезенхимальных стволовых клеток из тканей яичника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот эксперимент проводился с яичниками четырех беспородных суки, пожертвовал после плановой операции в программу стерилизации собак. Этот эксперимент был одобрен Комитет по этике использования животных UNESP-FCAV (протокол № 026991/13).
1. Экспериментальная подготовка
- Подготовка или приобрести 500 мл стерильного Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) без кальция или магния.
- Подготовить коллагеназы я складе решение путем смешивания 40 мкг фермента в 1 мл DPBS. Фильтр с помощью фильтра шприц 0,2 мкм и хранить 2 мл аликвоты при-20 ° C.
- Подготовьте культуры СМИ от Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) низкий глюкозы с плода сыворотки 10% и 1% антибиотиков.
- Собирать стерильных материалов: ножницы, щипцы, культуры ткани колбу, блюда, трубки и 10 мл и 5 мл пипетки.
- Используйте стандартные ячейки культуры лабораторное оборудование: биологической безопасности кабинета (BSC), клетки культуры инкубатор на 5% CO2 и 38 ° C и центрифуги.
- Очистить BSC: в перчатках, стерилизовать его с 70% EtOH, используя УФ лампы.
2. изоляция мезенхимальных стволовых клеток из яичника
- После операции Держите яичников в PBS на льду в конической трубки, до их прибытия в лаборатории.
- Заполните две чашки Петри 100 мм с 10 мл ФСБ.
- Удаление яичников из трубки и передавать их на первый Петри с PBS. Мыть их с смешивания движений.
- Аккуратно извлечь завязи и поместить его в другое блюдо. С стерильным пинцетом и ножницы фарш ткани на очень мелкие кусочки, размером около 1 мм.
- Передача тканей яичника до 35 мм Петри и добавить 2 мл коллагеназы. Фарш ткани немного больше.
- Петри в инкубатор в 38 ° C на 3 h и осторожно встряхивайте Петри с круговыми движениями каждые 20 мин.
- После 3 h удалите Петри блюдо из инкубатора.
- Передавать содержимое блюдо 15 мл. Добавьте 5 мл расширения средств массовой информации.
- Аккуратно Переверните трубку перед центрифугированием. Центрифуга трубки на 2100 x g 7 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 3 мл расширения средств массовой информации.
- Передать гранулы T25 бутылку. Поместите бутылку в инкубаторе с 5% CO2 в 38 ° C в течение 3 ч.
Примечание: Наиболее важной частью процедуры является изменение средств массовой информации через 3 ч инкубации. - Удалите из инкубатора бутылку и СМИ с оставшейся ткани. Добавьте 3 мл свежего расширения средств массовой информации к бутылке.
- Измените СМИ каждые 48 ч и наблюдать за бутылку для сотовых слияния.
Примечание: Основные этапы процедуры можно наблюдать на рисунке 1.
3. расширение мезенхимальных стволовых клеток из яичника
-
Проход ячейки
- Когда клетки достигают слияния, удалите медиафайл из бутылки.
- Вымойте бутылку с 3 мл ФСБ. Удаление PBS.
- Добавьте 1,5 мл трипсина и поставить бутылки в инкубатор в 38 ° C на 3 мин осторожно коснитесь бутылку, чтобы помочь клетки для отсоединения.
Примечание: Клетки должны достичь слияния примерно 5 - 7 d после первоначального покрытия. - Добавить 3 мл расширения средств массовой информации и передача содержимого в коническую пробирку.
- Центрифуга трубки на 2100 x g 7 мин удалить супернатант и добавьте 1 mL расширения средств массовой информации.
- Аккуратно гомогенизировать содержимое трубки.
- Возьмите Алиготе 10 мкл пример для выполнения клеток подсчета и положил трубку с клетки обратно в инкубаторе.
- Место 10 мкл смеси в Горяева.
-
Подсчет ячеек
- Использовать цель 10 X микроскопом и сосредоточиться на линии сетки Горяева.
- Подсчитать ячейки в пяти небольших площадей (рис. 2).
- Подсчитано число умножьте на 50000, чтобы оценить количество клеток на миллилитр.
4. дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток из яичника
Примечание: Дифференциация анализов были исполнены в соответствии с руководящими принципами, установленными в Хилл и др. 9.
- Семя 1.0 x 104 клетки на колодец, в трех экземплярах, с использованием 4-ну культуры блюдо.
- Добавьте 1 mL расширения средств массовой информации.
- Аккуратно агитируйте блюдо с круговыми движениями.
- После 24 часов замените СМИ желательно дифференциация культуры средств массовой информации.
- Для остеогенные, адипогенном и хондрогенном дифференцировки, инкубации клеток с индукции СМИ для 30 d, с заменой средств массовой информации были использованы каждые 3 d. конкретные дифференциация комплекты для каждого из этих анализов.
- Для дифференциации нейрогенный линии инкубации клеток для 10 d в индукции СМИ, СМИ Замена каждые 3 d. Средства массовой информации, используемые здесь содержится DMEM низкий глюкозы, 2 мм вальпроевая кислота, гидрокортизон 1 мкм, 10 мкм форсколин, калия хлорида 5 мм, 5 мкг/мл инсулина и 200 мкм бутилированный hydroxyanisole.
- Эндодермы прекурсоров Проинкубируйте 5 d в средствах массовой информации энтодермы согласно указаниям производителя реагента.
- Для дифференциации первичных зародышевых клеток линии инкубации клеток в индукции СМИ для 14 d, с заменой каждые 3 d СМИ. Средства массовой информации, используемые здесь содержится DMEM, 10% FBS, пируват натрия 1 мм, 10 нг/мл LIF, заменимые аминокислоты 1 мм, 2 мм L-глютамина, 5 мкг/мл инсулин, β-меркаптоэтанол 0,1 мм, 60 мкм путресцин, трансферрин 20 мкг/мл, 10 нг/мл мыши эпидермального фактора роста, 1 нг/мл человека Основные фибробластический фактор роста, 40 нг/мл человека глиальных клеток линии нейротрофического фактора и пенициллин 15 мг/Л.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изоляция мезенхимальных стволовых клеток из собачьего яичника:
Яичников процедура изоляции MSC приводится на рисунке 1. После хирургии, измельчения тканей, коллагеназа пищеварение и средства массовой информации изменения 3 ч после начала культуры предполагаемый MSC населения с быстрым свойства пластика клей был успешно изолирован от собак тканей яичника. Заготовленной клетки быстро придерживаться пластиковую поверхность культуры блюдо и переросли в морфологически однородной монослойном культивировании с типичными MSC-как морфология (рис. 3).
Характеристика яичников MSC В пробирке
MSC характеристика призвана обеспечить соответствие стандартным критериям MSC изолированных клеток. К ним относятся приверженность пластика, позитивные обнаружения мезенхимальных поверхностных маркеров и отсутствие гемопоэтических поверхностных маркеров, а также способность пройти mesodermal дифференцировки.
Как показано на рисунке 3, яичников производные клетки были приверженцами пластик и выставлены фибробластоподобных морфологии, выполняя первый критерий, определяющий MSCs. Кроме того изолированных клеток показали выражение стенограммы для собак MSC маркеры, CD44, CD90 и CD105. Кроме того были обнаружены клетки MSC-специфических поверхностных антигенов CD90 и CD44 ранний анализ СУИМ проход и иммуноцитохимии. Отсутствие маркеров CD45 и CD34, являющиеся поверхностных антигенов клеток кроветворных конкретных, было также подтверждено те же методы (рис. 4). Это далее подтвердил, что Завязь содержит клетки, выражая MSC-конкретных фенотип9. Антитела, которые были использованы в этом эксперименте для собак MSC характеристика перечислены в Таблица материалов.
Следующий шаг в характеристике MSCs должна достичь доказательством их способности дифференцироваться в mesodermal линий. После 30 дней культуры в дифференциации линии конкретных протоколов и экспозиции окрашивание была исполнена определить приверженность различных линий (Рисунок 5A). Приверженность линии Остеогенные было подтверждено через Kossa фон окраски, которые определены отложения кальция. Safranin O протеогликана пятнать подтвердил приверженность хондрогенном, и масло красный O липидов пятнать подтвердили приверженность адипогенном. Продолжая исследования дифференцируемость этих клеток, они смогли проходят дифференцировку в ectodermic линии, как показано на иммуноокрашивания для двух маркеры стволовых клеток нейроэктодермальная: β-тубулина и Nestin, после облучения Яичники производные MSCs нейронные lineage дифференциации протокола на 10 дней (рис. 5 c). Стенограммы для SOX17 и CD184, а также относящиеся к линии эндодермы клеток морфологии наблюдались после воздействия конкретных дифференциация протоколов на 5 дней (Рисунок 5B). Наконец, после 14 дней пребывания яичников производные MSCs, зародышевых клеток индукции СМИ, 4 октября и DDX4 были определены (рис. 5 d). Вместе эти результаты поддерживают надежные и разнообразных возможностей дифференциации для MSCs, полученных из тканей яичника, когда подвергаются конкретные дифференциация протоколы9.
Рисунок 1 : Основные этапы процедуры изоляции. (1) после операции передачи яичников в стерильные пробирки с PBS, на льду. (2) для того чтобы помыть яичников, они должны переводиться в 100 мм пластины с PBS. (3) фарш ткани на мелкие кусочки, размером около 1 мм. (4) для того чтобы освободить клетки из ткани, кусочки ткани передавать 35 мм пластин и добавить коллагеназы для переваривания 3 h в инкубаторе. (5) передавать содержимое пластины Конические трубки для центрифугирования. (6) пластины Пелле в бутылке T25 и Инкубируйте 3 ч (7) после первого 3 h культуры, изменения культуры средств массовой информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Горяева. Пять небольших квадратов быть подсчитанным отмечены красным цветом.
Рисунок 3 : Сотовый морфология. Когда средства массовой информации была изменена 3 ч после начала культуры в результате однородность населения мезенхимальных клеток, которые выставлены фибробластоподобных морфологии. Напротив когда первая смена СМИ делается после 48 ч другие типы клеток, помимо фибробластоподобных клеток может наблюдаться. В баре шкалы = 1000 мкм. Этот показатель был изменен с холма и др. 9. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Молекулярные профиль яичников MSC. (A) изолированных клеток выставлены классический профиль маркера MSC, будучи положительным для трех MSC маркеров в реальном масштабе времени PCR (CD90, CD105 и CD44). (B) путем анализа белка, CD44 был положительным в этих клетках, и им не хватало выражение две кроветворные маркеров (CD34 и CD45). В баре шкалы = 70 мкм. Этот показатель был изменен с холма и др. 9. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Дифференциация яичников MSC. Изолированные клетки были способны дифференцироваться в (A) mesodermal линий (хондрогенном, остеогенные и адипогенном; линейки шкалы = 70 мкм). Кроме того, клетки были способны дифференцироваться в обоих прекурсоров эндодермы (B) (шкалы бар = 70 мкм) и (C) неврогенный линий (шкалы бар = 50 мкм). Интересно, что клетки прошли дифференциации первичных зародышевых клеток (D), демонстрируя широкий потенциал дифференциации яичников мезенхимальных стволовых клеток. Этот показатель был изменен с холма и др. 9. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предоставляем доказательства того, что MSCs могут быть изолированы от собак тканей яичника, которая считается биологические отходы после овариоэктомии. С тем, что многие типы клеток можно найти в яичнике, мы предложили протокол для выбора MSCs, основанные на их быстрое присоединение к пластика, который успешно выбран в монослое с морфологией фибробластоподобных клеток, которые росли.
Первый доклад о выводе MSCs из костного была основана на пластиковых адгезии способность MSCs в течение первых 48 часов11культуры; Однако сообщалось, что этот метод имеет потенциал, чтобы изолировать гетерогенной популяции, фенотипически и функционально, по крайней мере для костного12. Метод предлагаемого культуры также выбирает клетки емкости пластиковые адгезии и изолирует Мезенхимальные клетки из ткани, которая имеет много типов клеток, без необходимости сортировки желательно клетки. С тем, что мезенхимальных стволовых клеток выразить множество рецепторов, которые играют важную роль в ячейке сцепления8, он был предположил, что если популяция клеток с быстрым адгезии были выбраны, это приведет к более однородной населения в первый проход, с профилем надежный MSC. Представитель результаты обеспечивают доказательства, что короче продолжительность пластиковые адгезии пробирного могут использоваться для изоляции морфологически однородное население MSCs на первый проход, без необходимости ждать для более продвинутых проходы или ячейку Сортировка.
Важнейшим шагом в этом протоколе является изменить СМИ 3 ч после начала культуры. Как показано в разделе представитель результаты, стволовые клетки, полученные из собачьего яичников встречался трем критериям, установленным для характеризации MSCs: они выставлены фибробластоподобных морфологии, оказались позитивными на присутствие MSC маркеров и были способны дифференцироваться в такой мезенхимальных линий как остеогенные, адипогенном и хондрогенном родов. Клетки, изолированных в этом эксперименте были также успешно продифференцировано эндодермы прекурсоров, эктодермы линий и линий первичных зародышевых клеток. Клетки должны достичь слияния приблизительно 5-7 дней после первоначального покрытия. Клетки от животных с возрастом может расти более медленными темпами, чем у молодых животных, и тех, меньше клетки могут придерживаться пластика. В этих случаях концентрация FBS в средства массовой информации может быть увеличена до 15%.
Таким образом выбор для MSCs, основанный на клетки мощностью более быстрое присоединение представляет недорогой, упорядоченную и эффективную процедуру. С терапевтической точки зрения наиболее важно подчеркнуть, что эти клетки являются перспективным инструментом для регенеративной медицины, особенно ввиду их широкий спектр дифференциации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают программу стерилизации собак в UNESP-FCAV за любезно предоставление яичников. Эта работа была поддержана грантов от FAPESP (процесс № 2013/14293-0) и МЫСОВ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Collagenase I | Thermo Fisher | 17100017 | |
| Tissue flask | Corning | CLS3056 | |
| DMEM low glucose | Thermo Fisher | 11054020 | |
| FBS | Thermo Fisher | 12484-010 | |
| TrypLE express | Thermo Fisher | 12604021 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher | A1007201 | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Kit | StemCell | 5110 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15070063 | |
| CD45 | AbD Serotec | MCA 2035S | |
| CD34 | AbD Serotec | MCA 2411GA | |
| CD90 | AbD Serotec | MCA 1036G | |
| CD44 | AbD Serotec | MCA 1041 | |
| Nestin | Milipore | MAB353 | |
| β-Tubulin | Milipore | MAB1637 | |
| DDX4 | Invitrogen | PA5 -23378 | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR80F | |
| IgG- FITC | AbD Serotec | STAR120F |
References
- Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).
- Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
- Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
- Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).
- Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
- Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145 (2004).
- Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
- Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).
- Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
- Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
- Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).
