Summary
Forbigående Heterolog ekspression af biosyntetiske enzymer i Nicotiana benthamiana blade kan aflede endogene forsyninger af 2,3-oxidosqualene mod produktion af nye værdifulde triterpene produkter. Heri er beskrevet en detaljeret protokol for hurtig (5 dage) præparativ-skala produktion af Triterpener og analoger udnytte denne kraftfulde plante-baserede platform.
Abstract
Triterpener er en af de største og mest strukturelt forskellige familier af naturlige planteprodukter. Mange triterpene derivater har vist sig at besidde medicinsk relevante biologiske aktivitet. Dog er hidtil dette potentiale ikke oversat til et utal af triterpen-afledte narkotika i klinikken. Dette er velsagtens (i det mindste delvis) en konsekvens af begrænset praktisk syntetiske adgang til denne klasse af sammensatte, et problem, der kan kvæle udforskning af struktur-aktivitet relationer og udvikling af føre kandidater af traditionelle lægemidler kemi arbejdsprocesser. Trods deres enorme mangfoldighed, Triterpener er alle udledt fra en enkelt lineær forløber, 2,3-oxidosqualene. Forbigående Heterolog ekspression af biosyntetiske enzymer i N. benthamiana kan aflede endogene forsyninger af 2,3-oxidosqualene mod produktion af nye værdifulde triterpene produkter, der ikke naturligt produceret af denne vært. Agro-infiltration er en effektiv og enkel middel forbigående udtryk i N. benthamiana. Processen indebærer infiltration af plante blade med en suspension af Agrobacterium tumefaciens transporterer udtryk construct(s) af interesse. Co infiltration af en yderligere A. tumefaciens stamme bærer et udtryk konstruere kodning et enzym, der øger forløber udbud væsentligt øger udbyttet. Efter en periode på fem dage, kan infiltreret blad materialet høstet og forarbejdet til at udtrække og isolere den resulterende triterpene produkt(er). Dette er en proces, der er lineært og pålideligt skalerbare, simpelthen ved at øge antallet af planter, som anvendes i forsøget. Heri er beskrevet en protokol for hurtig præparativ-skala produktion af Triterpener udnytter denne plante-baserede platform. Protokollen benytter et nemt replikerbar vakuum infiltration apparat, som giver mulighed for samtidige infiltration af op til fire planter, aktivering af batch-wise infiltration af hundredvis af planter i en kort periode.
Introduction
Triterpener er en af de største og mest strukturelt forskellige familier af naturlige planteprodukter. Trods deres enorme mangfoldighed, er alle triterpene naturprodukter menes at være afledt af den samme lineære forløber 2,3-oxidosqualene, et produkt af den mevalonsyre pathway i planter. Cyclization af 2,3-oxidosqualene er indledt og kontrolleret af en familie af enzymer, der betegnes som oxidosqualene cyclases (OSCs). Denne cyclization skridt repræsenterer det første niveau af diversificering, med hundredvis af forskellige triterpene stilladser har været rapporteret fra naturen1. Disse stilladser er yderligere diversificeret ved at skræddersy enzymer, herunder, men ikke begrænset til, cytokrom p450s (CYP450s)1,2. Sådanne biosyntetiske veje kan føre til enorme kompleksitet, undertiden resulterer i færdige produkter, som er næppe genkendelige fra overordnede triterpene. For eksempel, menes den komplekse struktur af den potent insektbekæmpelsesmidler og antifeedant limonoid azadirachtin at stamme fra en tetracykliske triterpene af tirucallane type3.
Mange triterpene-afledt naturlige produkter, selv dem med forholdsvis uændrede overordnede stilladser, har vist sig at besidde medicinsk relevante biologiske aktivitet4,5,6,7. Dog er hidtil dette potentiale ikke oversat til et utal af triterpen-afledte narkotika i klinikken. Dette er velsagtens (i det mindste delvis) en konsekvens af begrænset praktisk syntetiske adgang til denne klasse af sammensatte, et problem, der kan kvæle udforskning af struktur-aktivitet relationer og udvikling af føre kandidater af traditionelle lægemidler kemi arbejdsprocesser.
Forbigående udtryk af triterpen biosyntetiske enzymer fra andre plantearter i N. benthamiana blade kan aflede endogene forsyninger af 2,3-oxidosqualene mod produktion af nye værdifulde triterpene produkter (figur 1). Denne proces kan bruges til funktionelt karakterisere kandidat enzymer og rekonstruere de biosyntetiske veje af vigtige naturligt forekommende metabolitter. Ligeledes, det kan også udnyttes i kombinatorisk biosyntetiske tilgange til at producere roman triterpene produkter, en strategi, der kan resultere i biblioteker af strukturelt relaterede analoger, gør det muligt systematisk udforskning af struktur-aktivitet relationer biologisk aktive bly forbindelser8,9.
Agroinfiltration er en effektiv og enkel måde at opnå forbigående udtryk i N. benthamiana blade. Processen indebærer infiltration af blade med en suspension af A. tumefaciens transporterer binære udtryk construct(s) af interesse. Dette opnås via anvendelsen af pres, der tvinger væske gennem spalteåbninger, fortrænger luft i intercellulære rum, og erstatte det med A. tumefaciens suspension. Bakterierne overføre de respektive T-DNAs til indre af planteceller, medførende lokal og forbigående protein udtryk i infiltreret blad væv.
Mens nogen binære vektor egnet til generering af transgene planter kan være ansat for forbigående udtryk, vi udnytte den Cowpea mosaik Virus CPMV-afledte Hypertranslational (HT) protein udtryk system10, 11. i dette system gen af interesse er flankeret af utranslaterede regioner (UTR) fra CPMV RNA-2. 5'-UTR indeholder ændringer resulterer i meget høje niveauer af protein oversættelse med nogen afhængighed af virusreplikation12. Denne teknik er blevet udviklet i Easy-og hurtig (pEAQ) binære vektor serien, som indeholder lokationsspecifikke rekombination kloning protokol-kompatible konstruktioner (pEAQ -HT- DEST)10,11. De fleste pEAQ vektorer også indeholde en tomat busket stunt virus-afledte P19 silencing suppressor gen13 inden for T-DNA del af udtrykket kassette, der omgår behovet for at coinfiltrate en separat P19-regnskabsmæssige stamme og giver meget højt protein udtryk i værten plante celle10,11.
Brug af N. benthamiana som et udtryk vært har særlige fordele, når du arbejder med anlæg biosyntetiske veje. Celle-arkitekturen understøtter uløseligt passende mRNA og protein behandling og ordentlig opdelingen, ud over at have de nødvendige Co enzymer, reductases (for CYP450s) og metaboliske prækursorer. Carbon kilde er fotosyntese; planter kan således blot dyrkes i kompost af god kvalitet, der kræver kun vand, CO2 (fra luften) og sollys som input. Platformen er også meget bekvemt for Co udtryk for forskellige kombinationer af proteiner, som dette kan opnås facilely af co infiltration af forskellige stammer af A. tumefaciens, bevirke, at behovet at bygge store multigene udtryk kassetter. Derudover kan processen være lineært og pålideligt skaleret blot ved at øge antallet af planter, som anvendes i forsøget.
Tidligere arbejde i vores laboratorium har vist nytten af denne platform for forberedende skala eksperimenter. Dette omfattede udarbejdelse af roman Triterpener til brug i bioactivity assays og skala op for at opnå gram mængder af isolerede produkt. Desuden ophobning af heterogene triterpene produkter kan være steget flere fold af co udtryk af en N-terminal-afkortet, feedback-ufølsom form af 3-hydroxy, 3-methyglutary-coenzym en reduktase (tHMGR), en trafikhastighedsbegrænsning opstrøms enzym i mevalonsyre vej8.
Nøglen til sådanne præparativ-skala eksperimenter er evnen til at bekvemt op-skala infiltration proces. I en typisk eksperiment, kan snesevis til hundredvis af planter være nødvendigt at nå målet antallet af isolerede produkt. Infiltrerer enkelte blade i hånden (ved hjælp af et unødvendigt sprøjte) er driftsmæssigt krævende, og ofte uoverkommeligt tidskrævende, rendering denne metode upraktisk for rutinemæssig skala-up. Vakuum infiltration tilbyder fordele over hånd infiltration, som det er ikke afhængige af færdighedsniveau for operatøren og tillader infiltration af et større område af bladets overflade. Denne procedure bruges kommercielt til storproduktion af farmaceutiske proteiner14. Denne protokol udnytter en let replikerbar vakuum infiltration apparater, som kan være fremstillet af kommercielt tilgængelige dele. Dette giver mulighed for samtidige infiltration af op til 4 planter, giver hurtig og praktisk batch-wise infiltration af hundredvis af planter i en kort periode (figur 2a -2b). Vakuum infiltration apparatet består af et vakuum ovn, der danner infiltration kammer (figur 2f). Ovnen er forbundet til pumpen via en vakuum reservoir. Dette reducerer tidsforbruget til at opnå den ønskede vakuum i salen, infiltration. Planter er sikret i en skræddersyet indehaveren og omvendt i en 10 L rustfrit stål vandbad fyldt med A. tumefaciens suspension (figur 2a -2 c). Fuldstændig nedsænkning af de antenne dele af planterne er vigtige for effektiv infiltration. Vandbadet derefter placeres inden for infiltration kammer (figur 2d -2e), og det tomrum, som anvendes til at trække luften ud af blad interstitielle rum. Når trykket er blevet reduceret med 880 mbar (en proces, som tager ca. 1 min.) infiltration kammer bragte hurtigt tilbage til atmosfærisk tryk over 20-30 s ved at åbne indsugningsventilen ovn, hvorefter infiltration er fuldført.
Fem dage efter infiltration er af plantemateriale klar til høst og efterfølgende ekstraktion og isolation af de ønskede produkt(er). Fra dette punkt er processen blot en af naturprodukt ekstraktion og oprensning fra blad materiale, en arbejdsproces, der er velkendt for enhver naturprodukt kemiker. Der findes mange forskellige metoder til indledende ekstraktion og efterfølgende rensning15. Det mest hensigtsmæssige valg af metoder og de nøjagtige betingelser anvendes er stærkt afhængige af særlige kemiske egenskaber af sammensat af interesse, ud over tilgængeligheden af færdigheder og/eller udstyr. Det er ikke muligt at medtage i denne protokol et fuldt generaliserbart, trinvis metode til downstream behandling af høstede blad plantemateriale til enkeltstående produkt, der kunne følges blindt for enhver triterpene produkt af interesse, eller ville det være Det er hensigtsmæssigt for at forsøge at gøre dette. Men denne protokol vil give et overblik over den grundlæggende arbejdsgang bruges i vores laboratorium og nogle metoder for de tidlige faser af processen, som i vores erfaring har vist sig generaliserbart for mest iltet aglycone triterpene produkter. Dette omfatter to relativt ualmindeligt teknikker, nemlig trykbaerende opløsningsmiddel udvinding (PSE), og en praktisk heterogene fase metode for klorofyl fjernelse ved hjælp af en stærkt basisk ionbytter.
PSE er en yderst effektiv teknik til udvinding af små organiske molekyler fra faste matricer. Ekstraktioner udføres under pres (ca. 100-200 bar), den største fordel er evnen til at bruge afhjælpes temperaturer, som overstiger den kogende punkt af ekstraktionsmidlet. Dette kan reducere den tid og mængde opløsningsmiddel, der kræves for at opnå en udtømmende udvinding, sammenlignet med andre hot opløsningsmiddel teknikker som simple refluxerende eller Soxhlet ekstraktioner16. Kommercielle bænk-top PSE instrumenter er tilgængelige, som udnytter udskiftelige udvinding celler og automatiseret opløsningsmiddel håndtering, opvarmning og overvågning. Dette gør denne teknik yderst bekvemt. Det er også velsagtens mindre farlige, især for operatører med begrænset praktisk kemi erfaring.
Forsæbning af rå blad ekstrakter under refluks efterfulgt af væske-væske partitionering er en almindelig teknik til bulk fjernelse af klorofylfarvestoffer før efterfølgende rensning eller analyse. Men dette kan ofte være operationelt krævende på større skalaer. Endvidere kan påvisning af grænseflade eller produkt tab på grund af dannelsen af emulsioner være problematisk. Brug af stærkt basisk ionbyttende harpikser til at udføre heterogene fase hydrolyse kan tjene som et bekvemt alternativ. Den pigmenterede del af hydrolyseret klorofyl forbliver overholdt til harpiks og blot kan fjernes ved filtrering. Denne protokol udnytter en forberedende skala tilpasning af en tidligere rapporteret analytiske procedure17 , der beskæftiger en kommercielt tilgængelig grundlæggende ionbytteren.
Nedenfor beskriver vi en detaljeret og hurtige protokol for forberedende skala produktion af Triterpener udnytter denne plante-baserede platform. Denne protokol anvendes rutinemæssigt i vores laboratorium til at forberede snesevis til hundredvis af isolerede triterpene produkt mg for programmer sådan en strukturel karakterisering af Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, og/eller yderligere undersøgelse i funktionelle assays.
Protocol
Bemærk: Før du følger denne protokol, blive fortrolig med det materiale sikkerhedsdatablad for alle stoffer, der anvendes, og træffe passende sikkerhedsforanstaltninger. Dette omfatter, men er ikke begrænset til: bære sikkerhedsbriller, når du arbejder med glas under vakuum og håndtering af tørre silicagel i et stinkskab. Det er også afgørende, at lokale lovgivning vedrørende arbejde med genetisk modificeret materiale er tjekket og observeret, herunder følgende passende indeslutning procedurer.
1. generere A. tumefaciens stammer for Infiltration
Bemærk: Vi giver her en forenklet beskrivelse af de foranstaltninger til at generere egnet A. tumefaciens stammer for forbigående udtryk. Yderligere oplysninger om denne fremgangsmåde er beskrevet af Sainsbury et al. 8.
- Forstærke ved PCR eller syntetisere protein kodende region af genet interesse flankeret af 5' og 3' attB sekvenser egnet til generering af klon en post til brug med en lokationsspecifik rekombination kloning protokol18,19.
- Brug fremad primer: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, omvendt primer: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN... = sekvens bestemt sekvens).
- Bruge (repræsentant) PCR betingelser: reaktion blanding (25 µL, samlede) buffer (5 x, 5 µL, se Tabel af materialer), dNTP'er (10 mM, 0,5 µL), fremad primer (10 µM, 1,25 µL), omvendt primer (10 µM, 1,25 µL), skabelon DNA (variabel koncentration, 50-250 ng, 0,5 µL ), DNA polymerase (2000 U/mL, 0,25 µL, se Tabel af materialer), nukleasen-gratis vand (til 25 µL). Opstille thermocycler som følger: indledende denaturering (98 ° C, 30 s); Start cyklus (98 ° C, 30 s; 45 – 72 ° C, 20 s; 72 ° C, 30 s/kb) ende cyklus; 35 cykler; endelige udvidelse (72 ° C, 10 min).
- Følg en standard lokationsspecifikke rekombination kloning protokol18,19 til at generere en post klon ved hjælp af enhver ikke-kanamycin-baseret post vektor (vi bruger pDONR207, som er kommercielt tilgængelige).
Bemærk: Posten klon integritet bør bekræftes ved sekventering, før du bruger til at generere pEAQ -HT-DEST1 udtryk konstruktion. PEAQ -HT-DEST1 er tilgængelig på anmodning fra Lomonossoff laboratoriet ved John Innes Centre i Norwich, Storbritannien. - Isolere pEAQ -HT-DEST1 vektor fra udtryk klon genereret i trin 1.1.3, og opbevares ved-20 ° C før brug i trin 1.3.
Bemærk: Enhver kommercielt tilgængelige praktisk spin kolonne-baserede plasmid rensning kit designet til at udtrække plasmider fra kloning stammer af E. coli er egnet. Følg instruktionerne for valgte plasmid rensning kit (Se Tabel af materialer).
- Forberede transformation kemisk kompetente A. tumefaciens .
- Podes en selektiv LB (Luria-Bertani medium: 10 g/L bacto-trypton, 10 g/L NaCl og 5 g/L gærekstrakt, agar 10 g/L pH 7,0) agar plade (50 μg/mL rifampicin, 100 μg/mL streptomycin), af striber A. tumefaciens LBA4404 fra en glycerol stamkultur. Der inkuberes natten over ved 28 ° C i en stående inkubator.
- Podes 50 mL af selektiv flydende LB medier (50 μg/mL rifampicin, 100 μg/mL streptomycin) med en prøve af A. tumefaciens LBA4404 celler fra trin 1.2.1. Der inkuberes natten over ved 28 ° C i en rystende inkubator ved 200 rpm.
- Cool kultur fra trin 1.2.2 i isbad i 10 min og derefter pellet A. tumefaciens celler ved centrifugering ved 4 ° C og 4500 x g i 5 min (kassere supernatanten).
- Resuspenderes fra trin 1.2.3 i 1 mL iskold 20 mM vandig CaCl2 opløsning og Gentag trinnet centrifugering fra trin 1.2.3 (kassere supernatanten).
- Resuspenderes fra trin 1.2.4 i 1 mL iskold 20 mM vandig CaCl2 opløsning og prøve den resulterende suspension i 50 µL partier. Flash fryse delprøver i flydende N2 og opbevares ved-80 ° C før anvendelsen.
- Omdanne den forberedte A. tumefaciens LBA4404 med isolerede pEAQ -HT-DEST1 vektor genereret i trin 1.2.
- Tø 50 µL af A. tumefaciens suspension genereret i trin 1.2 på is, og der inkuberes med 100 \u2012 200 ng af isolerede pEAQ -HT-DEST1 vektor, genereret trin 1.1, ved 0 ° C i 5 min.
- Cold stød rugede suspension fra trin 1.3.1 i flydende N2 til 30 s, derefter tillade for at varme til stuetemperatur.
- Tilføje 200 μl af SOC medium (SOC: 20 g/L bacto-trypton, 5 g/L gær extract, 0.58 g/L NaCl, 0,19 g/L KCl, 2.03 g/L MgCl2, 2,46 g/L magnesium sulfat 7-hydrat, 3,6 g/L glukose) til kold chokeret suspension fra trin 1.3.2 og Inkuber i 4 timer ved 28 ° C i en rystende inkubator ved 200 rpm.
- Podes en selektiv LB-agar plade (50 μg/mL rifampicin, 50 μg/mL kanamycin, 100 μg/mL streptomycin) med SOC kulturen fra trin 1.3.3. Spredes grundigt, og der inkuberes i 3 dage ved 28 ° C i en stående inkubator.
- Podes 5 mL af selektiv LB medier (50 μg/mL rifampicin, 50 μg/mL kanamycin, 100 μg/mL streptomycin) med en enkelt koloni fra trin 1.3.4. Der inkuberes natten over ved 28 ° C i en rystende inkubator ved 200 rpm.
- Tilføje 200 μl af glycerol til 1 mL af den flydende kultur fra trin 1.3.5, blandes grundigt og opbevares ved-80 ° C.
Bemærk: Denne kultur kan blive genoplivet for fremtidige eksperimenter af striber på LB agar plader med passende antibiotika (beskrevet nedenfor).
2. klargør Infiltration Suspension
- Podes en selektiv LB agar plade med striber af den ønskede A. tumefaciens stammer fra glycerol lagerfører kulturer genereret i trin 1. Der inkuberes natten over ved 28 ° C i en stående inkubator.
Bemærk: En stamme, der bærer tHMGR inden for en pEAQ -HT-DEST1 vektor kan også medtages.- Individuelt podes 50 mL af selektiv LB medier med en prøve af hver A. tumefaciens stamme vokset i trin 2.1 og inkuberes natten over ved 28 ° C i en rystende inkubator ved 200 rpm.
- Individuelt overføres 50 mL kulturer fra trin 2.1.1 til 1000 mL af selektiv LB medier (rifampicin 50 μg/mL, kanamycin, 50 μg/mL streptomycin 100 μg/mL) og der inkuberes natten over ved 28 ° C i en rystende inkubator ved 200 rpm.
- Individuelt pellet A. tumefaciens ved centrifugering (4000 x g), fra de flydende kulturer genereret i trin 2.1.2 (kassere supernatanten).
- Individuelt resuspend pellets fra trin 2.1.3 i 50 mL af frisklavede MMA buffer (MMA Buffer: 10 mM 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic syre, pH 5.6 (KOH), 10 mM MgCl2, 150 μM 3'5 '-dimethoxy-4'-acetophenone) og inkuberes ved stuetemperatur i mørket for 1 h.
- Kombiner den passende volumen af hver A. tumefaciens MMA suspension (genereret i trin 2.1.4) til at producere en sidste OD600 på mindst 0,2 for hver stamme i en 10 L samlede endelige rumfang.
- Tilføje yderligere MMA buffer til de kombinerede suspensioner genereret i trin 2.1.5 til en endelige volumen på 1 L (brug straks i trin 3).
Bemærk: Det er tilrådeligt at udarbejde en yderligere 2 L af infiltration suspension for at opretholde den flydende niveau under infiltration proces. - Forberede 1 L 10 x styrke MMA buffer.
3. udføre vakuum Infiltration
Bemærk: Se figur 2 en beskrivelse af vakuum infiltration apparater konstruktion. Brug 5-uge-forhenværende N. benthamiana planter i 9 cm x 9 cm Potter for proceduren trin. Frøplanter bør sås i F1 kompost (f.eks. fra Levington) og dyrkes i 2 uger før overføres til individuelle gryder indeholdende F2 kompost. Planter bør dyrkes i et drivhus ved 25 ° C, med 16 h per dag lys (brug supplerende belysning når påkrævet), vand dagligt, maksimal tæthed af 100 planter/m2.
- Overføre infiltration suspension genereret i trin 2 og 10 x styrke MMA buffer til infiltration bad, efterfulgt af en yderligere 8 L vand 1 L 1 liter.
- Fjerne de aftagelige vinger på skræddersyede anlæg indehaveren, indsætte 4 planter (5 uger gamle planter Se foregående note) og vedhæfte vinger. Invertere indehaveren og Placer den oven på infiltration bad for at dykke blade i infiltration suspension.
Bemærk: Sikre suspension niveau når oversiden af indehaveren af anlægget. Hæve niveauet med tilsætning af ekstra infiltration suspension, hvis det kræves. - Overføre infiltration badet med undersøiske planter til infiltration kammer og luk døren. Sikre luft indtag ventilen er lukket på infiltrator. Tænd vakuumpumpen og åbne inline ventilen til vakuum reservoiret efterfulgt af vakuum indtag ventil på infiltration kammer.
- Når trykket i infiltration kammer er reduceret med 880 mbar, lukke vakuum indtag ventilen, og åbne luft indtag ventil. Når infiltrationen kammer har returneret til atmosfærisk tryk, åbner døren, og fjerne infiltration bad.
- Hæve indehaveren af anlægget, indtil planterne er ikke længere neddykket i infiltration suspension, så Ryst forsigtigt indehaveren til at tillade overskydende suspension at køre off blade tilbage ind i infiltration badet.
- Retur indehaveren til den opretstående stilling, fjerne de aftagelige vinger, og fjerner planterne.
- Gentag trin 3.1.1 til 3.1.5, indtil det ønskede antal planter har været infiltreret.
- Autoklave brugte infiltration suspension inden bortskaffelse.
- Autoklave infiltration bad før genbrug i efterfølgende forsøg.
- Sterilisere indre af infiltration kammer ved rengøring med 70% ethanol og overlade til luft tørre før genbrug i efterfølgende forsøg.
- Fjerne de aftagelige vinger på skræddersyede anlæg indehaveren, indsætte 4 planter (5 uger gamle planter Se foregående note) og vedhæfte vinger. Invertere indehaveren og Placer den oven på infiltration bad for at dykke blade i infiltration suspension.
4. dyrke de infiltreret planter
- Arrangere de infiltreret planter fra trin 3 med en maksimal tæthed på 100 planter/m2 i et drivhus.
- Vokse til 5 dage ved 25 ° C og 16 h per dag af lys (brug supplerende belysning når det er påkrævet) og vand dagligt.
5. høst infiltreret bladene
- Efter 5 dage af vækst, høst bladene.
- Autoklave affald plantemateriale, gryder og jord inden bortskaffelse.
6. tør de høstede blade
Bemærk: Nøjagtige ingot proceduren beskrevet nedenfor afhænger af arten af apparatet tilgængelige ingot tilgængelige.
- Lyophilize høstede bladene indtil tør.
- Placer de høstede blade i en 2 mm tyk polypropylen taske. Fryse de høstede blade af lagring i et-80 ° C fryser i 30 min.
- Perforere tasken med mange små huller ved hjælp af en PIN-kode. Sted de sække frosne blade i det centrale kammer i lyophilizer. Sikre alle kolbe vedhæftet fil vandhaner er lukket og derefter tænde lyophilizer. Sikre kondensatoren når mindst-50 ° C og trykket reduceres til mindst 0,15 mbar, og derefter lade natten over.
- Skifte ud lyophilizer og lufte tomrummet ved at åbne en kolbe vedhæftet fil tap. Fjern de tørrede blade fra den centrale kammer, og Fortsæt til trin 7.
7. Tryk opløsningsmiddelekstraktion
Bemærk: Proceduren trin henvise til brug af et kommercielt tilgængelige PSE instrument (Se Tabel af materialer). Henvises der til producentens litteratur for mere detaljerede oplysninger om operationen. Instrumentet udfører 4 ekstraktioner parallelt.
- Male tørrede blade i en kursus pulver via en praktisk metode (f.eks., for de fleste triterpene forbindelser af interesse bruge en indenlandsk foodprocessor, eller manuelt knuse bladene mens indeholdt i en pose).
Bemærk: Slibning med en pistil og morter under flydende nitrogen er ikke normalt nødvendige.- Bland blad pulver med kvartssand (0,3 \u2012 0,9 mm, 20% efter volumen) i en egnet beholder; Dette fungerer som et dispergens og forbedrer effektiviteten af udpakningsprocessen.
- Forberede fyldet 4 udvinding celler (120 mL). For dette, invertere udvinding cellerne og indsætte glas fiber filter, efterfulgt af metal fritte og holder stik. Returnere udvinding celler til opretstående position og tilføje en 1 cm dybe lag af kvartssand (0,3 \u2012 0,9 mm).
- Udfylde udvinding celler.
- Fyld udvinding celler med rede blad pulver genereret i trin 7.1 op til linjen fyld. Hvis det er nødvendigt, forsigtigt komprimere pulveret under denne proces til at fremme tilføjelsen af en større mængde i hver celle, udvinding.
- Tilføje et lille lag af kvartssand (0,3 \u2012 0,9 mm) til toppen af pakket pulver og Indsæt filteret top cellulose.
- Indsæt pakket udvinding celler i PSE instrument og køre den ønskede metode. Brug følgende indstillinger og materiale; Opløsningsmiddel: 100% ethylacetat; temperatur: 100 ° C, pres: 130 bar. Køre 3 cykler som følger: cykle 1: 0 min hold tid, cyklus 2 og 3: 5 min. hold tid, ender med en 2 min opløsningsmiddel flush, og 12 min nitrogen gas flush.
Bemærk: Det er tilrådeligt at første optimere ekstraktion metode på en lille skala. Følgende metode er imidlertid ofte tilstrækkelig for de fleste oxideret triterpene aglycones. Spiritus fra hver udvinding celle kan kombineres i det samme eksterne collection fartøj ved at angive linjen affald som udvinding destination, i stedet for standard individuelle samling linjer. Vær opmærksom på mængden af opløsningsmidlet anvendes er afhængig af pakning af udvinding celler og den indstillede temperatur og tryk. Ovenstående metode genererer typisk ca. 800 mL udvinding spiritus for 4 parallelle ekstraktioner. - Gentag trin 7,2 til 7.3.3 indtil alle blad pulver er blevet behandlet.
- Koncentrere de kombinerede udvinding spiritus til tørhed, via roterende fordampning under vakuum. Kontrollere, om den forventede output (dvs., mørke grønne gylle).
Bemærk: Den nøjagtige fremgangsmåde kan variere afhængigt af sæt op af den tilgængelige rotationsfordamper. Altid bære øjenbeskyttelse, når du udfører roterende fordampning, og kontrollere glasvarer til skade før udsætter vakuum betingelser.- Tænd chiller recycler, og give varme overførsel væsken afkøle til mindst 5 ° C. Tænd vandbadet, og Indstil temperaturen til 35 ° C.
- Overføre udvinding spiritus til en fordampning kolbe (fyld ikke mere end et halvt bind af kolben). Koncentrere liquor batch-wise (i samme kolben) hvis den samlede mængde overskrider dette. Vedhæfte fyldt fordampning kolben til damp-kanalen af rotationsinddamperen (sikker med en fælles klip).
- Justere kolbe lift position og vinkel, således at dykke bunden tredje af fordampning kolben i et vandbad ved en cirka 45 ° vinkel. Start kolben spinning med en hastighed, der begynder at sprede udvinding liquor op på væggene af kolben.
- Sikre udluftning hanen er lukket og begynde at reducere presset (ved hjælp af controller af vakuumpumpe) indtil en moderat drop er observeret mellem kondensator og modtager kolben.
Bemærk: Tillad ikke udvinding spiritus til begynder at koge. Hvis dette sker, reducere styrken af vakuum til at bringe destillation under kontrol. - Overvåge og justere den vakuum styrke og spin hastighed efter behov, indtil alle opløsningsmidlet er fordampet.
8. grundlæggende ionbyttende harpiks behandling til fjernelse af klorofylfarvestoffer
Bemærk: De mængder, der er citeret i følgende trin antages en oprindelige arbejde omfanget af 100 \u2012 150 planter. Trin 8 er ikke egnet til produkter, der indeholder carboxylsyre grupper eller funktionelle grupper, der ville være hydrolyseret grundlæggende betingelser såsom estere.
- Opløse den rå ekstrakt genereret i trin 7 i en minimal mængde af ethanol.
- Der tilsættes 50 mL af grundlæggende ionbyttende harpiks perler (Se Tabel af materialer) til output af trin 7.1.1, og der rystes ved stuetemperatur i 30 min.
Bemærk: Ikke erstatte ryster for brug af omrøring apparater. Magnetiske eller mekaniske overhead omrøring kan kompromittere integriteten af resin perler. Egnet agitation kan også bekvemt opnåede langsom rotation af reaktionskolben på en roterende fordamper med vakuum ved atmosfærisk tryk eller afbrudt. - Tilføje en yderligere 50 mL af grundlæggende ionbyttende harpiks perler hvert 30 min, indtil reaktionen er gået til afslutning; grundlæggende ionbyttende harpiks perler vil ændre fra Rosa til grøn farve, og den flydende fase skifter fra grøn til orange eller en skumle brun farve afhængig af omfanget.
- Hvis du er i tvivl om, at reaktionen er gået til færdiggørelse, prøve 0,5 mL af væsken. Filtrer prøven gennem en lille kolonne af diatoméjord og observere farven af filtratet; Reaktionen er normalt fuldstændig inden for 1,5 h.
- Filtrer reaktionsblandingen gennem en kort kolonne af diatoméjord.
- Udføre dette via vakuum filtrering eller via et glas flash kromatografi kolonne ved hjælp af hånd bælge for at anvende pres. Hvis filtrationshastighed bremser, forstyrre toppen af diatoméjord puden med en omrøring stang. Saml filtratet.
- Skyl de indsamlede harpiks perler med ethanol, efterfulgt af 1:1 ethanol: hexan, og endelig hexan. Bruge en skyl volumen tilstrækkeligt til resuspend perler på toppen af kolonnen diatoméjord.
- Kombinere filtratet fra trin 8,4 og skylninger fra skridt 8,5, og koncentrere sig til tørhed af roterende fordampning under vakuum.
9. indledende ru fraktionering
Bemærk: Følgende metode er normalt passende for typiske oxideret triterpene aglycones, og beskæftiger en automatiseret flash kromatografi instrument. Henvise til producentens litteratur for flere detaljer om operationen.
- Adsorberes den rå vare genereret i trin 8 på flash grade silica gel (pore størrelse: 60 Å, partikelstørrelse: 35 \u2012 75 μm) for ansøgning til en flash kromatografi patron via tør læsning metode.
- Opløse den rå vare genereret i trin 8 i en minimal mængde af passende organisk opløsningsmiddel. Sikre fuldstændig opløsning.
Bemærk: Dichlormethan med tilføjelse af et par dråber af methanol er normalt et passende valg af opløsningsmiddel. - Skru toppen af en 100 g forudfyldte flash kromatografi patron (Se Tabel af materialer) og fjerne Indsæt for at afsløre den tørre hoved lastrum. Brug hoved rummet til at måle den passende mængde af silicagel for tør laste.
- Overføre den målte volumen af silica gel for tør laste til løsning af rå produkt, derefter fjerne opløsningsmidlet af roterende fordampning under vakuum.
Bemærk: Silica gel bør vende tilbage til en letflydende pulver. Mod slutningen af den fordampning proces blid skrabe kan være nødvendigt at gratis silicagel fra siden af fordampning kolben. - Reagensglasset 100 g flash kromatografi patron 100 mL/min. med mindst 5 kolonne mængder af 100% hexan, men ideelt indtil patron indhold er fuldt og ensartet fugtet.
- Overføre rede tør laste silicagel genereret i trin 9.1.3 til tørre lastning hoved rummet af afbalancerede 100 g flash kromatografi patron, ved at hælde. Suspension i hexan og en bred puttes i munden pipette kan bruges til at støtte overførsel af eventuelle resterende tør laste silica gel.
- Våd overførte tør laste silicagel bed med 100% hexan at fjerne luft fra tør laste headspace.
- Kør følgende kromatografi metode: opløsningsmiddel [A]: hexan, opløsningsmiddel [B]: ethylacetat, strømningshastighed: 100 mL/min., Gradient: 0% [B] til 100% [B] over 3000 mL, samling: indsamle alle, brøkdel størrelse: 250 mL.
- Analysere fraktioner af tynde lag kromatografi (TLC)8 eller gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS)8og koncentration til tørhed fraction(s) indeholdende sammensat af interesse via roterende fordampning under vakuum.
- Opløse den rå vare genereret i trin 8 i en minimal mængde af passende organisk opløsningsmiddel. Sikre fuldstændig opløsning.
- Udføre downstream fine rensning, indtil det ønskede niveau af renhed er nået.
Bemærk: Downstream fine rensning er helt sammensatte specifikke og det er ikke muligt at levere standardiserede trin (Se afsnittet diskussion).
Representative Results
Typisk isoleret udbytter er afhængige af enzym/enzym kombination under undersøgelsen, den kemiske stabilitet af stoffet, mål og hvordan udfordrende rensningsprocessen var. Vi har tidligere rapporteret isolerede udbytter af β-amyrin derivater fra vores kombinatoriske biosyntese eksperimenter spænder fra 0,12 3.87 mg pr. gram tørt N. benthamiana blad pulver. Disse forbindelser varierede meget i niveau af oxidation og inkluderet unaturlige kombinationer af enzymer (figur 3)8. Denne protokol er anvendes rutinemæssigt i vores laboratorium til at producere snesevis eller hundredvis af milligram af renset produkt for strukturel karakterisering af NMR spektroskopi og downstream funktionelle assays. Vi har også vist den forberedende nytte af denne platform ved at producere 0,8 g af triterpen stillads β-amyrin på en renhed på mere end 98%. Dette eksperiment bruges 459 planter, og repræsenterer en isoleret afkast på 3,3 mg per gram af tør N. benthamiana blad pulver8.
Figur 1: skematisk oversigt. Skematisk fremstilling af processen at udnytte forbigående udtryk af biosyntetiske enzymer i N. benthamiana blad at aflede endogene forsyninger af 2,3-oxidosqualene mod den forberedende produktion af nye værdifulde triterpene produkter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vakuum infiltrator konstruktion og processen. en) Skræddersyede plante indehaveren ene vinge løsrevet. b) Bespoke plante indehaveren vinger knyttet. c) Inversion og nedsænkningen af planter. d) indsættelse af infiltration bad. e) Infiltration bad på plads inden for infiltration kammer. f) komplet vakuum infiltrator: (1) vakuum pumpe (2) forbindelse fra vakuumpumpe til vakuum reservoir (3) vakuum reservoir isolering ventil (4) sammenhængen mellem vakuum reservoir og infiltration kammer (5) trykmåler (6) luft indtag ventil (7) Infiltration kammer (8) vakuum reservoir. g) repræsentant blade fra en plante infiltreret med en udtryk konstruktion for grøn fluorescerende proteiner (NGL) efter fem dage efter infiltration vækst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: tidligere rapporteret repræsentative resultater for den forberedende produktion af β-amyrin derivater bruger denne protokol8. Denne tabel er bestilt af isolerede udbytter. Kolonner er betinget formatering med farve angivelse af relative værdi. Rød = høj, grøn = lav (selvom mellemliggende gul). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Høj gennem læg vakuum infiltration tillader denne protokol anvendes rutinemæssigt i vores laboratorium for den forberedende produktion af triterpen forbindelser af interesse for forskellige downstream applikationer. Vakuum infiltration apparatet beskrevet her er let replikeret. Tilsætning af vakuum reservoiret er tilrådeligt at reducere tidsforbruget til at trække den nødvendige vakuum, men det er muligt at blot genbruge en umodificeret vakuumtørreskabet infiltration afdeling. Beskytte vakuumpumpe via tilføjelsen af en egnet kondensator er teoretisk set fornuftigt, men i vores laboratorium, vi har fundet dette at være unødvendige.
Infiltration dækning er kompromitteret hvis bladene ikke er fuldt nedsænket i infiltration suspension. Dette problem er minimeret ved at sikre, at suspensionsniveauet når oversiden af indehaveren af anlægget, og at planten har en stram pasform for infiltration bad. Bemærk fra figur 2 , oversiden af indehaveren af anlægget er forsænket i til infiltration bad når på plads. Dette opnås ved paneler på midterste kanterne af indehaveren, som udgør ankerpunkt med toppen af infiltration bad. Infiltration suspension vil kræve regelmæssige Tilføjelser til at opretholde den suspension. Dette opnås bedst ved tilsætning af overskydende infiltration suspension at forhindre gradvis reduktion af OD600 i løbet af en stor batch-wise infiltration. Men i vores hænder, substitution for vand synes ikke at have en mærkbar effekt på forventede udbytter på en forberedende skala, selv om dette ikke har været kvantitativt undersøgt. Hvor mange planter kan være infiltreret fra én batch af infiltration suspension er stadig et åbent spørgsmål. Vi infiltrere rutinemæssigt mellem 100 og 200 planter med en enkelt batch af infiltration suspension. Derudover er det normalt for nogle jord at sive ned i infiltration suspension i løbet af infiltration proces. Dette er ikke blevet fundet for at have en mærkbar effekt på infiltration effektivitet.
Under høsten er det tilrådeligt (men ikke kritisk) til høst kun bladene, der blev infiltreret (nogle blade vil være vokset efter infiltration). Selektiv høst forhindrer fortynding med uproduktive væv, som ellers ville øge forholdet mellem endogene urenheder i forhold til sammensat af interesse. Dette har en nominel effekt på lethed af downstream rensning, og øger omfanget af disse processer. Når du bruger tHMGR til at øge forløber forsyning, er en necrosed fænotype ofte observeret for at udvikle perioden efter infiltration vækst. Dette er normalt og faktisk aids selektiv høst og downstream tørringsprocessen. Tørrede blade pulver kan normalt gemmes i en forseglet beholder i et køligt, tørt, mørkt sted, men ideelt i en ekssikkator under vakuum. Dette afhænger af stabiliteten i sammensat af interesserede. Vær forsigtig, hvis du vælger at gemme i et-80 ° C fryser. Sikre, at de tørrede blade er i en vandtæt beholder, og ved udlagringen, tillader denne beholder til varm til stuetemperatur før åbning. Udeblivelse vil resultere i rewetting af blade, hindrer down-stream processing.
Efter høst fremgangsmà ¥ den i denne protokol er til orientering, og for at støtte de forskere, der kan have begrænset praktisk kemi erfaring. De kan erstattes mange andre naturlige produkt udvinding/rensning teknikker. Som beskrevet i indledningen, PSE har mange fordele, men hovedstad koster af kommercielt tilgængelige PSE apparater kan være uoverkommelige, og det er ikke afgørende. Grundlæggende ionbyttende harpiks behandling er en meget praktisk metode til at erstatte traditionelle forsæbning efterfulgt af væske-væske partitionering. Det er imidlertid ikke egnet til produkter, der indeholder carboxylsyre grupper eller funktionelle grupper, der ville være hydrolyseret grundlæggende betingelser såsom estere. Disse produkter ville forventes at opbevares på grundlæggende ionbytteren. Men der er potentiale for at udnytte dette for en fange og løslade procedure (ikke dokumenteret her). Hvor traditionelle forsæbning ville være passende, fungerer grundlæggende ionbyttende harpiks behandling som et bekvemt alternativ. Kromatografi metode beskrevet i trin 9, er blevet fundet for at være generaliserbart for de forbindelser, der er beskrevet i figur 3. Forbindelser af øget polaritet kan dog kræve en udvidet 100% ethylacetat eluering periode. Med henvisning til trin 9.2, downstream fine rensning er helt sammensatte specifikke, og er også afhængig af omfanget. Gentagne runder af mindre målestok flash kromatografi med optimeret forløb, er normalt tilstrækkelig til at opnå en passende for NMR analyse renhed. På større skalaer er krystallisering ofte et bekvemt alternativ. I vanskelige tilfælde anvendes forberedende eller semi-forberedende high-performance væskekromatografi (HPLC) afhængigt af den ønskede mængde af isolerede sammensatte. Eksempler på downstream rensningsprocesser for en række repræsentative forbindelser kan findes andetsteds8.
Den nuværende protokol, som præsenteres her, bruges rutinemæssigt i vores laboratorium og har bevist nytte. Der er imidlertid stadig betydelige muligheder for yderligere optimering af udtryk-platformen. Arbejdet er løbende i vores laboratorium for at undersøge hvordan yderligere pathway engineering og differential kontrol af protein udtryk niveauer kunne forbedre triterpene produktionen yderligere, mens mægle toksicitet for værtsceller. Der er også potentiale til at undersøge manipulation af intracellulær transport systemer20,21, og retningen af enzymer til forskellige cellulære rum22,23, veje, som kan forbedre effektiviteten af flere oxidation begivenheder. Potentielle fordele ved at ændre den underliggende morfologi af centrale organeller kunne også undersøges. For eksempel er overekspression af domænet membran af Arabidopsis thaliana HMGR blevet observeret for at inducere hypertrofi af det endoplasmatiske reticulum i planter24; et centralt websted for CYP450 aktivitet. Denne protokol er særdeles velegnet til produktion af milligram gram-skala mængder af triterpen produkter, og kan være ansat i en forskning indstilling til at få adgang til forbindelser til downstream undersøgelse (fx systematisk udforskning af struktur-aktivitet relationer, og foreløbige undersøgelser i de farmakodynamiske og farmakokinetiske egenskaber af føre forbindelser af klinisk interesse). Men platformen er lineært og pålideligt skalerbare simpelthen ved at øge antallet af planter, der anvendes, og den praktiske gennemførlighed af forbigående udtryk via agroinfiltration er blevet påvist i industriel målestok til produktion af farmaceutiske proteiner 14, således er der potentiale for denne platform skal udvides til kommerciel produktion af høj værdi Triterpener. Alternativt er det også muligt at envision produktion af stabile transformants transporterer færdiggjort ønske multigene biosyntetiske pathway, giver mulighed for masse dyrkning og fortsatte 'landbrug' af transgene N. benthamiana stammer producere forskellige forbindelser af handelsmæssig værdi.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Norwich forskning Park Studentship (JR), yde fælles teknik og naturvidenskab forskning Rådet/bioteknologisk og Biological Sciences Research Council BBSRC-finansierede OpenPlant syntetisk biologi Research Centre (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.); en John Innes centrum vidensudveksling og kommercialisering tilskud (BB/KEC1740/1) (BB); og BBSRC Institute strategiprogram Grant 'Molekyler fra naturen' (BB/P012523/1) og John Innes Foundation (A.O.). Vi vil gerne takke George Lomonossoff for at give pEAQ vektorer og Andrew Davis for fotografering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC-MS instrument | any | n/a | |
| Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
| Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
| Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
| Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
| Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Standing incubator | any | n/a | |
| Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
| Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
| 9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
| Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
| Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
| Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
| Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
| Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
| Balance (2 figures) | any | n/a | |
| Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
| A -80 freezer | any | n/a | |
| Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
| Safety glasses | any | n/a | |
| Lab coat | any | n/a | |
| Autoclave | any | n/a | |
| Consumables | |||
| Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
| Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
| Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
| Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
| Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
| Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
| Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
| Reagents | |||
| Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
| Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
| Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
| LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
| Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
| Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
| Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| Ethanol | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q water | any | n/a | |
| Levington F1 Compost | any | n/a | |
| Levington F2 Compost | any | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
| Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |
References
- Thimmappa, R., et al. Triterpene biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).
- Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins. Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).
- Roy, A., Saraf, S. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).
- Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).
- Liby, K. T., Sporn, M. B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease. Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).
- Yadav, V. R., et al. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer. Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).
- Christensen, L. P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).
- Reed, J., et al. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).
- Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).
- Peyret, H., Lomonossoff, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).
- Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
- Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).
- Voinnet, O., et al. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).
- Holtz, B. R., et al. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals. Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).
- Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).
- Kaufmann, B., Christen, P. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction. Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).
- Larsen, E., Christensen, L. P. Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables. Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).
- Sainsbury, F., et al. Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways. Methods Enzymology. , 185-202 (2012).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA Cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).
- Ting, H., et al. SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).
- Wang, B., et al. Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
- Nielsen, A. Z., et al. Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis. ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).
- Dong, L., et al. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209, 679-690 (2016).
- Ferrero, S., et al. Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells. Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).
