Summary
Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in Nicotiana benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. Hierin is beschreven van een gedetailleerd protocol voor snelle (5 dagen) preparative-schaal productie van triterpenen en analogen met behulp van dit krachtige plantaardige platform.
Abstract
De triterpenen zijn één van de grootste en meeste structureel diverse families van plantaardige natuurlijke producten. Groot aantal afgeleiden van de triterpene hebben aangetoond dat medisch relevante biologische activiteit bezitten. Echter heeft dit potentieel tot nu toe niet vertaald in een overvloed van triterpene afkomstige drugs in de kliniek. Dit is aantoonbaar (op zijn minst gedeeltelijk) een gevolg van de beperkte praktische synthetische toegang tot deze klasse van stof, een probleem dat de exploratie van structuur-activiteit verhoudingen en ontwikkeling van verstikken kan kandidaten door traditionele geneeskrachtige leiden chemie werkstromen. Ondanks hun enorme diversiteit, triterpenen zijn allen afgeleid van een enkele lineaire voorloper, 2,3-oxidosqualene. Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in de N. benthamiana kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe hoogwaardige triterpene producten die natuurlijk niet door deze host worden geproduceerd. Agro-infiltratie is een efficiënte en eenvoudige wijze van verwezenlijking van voorbijgaande expressie in N. benthamiana. Het proces omvat infiltratie van bladeren van de plant met een suspensie van Agrobacterium tumefaciens uitvoering de bedrijfsscholen expressie van belang. Co infiltratie van een extra A. tumefaciens stam uitvoering resulteert in een expressie construct codering een enzym dat verhoogt de voorloper aanbod aanzienlijk verhoogt. Na een periode van vijf dagen, kan het geïnfiltreerde blad materiaal worden geoogst en verwerkt om te halen en te isoleren van de resulterende triterpene product(en). Dit is een proces dat is lineair en betrouwbaar schaalbaar, simpelweg door het verhogen van het aantal planten gebruikt in het experiment. Hierin is beschreven van een protocol voor snelle preparative-schaal productie van triterpenen gebruik te maken van dit platform op basis van planten. Het protocol maakt gebruik van een gemakkelijk repliceerbaar vacuüm infiltratie-apparaat, waardoor de gelijktijdige infiltratie van maximaal vier planten, waardoor batch-wise infiltratie van honderden planten in een korte periode van tijd.
Introduction
De triterpenen zijn één van de grootste en meeste structureel diverse families van plantaardige natuurlijke producten. Ondanks hun enorme diversiteit, worden alle triterpene-natuurproducten verondersteld te worden afgeleid uit de dezelfde lineaire voorloper 2,3-oxidosqualene, een product van de mevalonate-pathway in planten. Cyclisatie van 2,3-oxidosqualene is gestart en wordt beheerd door een familie van enzymen oxidosqualene cyclases (OSCs) genoemd. Het eerste niveau van diversificatie, vertegenwoordigt deze stap cyclisatie met honderden verschillende triterpene steigers van aard1hebben gemeld. Deze steigers zijn verder gediversifieerd door afstemming van enzymen waaronder, maar niet beperkt tot, cytochrome p450s (CYP450s)1,2. Dergelijke biosynthetic trajecten kunnen leiden tot immense complexiteit, soms resulterend in eindproducten die nauwelijks herkenbaar uit de bovenliggende triterpene. Bijvoorbeeld, wordt de complexe structuur van de krachtige insecticide en antifeedant limonoïde-azadirachtin verondersteld te ontlenen aan een triterpene van de tetracyclic van de tirucallane type3.
Vele triterpene bereide natuurlijke producten, zelfs degenen met relatief ongewijzigde bovenliggende steigers, hebben aangetoond dat het bezitten van medisch relevante biologische activiteit4,,5,,6,7. Echter heeft dit potentieel tot nu toe niet vertaald in een overvloed van triterpene afkomstige drugs in de kliniek. Dit is aantoonbaar (op zijn minst gedeeltelijk) een gevolg van de beperkte praktische synthetische toegang tot deze klasse van stof, een probleem dat de exploratie van structuur-activiteit verhoudingen en ontwikkeling van verstikken kan kandidaten door traditionele geneeskrachtige leiden chemie werkstromen.
Voorbijgaande expressie triterpene biosynthetic enzymen uit andere plantensoorten in N. benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe hoogwaardige triterpene producten (Figuur 1). Dit proces kan worden gebruikt voor functioneel karakteriseren kandidaat-enzymen en reconstrueren van de biosynthetic trajecten van belangrijk natuurlijk voorkomende metabolieten. Ook kan het ook worden benut in combinatorische biosynthetic benaderingen om nieuwe triterpene producten, een strategie die in bibliotheken van structureel verwante analogen resulteren kan, waardoor systematische verkenning van de structuur-activiteit verhoudingen te produceren verbindingen van biologisch actieve lood8,9.
Agroinfiltration is een efficiënte en eenvoudige wijze van verwezenlijking van voorbijgaande expressie in N. benthamiana bladeren. Het proces omvat de infiltratie van bladeren met een suspensie van A. tumefaciens uitvoering de bedrijfsscholen binaire expressie van belang. Dit wordt bereikt via de toepassing van druk waardoor de vloeistof via de stoma, lucht in de intercellulaire ruimte verdringt, en te vervangen met de A. tumefaciens schorsing. De bacteriën worden de respectieve T-Ani overbrengen in het interieur van de plantencellen, resulterend in gelokaliseerde en voorbijgaande eiwituitdrukking in het weefsel geïnfiltreerde blad.
Terwijl elke binaire vector geschikt voor het genereren van transgene planten kan worden gebruikt voor tijdelijke expressie, gebruiken we de Cowpea Mosaic Virus CPMV afkomstige Hypertranslational (HT) eiwit expressie systeem10, 11. in dit systeem het gen van belang wordt geflankeerd door niet-vertaalde regio's (UTR) uit het CPMV RNA-2. De 5' UTR bevat wijzigingen wat resulteert in zeer hoge niveaus van proteïne vertaling met geen afhankelijkheid van virale replicatie12. Deze techniek heeft ontwikkeld tot de Easy-en-Quick (pEAQ) binaire vector serie waarin site-specifieke recombinatie klonen protocol-compatibele constructies (pEAQ -HT- DEST)10,11. Meeste pEAQ vectoren bevatten ook een tomaat borstelige stunt virus afkomstige P19 silencing suppressor gen13 binnen het T-DNA-gedeelte van de expressie cassette, die de noodzaak om een aparte P19-uitvoering stam coinfiltrate omzeilt en biedt zeer op hoog niveau eiwituitdrukking in de ontvangende plant cel10,11.
Gebruik van N. benthamiana als een expressie-host bepaalde voordelen heeft bij het werken met plant biosynthetic trajecten. De cel-architectuur ondersteunt intrinsiek passende mRNA en verwerking van eiwitten en goede brandcompartimentering, naast de noodzakelijke co-enzymen, reductases (voor CYP450s) en metabole precursoren. De koolstofbron is fotosynthese; aldus, kunnen de planten gewoon in goede kwaliteit compost, waarbij alleen water, CO2 (vanuit de lucht), en zonlicht als input worden gekweekt. Het platform is ook zeer handig voor co uitdrukking van verschillende combinaties van eiwitten, zoals dit facilely kan worden bereikt door de co infiltratie van verschillende stammen van A. tumefaciens, ontkenning van de noodzaak om te bouwen van grote multigene expressie -cassettes. Bovendien, het proces kan worden lineair en betrouwbaar aangepast gewoon door het verhogen van het aantal planten gebruikt in het experiment.
Eerdere werkzaamheden in ons laboratorium heeft het nut van dit platform voor voorbereidende schaal experimenten aangetoond. Dit opgenomen de voorbereiding van nieuwe triterpenen voor gebruik in topicale testen en schaal tot en met het bereiken van gram hoeveelheden van geïsoleerde product. Bovendien, de accumulatie van heterogene triterpene producten kan worden verhoogd verschillende vouwen door co uitdrukking van de vorm van een N-terminal-afgekapt, feedback-ongevoelig voor 3-hydroxy-, 3-methyglutary-co-enzym een reductase (tHMGR), een snelheidsbeperking upstream enzym in de mevalonate route8.
Sleutel tot dergelijke experimenten preparative-schaal is de mogelijkheid om een gunstige up-schaal de infiltratie-proces. In een typisch experiment, tientallen tot honderden van planten mogelijk moet bereiken de doelgroep hoeveelheid geïsoleerde product. Infiltrerend individuele bladeren met de hand (met behulp van een onnodig spuit) is operationeel veeleisende, en vaak onbetaalbaar tijdrovend, waardoor deze methode onpraktisch voor routine schaal-up. Vacuüm infiltratie biedt voordelen ten opzichte van de infiltratie van de hand, het is niet afhankelijk van het vaardigheidsniveau van de exploitant en de infiltratie van een grotere ruimte van het blad oppervlak laat. Deze procedure is commercieel gebruikt voor de grootschalige productie van farmaceutische eiwitten14. Dit protocol maakt gebruik van een gemakkelijk repliceerbaar vacuüm infiltratie-apparaat, die kan worden opgebouwd uit onderdelen die commercieel verkrijgbaar. Hierdoor is de gelijktijdige infiltratie van maximaal 4 planten, bieden snelle en praktische batch-wise infiltratie van honderden planten in een korte periode van tijd (Figuur 2a -2b). Het vacuüm infiltratie apparaat bestaat uit een vacuüm oven die de infiltratie kamer (figuur 2f vormt). De oven is verbonden met een pomp via een vacuüm reservoir. Dit vermindert de tijd die nodig is om de gewenste vacuüm in de zaal van de infiltratie. Planten zijn beveiligd in een op maat gemaakte houder en ondersteboven in een 10 L roestvrij stalen waterbad gevuld met A. tumefaciens schorsing (Figuur 2a -2 c). Volledige onderdompeling van de antenne delen van de planten is belangrijk voor efficiënte infiltratie. Het waterbad wordt dan geplaatst in de vergaderzaal van de infiltratie (figuur 2d -2e), en het vacuüm toegepast om te tekenen van de lucht uit de interstitiële ruimten van blad. Zodra de druk verminderd met 880 mbar (een proces dat duurt ongeveer 1 minuut) de infiltratie kamer aan atmosferische druk snel terug is gebracht 20-30 s door het openen van de oven ingangsafsluiter, waarna infiltratie is voltooid.
Vijf dagen na de infiltratie is het plantmateriaal klaar voor de oogst en de daaropvolgende extractie en isolatie van het/de gewenste product(en). Vanaf dit punt is het proces gewoon een natuurproduct extractie en zuivering van blad materiaal, een werkstroom die is bekend bij elke scheikundige natuurproduct. Er bestaan veel verschillende methoden voor de eerste extractie en zuivering van de daaropvolgende15. De meest geschikte keuze van methoden en de exacte voorwaarden gebruikt is sterk afhankelijk van de bijzondere chemische eigenschappen van de stof van belang, naast de beschikbaarheid van vaardigheden en/of apparatuur. Het is niet mogelijk om op te nemen in dit protocol een volledig gegeneraliseerd, stapsgewijze methode voor de downstream verwerking van geoogste blad plantmateriaal voor geïsoleerde product die blindelings kan worden gevolgd voor elk product van de triterpene van belang, noch zou het geschikt om te proberen om dit te doen. Dit protocol zal evenwel een overzicht van de Basiswerkstroom gebruikt in ons laboratorium en sommige methoden voor de vroege stadia van het proces, die in onze ervaring is gebleken dat generaliseerbaar voor meest zuurstofrijk aglyconen triterpene producten. Het gaat hierbij om twee relatief zeldzaam technieken, namelijk drukkend Solvent extractie (PSE), en een handige heterogene fase methode voor chlorofyl verwijderen met behulp van een sterk basische ionenwisseling hars.
PSE is een zeer efficiënte techniek voor de winning van kleine organische moleculen uit solide matrices. Extracties worden uitgevoerd onder druk (ca. 100-200 bar), het belangrijkste voordeel is de mogelijkheid om het gebruik van verlicht temperaturen die hoger zijn dan het koken punt van de extractievloeistof. Dit kan aanzienlijk verminderen de tijd en de hoeveelheid oplosmiddel die nodig is om een uitputtende extractie, in vergelijking met andere hete oplosmiddel technieken zoals eenvoudige maagzuur of Soxhlet extracties16. Commerciële bank-top PSE-instrumenten zijn beschikbaar, die gebruikmaken van verwisselbare extractie cellen en geautomatiseerde oplosmiddel behandeling, Verwarming en toezicht. Dit maakt deze techniek zeer geschikt. Het is ook duidelijk minder gevaarlijk, vooral voor exploitanten met een beperkte praktische chemie ervaring.
Verzeping van extracten van de ruwe blad onder terugvloeiing gevolgd door vloeistof/vloeistof partitioneren is een gemeenschappelijke techniek voor de verwijdering van de bulk van chlorofylen voorafgaand aan latere zuivering of analyse. Echter, dit kan vaak worden operationeel eisen op grotere schalen. Bovendien kunnen detectie voor de interface, of verlies van de producten als gevolg van de vorming van emulsies problematisch zijn. Het gebruik van sterk basische ionenwisselaars uitvoeren van heterogene fase hydrolyse kan dienen als een geschikt alternatief. De gepigmenteerde gedeelte van de gehydrolyseerde chlorofyl blijft zelfklevend aan de hars en kan eenvoudig worden verwijderd door filtratie. Dit protocol maakt gebruik van een voorbereidende schaal aanpassing van een eerder gemelde analytische procedure17 die gebruikmaakt van een commercieel beschikbare fundamentele ionenwisseling hars.
Hieronder beschrijven we een gedetailleerde en snelle protocol voor de productie van de voorbereidende schaal van triterpenen gebruik te maken van dit platform op basis van planten. Dit protocol is routinematig gebruikt in ons laboratorium voor bereiden tientallen tot honderden milligrammen van geïsoleerde triterpene product voor toepassingen die een structurele karakterisering met nucleaire magnetische resonantie (NMR), infraroodspectroscopie, en/of verder studeren in functionele testen.
Protocol
Opmerking: Voordat u dit protocol, vertrouwd te raken met de materiële veiligheidsgegevens voor alle stoffen die worden gebruikt, en het nemen van passende veiligheidsmaatregelen. Deze omvatten maar zijn niet beperkt tot: het dragen van veiligheidsbril bij het werken met glas onder vacuüm, en de behandeling van droge silicagel in een zuurkast. Het is ook essentieel dat lokale wetgeving met betrekking tot werken met transgene materiaal is gecontroleerd en nageleefd, inclusief volgende passende inperkingsmaatregelen procedures.
1. het genereren van A. tumefaciens stammen voor infiltratie
Opmerking: Wij bieden hier een vereenvoudigde beschrijving van de stappen die nodig zijn voor het genereren van geschikte A. tumefaciens stammen voor voorbijgaande expressie. Verdere details van deze stappen worden beschreven door Sainsbury et al. 8.
- Versterken door PCR of synthetiseren van het eiwit codering regio van het gen van belang geflankeerd door 5' en 3' attB sequenties geschikt voor generatie van een post-kloon voor gebruik met een site-specifieke recombinatie klonen protocol18,19.
- Forward primer gebruiken: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, Reverse primer: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN... = reeks specifieke volgorde).
- (Vertegenwoordiger) PCR voorwaarden gebruiken: reactie mengsel (25 µL, totale), buffer (5 x, 5 µL, Zie Tabel of Materials), dNTPs (10 mM, 0,5 µL), Forward primer (10 µM, 1,25 µL), Reverse primer (10 µM, 1,25 µL), sjabloon DNA (variabele concentratie, 50-250 ng, 0,5 µL ), De polymerase van DNA (2000 U/mL, 0,25 µL, Zie Tabel of Materials), Nuclease-gratis water (tot 25 µL). De thermocycler als volgt uitgevoerd: eerste denaturatie (98 ° C, 30 s); Start cyclus (98 ° C, 30 s; 45 – 72 ° C, 20 s; 72 ° C, 30 s/kb) einde van de cyclus; 35 cycli; Final extension (72 ° C, 10 min).
- Volg een standaard site-specifieke recombinatie klonen protocol18,19 te genereren een kloon van de post met behulp van elke vector van de niet-gebaseerde kanamycine post (wij gebruiken pDONR207 die commercieel beschikbaar is).
Opmerking: De integriteit van de kloon van de vermelding moet worden bevestigd door sequencing, alvorens het te gebruiken voor het genereren van de pEAQ -HT-DEST1 expressie construct. De pEAQ -HT-DEST1 is beschikbaar op verzoek van het Lomonossoff laboratory in het John Innes Centre in Norwich, Verenigd Koninkrijk. - Isoleren van de pEAQ -HT-DEST1 vector van de kloon van de expressie gegenereerd in stap 1.1.3, en opgeslagen bij-20 ° C vóór gebruik in stap 1.3.
Opmerking: Elke commercieel beschikbare handige spin kolom gebaseerde plasmide zuivering kit ontworpen voor het extraheren van plasmiden van klonen van stammen van E. coli is geschikt. Volg de specifieke instructies van de gekozen plasmide zuivering kit (Zie Tabel van materialen).
- Chemisch bevoegde A. tumefaciens voorbereiden op transformatie.
- Enten van een selectieve LB (Luria Bertani medium: 10 g/L bacto-trypton, 10 g/L NaCl en 5 g/L gistextract, agar 10 g/L pH 7,0) agarplaat door A. tumefaciens LBA4404 strepen uit een voorraadculturen glycerol (50 μg/mL rifampicine, 100 μg/mL streptomycine). Na een nacht bebroeden bij 28 ° C in een staande incubator.
- Inoculeer selectieve vloeibare LB-media (50 μg/mL rifampicine, 100 μg/mL streptomycine) 50 mL met een monster van A. tumefaciens LBA4404 cellen uit stap 1.2.1. Na een nacht bebroeden bij 28 ° C in een schudden incubator bij 200 omwentelingen per minuut.
- De cultuur van stap 1.2.2 op ijs gedurende 10 minuten afkoelen- and -pellet vervolgens de A. tumefaciens cellen door centrifugeren bij 4 ° C en 4500 x g voor 5 min (gooi de bovendrijvende substantie).
- Resuspendeer de pellet uit stap 1.2.3 in 1 mL ijskoud 20 mM waterige CaCl2 oplossing en herhaal de stap van centrifugeren uit stap 1.2.3 (gooi de bovendrijvende substantie).
- Resuspendeer de pellet uit stap 1.2.4 in 1 mL ijskoud 20 mM waterige CaCl2 oplossing en aliquot de resulterende schorsing in op 50 µL partijen. Flash bevriezen de aliquots in vloeistof N2 en winkel bij-80 ° C voorafgaand aan gebruik.
- Transformeren het voorbereide A. tumefaciens LBA4404 met de geïsoleerde pEAQ -HT-DEST1 vector gegenereerd in stap 1.2.
- 50 µL van A. tumefaciens schorsing gegenereerd in stap 1.2 op ijs ontdooien, en broeden met 100 \u2012 200 ng voor geïsoleerde pEAQ -HT-DEST1 vector, gegenereerd in stap 1.1, bij 0 ° C gedurende 5 minuten.
- Koude schok de bebroede schorsing uit stap 1.3.1 in vloeistof N2 voor 30 s, vervolgens laten opwarmen tot kamertemperatuur.
- Voeg 200 l van SOC medium (SOC: 20 g/L bacto-trypton, gistextract, 0.58 g/L NaCl, KCl 0,19 g/L, 2.03 g/L MgCl2, 2,46 g/L magnesium-sulfaat 7-hydraat, 3,6 g/L glucose van de 5 g/L) tot het koud geschokt schorsing van stap 1.3.2 en incubeer gedurende 4 uur bij 28 ° C in een schudden incubator bij 200 omwentelingen per minuut.
- Inoculeer een selectieve LB agarplaat (50 μg/mL rifampicine, 50 μg/mL kanamycine, 100 μg/mL streptomycine) met het SOC-cultuur uit stap 1.3.3. Grondig verspreid, en incubeer gedurende 3 dagen bij 28 ° C in een staande incubator.
- Inoculeer 5 mL selectieve LB-media (50 μg/mL rifampicine, 50 μg/mL kanamycine, 100 μg/mL streptomycine) met een enkele kolonie uit stap 1.3.4. Na een nacht bebroeden bij 28 ° C in een schudden incubator bij 200 omwentelingen per minuut.
- Toevoegen van 200 μL van glycerol aan 1 mL van de vloeibare cultuur uit stap 1.3.5, meng en opslaan bij-80 ° C.
Opmerking: Deze cultuur kan worden nieuw leven ingeblazen voor toekomstige experimenten door strepen op LB agar platen met de juiste antibiotica (hieronder beschreven).
2. Maak infiltratie suspensie
- Enten van een selectieve agarplaat LB met strepen van de gewenste A. tumefaciens stammen uit de glycerol voorraad culturen gegenereerd in stap 1. Na een nacht bebroeden bij 28 ° C in een staande incubator.
Opmerking: Een stam uitvoering van tHMGR binnen een pEAQ -HT-DEST1 vector kan ook worden opgenomen.- Individueel van selectieve LB-media met een monster van elk A. tumefaciens stam geteeld in stap 2.1 50 mL beënten en na een nacht bebroeden bij 28 ° C in een schudden incubator bij 200 omwentelingen per minuut.
- Individueel overbrengen van de 50 mL culturen uit stap 2.1.1 tot en met 1000 mL van selectieve LB-media (rifampicine 50 μg/mL, kanamycine, 50 μg/mL streptomycine, 100 μg/mL) en na een nacht bebroeden bij 28 ° C in een schudden incubator bij 200 omwentelingen per minuut.
- Individueel pellet de A. tumefaciens door middel van centrifugeren (4000 x g), van de vloeibare culturen gegenereerd in stap 2.1.2 (gooi de bovendrijvende substantie).
- Individueel resuspendeer de pellets uit stap 2.1.3 in 50 mL vers bereide MMA buffer (MMA Buffer: 10 mM 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic zuur, pH 5.6 (KOH), 10 mM MgCl2, 150 μM 3'5 '-dimethoxy-4'-Acetofenon) en Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur.
- Het combineren van de juiste hoeveelheid elke A. tumefaciens MMA schorsing (gegenereerde in stap 2.1.4) tot een uiteindelijke OD600 van ten minste 0,2 voor elke stam in een totale eindvolume van 10 L.
- Voeg extra MMA buffer aan de gecombineerde schorsingen gegenereerd in stap 2.1.5 tot een eindvolume van 1 L (gebruik onmiddellijk in stap 3).
Opmerking: Het is raadzaam voor te bereiden op een extra 2 L van infiltratie opschorting handhaven van het vloeistofniveau tijdens het proces van de infiltratie. - Bereiden 1 L voor 10 x kracht MMA buffer.
3. uitvoeren van vacuüm infiltratie
Opmerking: Zie Figuur 2 voor een beschrijving van vacuüm infiltratie apparaat bouw. Gebruik 5-week-oude N. benthamiana planten in 9 cm x 9 cm potten voor de stappen van de procedure. Zaailingen moeten worden gezaaid in F1 compost (bijvoorbeeld van Levington) en geteeld voor 2 weken voordat ze worden doorgegeven naar afzonderlijke potten met F2 compost. Planten moeten worden gekweekt in een kas bij 25 ° C, met 16 h per dag licht (gebruik aanvullende verlichting wanneer dit nodig is), water dagelijks, maximale dichtheid van 100 planten/m2.
- Overdracht van de 1 L van infiltratie schorsing gegenereerd in stap 2 en de 1 L van 10 x kracht MMA buffer om de infiltratie bad, gevolgd door een extra 8 L water.
- De afneembare vleugels van de op maat gemaakte plant houder verwijderen, invoegen van 4 planten (5-week-oude planten zie voorgaande opmerking) en opnieuw koppelen van de vleugels. Omkeren van de houder en plaats op de top van de infiltratie bad om het onderdompelen van de bladeren in de schorsing van de infiltratie.
Opmerking: Zorgen dat de schorsing niveau bereikt de oppervlaktelaag van de houder van de plant. Het beter met de toevoeging van extra infiltratie schorsing te verhogen indien nodig. - De infiltratie bad met verzonken planten overbrengen in de zaal van de infiltratie, en sluit de deur. Zorg ervoor dat de luchtinlaatklep is gesloten op de infiltrant. Zet de vacuümpomp en de inline-klep naar het vacuüm reservoir gevolgd door vacuum inlaat ventiel op de infiltratie zaal open.
- Zodra de druk in de zaal infiltratie is teruggebracht door 880 mbar, de vacuum inlaat klep dicht en open de luchtinlaatklep. Zodra de zaal infiltratie is teruggekeerd naar de atmosferische druk, de deur open en verwijder de infiltratie-bad.
- De houder van de plant tot de planten zijn niet langer ondergedompeld in de schorsing van de infiltratie, dan voorzichtig de houder schudden zodat overtollige schorsing te lopen uit de bladeren terug in het bad van de infiltratie te verhogen.
- De houder terug naar de rechtop, verwijderen de afneembare vleugels, en verwijderen van de planten.
- Herhaal stap 3.1.1 tot en met 3.1.5 totdat het gewenste aantal planten hebben zijn geïnfiltreerd.
- Autoclaaf de opschorting van de gebruikte infiltratie voorafgaand aan verwijdering.
- Autoclaaf de infiltratie Bad vóór hergebruik in latere experimenten.
- Het interieur van de kamer van de infiltratie steriliseren door reiniging met 70% ethanol en laat lucht droog vóór hergebruik in latere experimenten.
- De afneembare vleugels van de op maat gemaakte plant houder verwijderen, invoegen van 4 planten (5-week-oude planten zie voorgaande opmerking) en opnieuw koppelen van de vleugels. Omkeren van de houder en plaats op de top van de infiltratie bad om het onderdompelen van de bladeren in de schorsing van de infiltratie.
4. de geïnfiltreerde planten groeien
- Schik de geïnfiltreerde planten uit stap 3 bij een maximale dichtheid van 100 planten/m2 in een kas.
- Voor 5 dagen bij 25 ° C en 16 uur per dag van het licht (gebruik aanvullende verlichting wanneer dit nodig is), en water dagelijks groeien.
5. de oogst van de geïnfiltreerde bladeren
- Na 5 dagen van de groei, de oogst de bladeren.
- Autoclaaf afval plantmateriaal, potten en bodem voorafgaand aan verwijdering.
6. het drogen van de geoogste bladeren
Opmerking: De hieronder beschreven procedure voor de exacte lyofilisatie hangt af van de aard van de beschikbare lyofilisatie toestellen beschikbaar.
- Lyophilize de geoogste bladeren tot droog.
- Plaats de geoogste bladeren in een 2 mm dik polypropyleen zak. Het bevriezen van de geoogste bladeren door op te slaan in een vriezer-80 ° C gedurende 30 minuten.
- Perforate de zak met veel kleine gaatjes met behulp van een pincode. Plaats de zakken bevroren verlaat in de centrale kamer van de lyophilizer. Controleer alle kolf bijlage kranen zijn gesloten en schakel over op de lyophilizer. Controleer de condensor bereikt minstens-50 ° C en de druk vermindert om ten minste 0,15 mbar en vervolgens laat 's nachts.
- Schakel de lyophilizer en het vacuüm door het openen van een kolf bijlage kraan vent. Verwijder de gedroogde bladeren van de centrale kamer, en gaat u verder met stap 7.
7. hydrofoor Solvent extractie
Opmerking: De stappen van de procedure verwijzen naar het gebruik van een commercieel beschikbare PSE-instrument (Zie Tabel van materialen). Raadpleeg de fabrikant literatuur voor meer gedetailleerde informatie over de operatie. Het instrument wordt uitgevoerd 4 extracties in parallel.
- De gedroogde blaadjes vermalen tot een poeder van de cursus via een handige methode (bijvoorbeeld voor de meeste triterpene verbindingen van belang een binnenlandse food processor gebruiken, of handmatig verpletteren de bladeren terwijl deel uitmaakt van een tas).
Opmerking: Slijpen met een stamper en vijzel onder vloeibare stikstof is meestal niet nodig.- Het blad poeder mengen met kwartszand (0.3 \u2012 0,9 mm, 20% van hun volume) in een geschikte houder; Dit fungeert als een dispergeermiddel en verbetert de efficiëntie van het extractieproces.
- Bereiden 4 extractie cellen (120 mL) voor het vullen. Daarvoor, omkeren van de extractie-cellen en invoegen van het glasvezel filter, gevolgd door de metalen frit en houden van de plug. Retourneren van de cellen van de winning naar de rechtop positioneren en toevoegen van een 1 cm diepe laag van kwartszand (0.3 \u2012 0,9 mm).
- Vul de extractie-cellen.
- De extractie cellen vullen met het bereid blad poeder gegenereerd in stap 7.1 tot aan de vullijn. Indien nodig, zachtjes comprimeren het poeder tijdens dit proces te vergemakkelijken van de toevoeging van een grotere hoeveelheid in elke cel van de extractie.
- Voeg een kleine laag van kwartszand (0.3 \u2012 0,9 mm) naar de top van de verpakte poeder en steek het bovenste cellulose filter.
- De cellen van de verpakte extractie in het PSE-instrument invoegen en voer de gewenste methode. Gebruik de volgende instellingen en materiaal; Oplosmiddel: 100% ethylacetaat; temperatuur: 100 ° C, druk: 130 bar. 3 cycli als volgt uitgevoerd: cyclus 1: 0 min greep, cyclus 2 en 3: 5 min greep, eindigen met een 2 min oplosmiddel flush en 12 min stikstof gas flush.
Opmerking: Het is raadzaam om eerst de extractiemethode op kleine schaal te optimaliseren. De volgende methode is echter vaak voldoende voor meest geoxideerde aglyconen van triterpene. De drank uit elke cel extractie kan worden gecombineerd in de dezelfde externe collectie vaartuig door te geven van de afval lijn als de bestemming van de extractie, in plaats van de afzonderlijke standaardcollectie lijnen. Let erop dat de hoeveelheid oplosmiddel gebruikt is afhankelijk van de verpakking van de extractie-cellen en de ingestelde temperatuur en druk. De bovenstaande methode genereert meestal ongeveer 800 mL extractie drank voor 4 parallelle extracties. - Herhaal stap 7.2 aan 7.3.3 totdat al het blad poeder is verwerkt.
- De gecombineerde extractie drank aan droogte, via roterende verdamping onder drukvermindering concentreren. Controleer of de verwachte output (d.w.z., donker groene drijfmest).
Opmerking: De precieze procedure kan variëren afhankelijk van de set up van de beschikbare rotatievacuümverdamper. Altijd Oogbescherming dragen bij het uitvoeren van roterende verdamping en glaswerk voor schade controleren alvorens voor te leggen aan vacuüm omstandigheden.- Zet op de chiller recycler, en laat de warmte-overdracht vloeistof afkoelen tot ten minste 5 ° C. Inschakelen van het waterbad, en de temperatuur instellen tot 35 ° C.
- De extractie drank overbrengen in een maatkolf van verdamping (vult u niet meer dan de helft van het volume van de kolf). De drank batchgewijs concentreren (in aan de dezelfde maatkolf) als het totale volume groter is dan dit. Sluit de kolf gevulde verdamping aan de damp-buis van de rotatievacuümverdamper (veilig met een gezamenlijke clip).
- Aanpassen van de kolf lift positie en hoek, zodat het onderdompelen van de onderste derde van de verdamping kolf in het waterbad op een hoek van ongeveer 45 °. Start de kolf spinnen bij een snelheid die begint te verspreiden van de drank van de extractie van de muren van de kolf.
- Zorgen de vent kraan is gesloten en beginnen met het verminderen van de druk (met behulp van de controleur van de vacuümpomp) totdat een matige infuus wordt waargenomen tussen de condensor en ontvanger kolf.
Opmerking: Laat niet de extractie drank om te beginnen aan de kook. Als dit gebeurt verminderen de kracht van het vacuüm distillatie onder controle te brengen. - Controleren en aanpassen van de vacuüm sterkte en draai snelheid zo nodig tot alle het oplosmiddel verdampt is.
8. fundamentele ionenwisseling hars behandeling voor verwijdering van chlorofylen
Opmerking: De hoeveelheden vermeld in de volgende stappen wordt ervan uitgegaan een originele werken schaal van 100 \u2012 150 planten. Stap 8 is niet geschikt voor producten die bevatten carbonzuur, of functionele groepen die zou worden gehydrolyseerd onder basisvoorwaarden zoals esters.
- Los het ruwe extract gegenereerd in stap 7 in een minimale hoeveelheid ethanol.
- Voeg 50 mL van fundamentele ionenwisseling harsparels (Zie Tabel van materialen) op de uitgang van de stap 7.1.1, en schudden bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Opmerking: Schudden voor het gebruik van het roeren van de apparatuur niet vervangen. Magnetische of mechanische overhead roeren kan de integriteit van de harsparels in gevaar brengen. Geschikt agitatie kan ook gunstig met worden bereikt door langzame draaiing van reactiekolf op een rotatieverdamper het vacuüm instellen bij atmosferische druk of verbroken. - Voeg een extra 50 mL basis ionenwisseling harsparels elke 30 minuten totdat de reactie is gegaan naar voltooiing; de fundamentele ionenwisseling harsparels verandert van roze groen van kleur, en de vloeibare fase verandert van groen in oranje of een troebel bruin kleur afhankelijk van de omvang.
- In geval van twijfel dat de reactie is gegaan tot voltooiing, genieten van 0,5 mL van de vloeistof. Filteren van het monster door een klein kolom van diatomeeënaarde en observeren van de kleur van het filtraat weg; de reactie is meestal voltooid binnen 1,5 uur.
- Filter het reactiemengsel door middel van een korte kolom met diatomeeënaarde.
- Dit via vacuüm filtratie, of via een glazen flash chromatografie kolom met behulp van hand balg pressiemiddelen uitvoeren. Als filtratie rate vertraagt, verstoren de bovenkant van de diatomeeënaarde pad met een opzwepende staaf. Vang het filtraat op.
- Spoel de verzamelde harsen kralen met ethanol, gevolgd door 1:1 ethanol: hexaan, en tenslotte hexaan. Een voldoende om resuspendeer de kralen op de bovenkant van de kolom diatomeeënaarde spoelen-volume gebruiken.
- Combineer het filtraat uit stap 8.4 en de gespoeld uit stap 8.5, en concentreren aan droogte door roterende verdamping onder vacuüm.
9. eerste ruwe fractionering
Opmerking: De volgende methode meestal geschikt is voor typische geoxideerde triterpene aglyconen en maakt gebruik van een instrument van geautomatiseerde flash chromatografie. Verwijzen naar de literatuur van de fabrikant voor meer informatie over de operatie.
- Het ruwe product gegenereerd in stap 8 op flash rang silicagel adsorberen (porie grootte: 60 Å, deeltjesgrootte: 35 \u2012 75 μm) voor toepassing op een flash chromatografie cartridge via droge lading methodologie.
- Het ruwe product gegenereerd in stap 8 in een minimale hoeveelheid geschikt oplosmiddel ontbinden. Zorgen voor volledige ontbinding.
Opmerking: Dichloormethaan met de toevoeging van een paar druppels van methanol is meestal een goede keuze van het oplosmiddel. - Draai de bovenkant van een cartridge met 100 g ingevulde flash chromatografie (Zie Tabel van materialen) en verwijderen van de insert te onthullen van de droge hoofd laadruimte. De hoofd ruimte gebruiken voor het meten van de juiste hoeveelheid silica gel droog in te laden.
- Het gemeten volume van silica gel voor droge lading overdragen aan de oplossing van ruwe product, dan Verwijder het oplosmiddel door roterende verdamping onder vacuüm.
Opmerking: De silicagel moet terugkeren naar een vrijstromend poeder. Tegen het einde van het proces zachte schrapen van verdamping kan worden moet de silica gel van de kant van de verdamping kolf gratis. - Equilibreer de 100 g flash chromatografie cartridge op 100 mL/min met ten minste 5 kolom volumes van 100% hexaan, maar idealiter totdat de inhoud van de cartridge volledig en gelijkmatig wordt bevochtigd is.
- Overdracht van de bereid droog laden silicagel gegenereerd in stap 9.1.3 aan de droge hoofd laadruimte van de 100 g geëquilibreerd flash chromatografie-patroon, door gieten. Suspensie in hexaan en een brede mouthed pipet kan worden gebruikt om overdracht van eventuele resterende droog laden silicagel.
- Natte de overgedragen droog laden silicagel bed met 100% hexaan om lucht van de droge lading headspace.
- Voer de volgende methode van de chromatografie: oplosmiddel [A]: hexaan, oplosmiddel [B]: ethylacetaat, debiet: 100 mL/min, verloop: 0%, [B], tot 100% [B] meer dan 3000 mL, collectie: verzamelen alle, breuk grootte: 250 mL.
- Analyseer de breuken door dunne laag chromatografie (TLC)8 of gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)8, en concentratie aan droogte de fraction(s) met de compound van belang via roterende verdamping onder vacuüm.
- Het ruwe product gegenereerd in stap 8 in een minimale hoeveelheid geschikt oplosmiddel ontbinden. Zorgen voor volledige ontbinding.
- Stroomafwaarts fijne zuivering uitvoeren totdat het gewenste niveau van zuiverheid is bereikt.
Opmerking: Stroomafwaarts fijne zuivering is volledig samengestelde specifieke en het is niet mogelijk om gestandaardiseerde stappen (Zie de sectie discussie).
Representative Results
Typisch geïsoleerde opbrengsten zijn afhankelijk van de combinatie van enzym/enzym onder onderzoek, de chemische stabiliteit van de doel-verbinding en hoe uitdagend het zuiveringsproces was. We hebben eerder gemeld geïsoleerde opbrengsten van β-amyrin derivaten uit onze experimenten van de combinatorische biosynthese variërend van 0.12 tot 3,87 mg per gram droge N. benthamiana blad poeder. Deze verbindingen varieerden sterk in het niveau van oxidatie en onnatuurlijke combinaties van enzymen (Figuur 3)8opgenomen. Dit protocol wordt routinematig gebruikt in ons laboratorium te produceren tientallen of honderden milligrammen van gezuiverde product voor structurele karakterisering door NMR spectroscopie en downstream functionele testen. We hebben ook de voorbereidende nut van dit platform aangetoond door overlegging van de 0.8 g van de triterpene steiger β-amyrin op een zuiverheid van meer dan 98%. Dit experiment gebruikte 459 planten, en vertegenwoordigt een geïsoleerde rendement van 3,3 mg per gram droge N. benthamiana blad poeder8.
Figuur 1: schematische samenvatting. Schematische weergave van het proces van exploitatie van voorbijgaande expressie van biosynthetic enzymen in de N. benthamiana blad om af te leiden van endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de voorbereidende productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vacuüm infiltrant bouw en proces. een) Bespoke plant houder een vleugel los. b) maat plant houder vleugels verbonden. c) inversie en onderdompeling van planten. d) inbrengen van de infiltratie-bad. e) infiltratie bad in plaats in de vergaderzaal van de infiltratie. f) Complete vacuüm infiltrant: (1) vacuüm pomp (2) verbinding van vacuüm pomp vacuüm reservoir (3) vacuüm reservoir isolatie ventiel (4) verbinding tussen vacuüm reservoir en de infiltratie kamer (5) manometer (6) luchtinlaatklep (7) Infiltratie kamer (8) vacuüm reservoir. g) vertegenwoordiger vertrekt vanuit één plant geïnfiltreerd met een expressie-constructie voor de groen fluorescente proteïne (GFP) na vijf dagen na infiltratie groei. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: eerder gemeld representatieve resultaten voor de voorbereidende productie van β-amyrin-derivaten met behulp van dit protocol8. Deze tabel is gerangschikt op geïsoleerde opbrengsten. Kolommen zijn voorwaardelijk opgemaakte met kleurindicatie van relatieve waarde. Rood = hoog, groen = laag (hoewel tussenliggende geel). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Hoog-via-gezette vacuüm infiltratie kan dit protocol worden routinematig gebruikt in ons laboratorium preparatieve voordeproductie van triterpene verbindingen van belang voor diverse downstream toepassingen. De hier beschreven vacuüm infiltratie-apparaat is gemakkelijk gerepliceerd. Toevoeging van het vacuüm reservoir is aan te raden om het verlagen van de benodigde tijd voor het trekken van het vereiste vacuüm, maar het is mogelijk om gewoon hergebruiken ongewijzigde vacuüm oven als de kamer van de infiltratie. Het beschermen van de vacuümpomp via de toevoeging van een geschikte condensor is theoretisch verstandig, maar in ons laboratorium hebben we gevonden dit overbodig.
Infiltratie dekking is aangetast als de bladeren zijn niet volledig ondergedompeld in de schorsing van de infiltratie. Dit probleem wordt geminimaliseerd door ervoor te zorgen dat het niveau van de suspensie bereikt de oppervlaktelaag van de houder van de plant, en dat de houder van de plant is een strakke pasvorm voor de infiltratie-bad. Opmerking van Figuur 2 dat de oppervlaktelaag van de houder van de plant is verzonken aan het bad van de infiltratie bij plaats. Dit wordt bereikt door de panelen op de middelste randen van de houder die vormen van het ankerpunt met de bovenkant van de infiltratie-bad. De infiltratie schorsing vergt periodieke aanvullingen op het peil van de schorsing. Dit is best bereikt door toevoeging van overtollige infiltratie opschorting om te voorkomen dat de geleidelijke vermindering van de OD600 in de loop van een grote batch-wise infiltratie. Echter in onze handen, doet vervanging voor water niet toelijken voor zijn een merkbaar effect op verwachte rendementen op preparatieve schaal, hoewel dit niet is geweest quantitively onderzocht. Hoeveel planten kunnen worden geïnfiltreerd van één partij van infiltratie schorsing is nog steeds een open vraag. We infiltreren routinematig tussen 100 en 200 planten met één enkele batch van infiltratie schorsing. Bovendien is het normaal dat sommige bodemmonster/uitspoelen naar de schorsing infiltratie in de loop van het proces van de infiltratie. Dit is niet een merkbaar effect op infiltratie werkzaamheid gevonden.
Tijdens de oogst is het aan te raden (maar niet kritisch) om te oogsten alleen de bladeren die waren geïnfiltreerd (enkele blaadjes zal zijn gegroeid na infiltratie). Selectieve oogst voorkomt verdunning met onproductieve weefsel, die anders de verhouding van endogene onzuiverheden ten opzichte van de compound van belang zou verhogen. Dit heeft een nominale invloed op het gemak van downstream zuivering, en verhoogt de omvang van deze processen. Bij het gebruik van tHMGR ter bevordering van de levering van de voorloper, wordt een necrosed fenotype vaak waargenomen te ontwikkelen in de groeiperiode na de infiltratie. Dit is normaal en het daadwerkelijk helpt selectieve oogst en het stroomafwaarts droogproces. Het gedroogde blad poeder kan meestal worden opgeslagen in een verzegelde container in een koele, droge, donkere plaats, maar idealiter in een exsiccator onder vacuüm. Dit hangt af van de stabiliteit van de stof van belanghebbende partijen. Wees voorzichtig als kiezen om op te slaan in een vriezer-80 ° C. Opdat de gedroogde bladeren zijn in een waterdichte container, en op de uitslag, toestaan deze container opwarmen tot kamertemperatuur voorafgaand aan de opening. Niet te doen zal resulteren in het rewetting van de bladeren, down-stream processing belemmeren.
De stappen na de oogst in dit protocol worden verschaft voor illustratieve doeleinden en steun die onderzoekers die praktische chemie beperkte mogelijk ervaring. Zij kunnen worden vervangen voor vele andere natuurproduct extractie/zuivering technieken. Zoals uiteengezet in de inleiding, PSE heeft vele voordelen, maar de hoofdstad kosten van verkrijgbare PSE-apparaat kan worden onbetaalbaar en het is niet noodzakelijk. Fundamentele ionenwisseling-hars behandeling is een zeer handige methode ter vervanging van de traditionele verzeping gevolgd door vloeistof/vloeistof partitioneren. Het is echter niet geschikt voor producten met carbonzuur of functionele groepen die zou worden gehydrolyseerd onder randvoorwaarden, zoals esters. Deze producten zou worden verwacht op de fundamentele ionenwisseling hars worden bewaard. Er is echter potentieel te exploiteren dit voor een vangst en de vrijgave procedure (niet gedocumenteerd hier). Waar traditionele verzeping wenselijk, fungeert fundamentele ionenwisseling-hars behandeling als een geschikt alternatief. De chromatografie-methode, beschreven in stap 9, geconstateerd worden gegeneraliseerd voor de verbindingen die zijn beschreven in Figuur 3. Verbindingen van verhoogde polariteit kunnen echter een langere periode van 100% ethylacetaat elutie. Met betrekking tot stap 9.2, stroomafwaarts fijne zuivering is volledig samengestelde specifiek, en is ook afhankelijk van de schaal. Herhaalde rondes van kleinschaliger flash chromatografie met geoptimaliseerde hellingen, is meestal voldoende om een passende NMR p.a. zuiverheid. Voor grotere schalen is kristallisatie vaak een handig alternatief. In moeilijke gevallen, kan de voorbereidende of semi-preparatieve krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) afhankelijk van de gewenste hoeveelheid van geïsoleerde samengestelde worden toegepast. Voorbeelden van downstream zuivering processen voor een aantal representatieve verbindingen kunnen worden gevonden elders8.
Het huidige protocol, zoals hier gepresenteerd in ons laboratorium routinematig wordt gebruikt, en heeft bewezen nut. Er is echter nog aanzienlijke ruimte voor verdere optimalisatie van het platform van de expressie. Wordt gewerkt in ons laboratorium om te onderzoeken hoe verdere traject engineering en differentiële controle van expressie eiwitniveaus zou kunnen verbeteren triterpene productie verder, terwijl het bemiddelen van de toxiciteit voor de cellen van de gastheer. Er zijn ook mogelijkheden te onderzoeken van de manipulatie van intracellulair transport systemen20,21, en de richting van enzymen tot andere cellulaire compartimenten22,23, wegen die kunnen verbeteren de efficiëntie van meerdere oxidatie gebeurtenissen. Potentiële voordelen voor het wijzigen van de onderliggende morfologie van belangrijke organellen kunnen ook worden onderzocht. Bijvoorbeeld, heeft overexpressie van het domein van de membraan van Arabidopsis thaliana HMGR waargenomen voor het opwekken van hypertrofie van het endoplasmatisch reticulum in planten24; een belangrijke site voor CYP450 activiteit. Dit protocol is bij uitstek geschikt voor de productie van milligram naar gram-schaal hoeveelheden van triterpene producten, en in de instelling van een onderzoek kan worden gebruikt voor toegang tot compounds voor downstream studie (bijvoorbeeld, het systematische verkenning van structuur-activiteit relaties en vooronderzoek in naar de farmacodynamische en farmacokinetische eigenschappen van loodverbindingen van klinisch belang). Echter, het platform is lineair en betrouwbaar schaalbare gewoon door het verhogen van het aantal planten gebruikt, en de uitvoerbaarheid van voorbijgaande expressie via agroinfiltration is aangetoond op industriële schaal voor de productie van farmaceutische eiwitten 14, dus is er potentieel voor dit platform worden uitgebreid voor commerciële productie van hoogwaardige triterpenen. Als alternatief, is het ook mogelijk om de productie van stabiele transformants uitvoering van de multigene biosynthetic pathway gefinaliseerde verlangen, waardoor de massale teelt voor ogen en bleef 'landbouw' van transgene N. benthamiana stammen het produceren van verschillende stoffen met een handelswaarde.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een Norwich Research Park studententijd (JR), verlenen de gezamenlijke Engineering en Physical Sciences Research Raad/Biotechnological en biologische wetenschappen onderzoek Raad BBSRC-gefinancierde OpenPlant synthetische biologie onderzoekscentrum (BB / L014130/1) (M.J.S., O.A.); een John Innes Centre kennisuitwisseling en commercialisering verlenen (BB/KEC1740/1) (BB); en de BBSRC Instituut strategisch programma subsidie 'Moleculen uit de natuur' (BB/P012523/1) en de John Innes Foundation (O.A.). We zouden graag bedanken George Lomonossoff voor het verstrekken van de pEAQ-vectoren en Andrew Davis voor fotografie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC-MS instrument | any | n/a | |
| Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
| Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
| Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
| Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
| Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Standing incubator | any | n/a | |
| Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
| Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
| 9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
| Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
| Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
| Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
| Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
| Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
| Balance (2 figures) | any | n/a | |
| Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
| A -80 freezer | any | n/a | |
| Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
| Safety glasses | any | n/a | |
| Lab coat | any | n/a | |
| Autoclave | any | n/a | |
| Consumables | |||
| Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
| Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
| Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
| Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
| Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
| Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
| Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
| Reagents | |||
| Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
| Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
| Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
| LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
| Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
| Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
| Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| Ethanol | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q water | any | n/a | |
| Levington F1 Compost | any | n/a | |
| Levington F2 Compost | any | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
| Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |
References
- Thimmappa, R., et al. Triterpene biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).
- Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins. Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).
- Roy, A., Saraf, S. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).
- Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).
- Liby, K. T., Sporn, M. B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease. Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).
- Yadav, V. R., et al. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer. Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).
- Christensen, L. P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).
- Reed, J., et al. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).
- Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).
- Peyret, H., Lomonossoff, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).
- Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
- Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).
- Voinnet, O., et al. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).
- Holtz, B. R., et al. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals. Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).
- Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).
- Kaufmann, B., Christen, P. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction. Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).
- Larsen, E., Christensen, L. P. Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables. Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).
- Sainsbury, F., et al. Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways. Methods Enzymology. , 185-202 (2012).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA Cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).
- Ting, H., et al. SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).
- Wang, B., et al. Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
- Nielsen, A. Z., et al. Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis. ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).
- Dong, L., et al. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209, 679-690 (2016).
- Ferrero, S., et al. Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells. Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).
