Summary
הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו מבוססת על צמחים.
Abstract
Triterpenes הם אחד מהגדולים רוב המשפחות מגוונות מבחינה מבנית של מוצרים טבעיים מהצומח. רבים נגזרים טריטרפן הוכחו בעלי פעילות ביולוגית רלוונטית מסיבות בריאותיות. עם זאת, עד כה פוטנציאל זה לא תורגמה שפע של סמים נגזר טריטרפן במרפאה. . זה ניתן לטעון (לפחות חלקית) תוצאה של גישה מוגבלת סינתטי מעשי ברמה זו של המתחם, בעיה אשר יכולים להחניק חקר מבנה-פעילות הגומלין ופיתוח של עופרת מועמדים על ידי מסורתי מרפא כימיה זרימות עבודה. למרות המגוון העצום שלהם, triterpenes כל נגזרים מתוך הקדמה ליניארי יחיד, 2, 3-oxidosqualene. ביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana ש להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים לא המיוצרים באופן טבעי על-ידי מחשב מארח זה. אגרו-חדירה הוא אמצעי יעיל ופשוט של השגת ביטוי benthamiana שארעית. התהליך כרוך חדירה של צמח עלים עם השעיה של Agrobacterium tumefaciens נושאת את construct(s) ביטוי של עניין. הסתננות שותף נוסף tumefaciens א זן נושאת לבנות ביטוי קידוד מגבירה את אנזים זה מגביר אספקת קודמן באופן משמעותי את התשואות. לאחר תקופה של חמישה ימים, החומר העלה הסתנן ניתן לקצור ולעבד לחלץ ולבודד את המוצר טריטרפן וכתוצאה מכך. זהו תהליך זה באופן ליניארי ובאמינות מדרגיים, פשוט על ידי הגדלת מספר צמחים המשמשים את הניסוי. בזאת הוא תיאר פרוטוקול לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה triterpenes ניצול פלטפורמה זו מבוססת על צמחים. הפרוטוקול מנצל מכשירים חדירה ואקום בקלות ניתן לשכפול, אשר מאפשר חדירה בו זמנית של עד ארבעה צמחים, ומאפשרת חדירה batch-wise של מאות צמחים בתקופה קצרה של זמן.
Introduction
Triterpenes הם אחד מהגדולים רוב המשפחות מגוונות מבחינה מבנית של מוצרים טבעיים מהצומח. למרות המגוון העצום שלהם, כל המוצרים הטבעיים טריטרפן הסברה להיגזר את אותו קודמן לינארית 2, 3-oxidosqualene, תוצר של השביל mevalonate בצמחים. Cyclization של 2, 3-oxidosqualene יזם, נשלט על-ידי משפחה של אנזימים כינה oxidosqualene cyclases (OSCs). שלב זה cyclization מייצג את הרמה הראשונה של גיוון, עם מאות פיגומים טריטרפן שונים שיש דווחו טבע1. פיגומים אלו מגוונים נוספים על-ידי התאמת אנזימים כולל אך לא מוגבל, ציטוכרום p450s1,(CYP450s)2. מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר כזה יכול להוביל מורכבות עצומה, לפעמים וכתוצאה מכך המוצרים הסופיים אשר בקושי לזיהוי מ טריטרפן האב. לדוגמה, מבנה מורכב אזדרכטין limonoid חזק של חרקים, antifeedant הוא האמין שואבים טריטרפן tetracyclic של tirucallane סוג3.
רבים נגזר טריטרפן מוצרי טבע, אפילו אלה עם האב יחסית שלא שונתה פיגומים, הוכחו בעלי פעילות ביולוגית רלוונטית מסיבות בריאותיות4,5,6,7. עם זאת, עד כה פוטנציאל זה לא תורגמה שפע של סמים נגזר טריטרפן במרפאה. . זה ניתן לטעון (לפחות חלקית) תוצאה של גישה מוגבלת סינתטי מעשי ברמה זו של המתחם, בעיה אשר יכולים להחניק חקר מבנה-פעילות הגומלין ופיתוח של עופרת מועמדים על ידי מסורתי מרפא כימיה זרימות עבודה.
הביטוי ארעית של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר טריטרפן ממינים אחרים צמח benthamiana ש העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים חדשים בעלי ערך גבוה טריטרפן (איור 1). תהליך זה יכול לשמש באופן פונקציונלי לאפיין את המועמד אנזימים, בנייה מחדש של מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר של מטבוליטים חשובים המתרחשים באופן טבעי. באותה מידה, אפשר גם לנצל את זה ב biosynthetic הוחלף נגזר גישות קומבינטורית. לייצר מוצרים חדשניים טריטרפן, אסטרטגיה שיכול לגרום ספריות של תחליפי הקשורות מבנית, המאפשר חקר הקשרים מבנה-פעילות שיטתית מעופרת פעילים ביולוגית תרכובות8,9.
Agroinfiltration הוא אמצעי יעיל ופשוט של השגת ביטוי ארעי העלים benthamiana ש . התהליך כרוך החדירה של עלים עם השעיה של tumefaciens א נושאת את construct(s) בינארי ביטוי של עניין. זו מושגת באמצעות הפעלת לחץ שכופה את הנוזל דרך הפיוניות, האוויר במרחב המערכת, והחלפתו המתלה tumefaciens א . החיידק להעביר את T-DNAs בהתאמה הפנים של תאי הצמח, והתוצאה היא ביטוי חלבון מקומי ולא ארעית בתוך רקמת העלה הסתנן.
תוך כדי כל וקטור בינארי מתאימים עבור יצירת הצמחים הטרנסגניים עשוי להיות מועסק לביטוי ארעי, אנו מנצלים לוביה פסיפס וירוס CPMV, נגזר Hypertranslational (HT) חלבון ביטוי מערכת10, 11. במערכת זו הגן עניין משני צדדיה אזורים לא מתורגם (UTR) מ CPMV RNA-2. 5' UTR מכיל שינויים וכתוצאה מכך רמות גבוהות מאוד של חלבון תרגום עם אין הסתמכות על שכפול ויראלי12. שיטה זו פותחה לתוך הסדרה וקטור בינארי קל ומהירה (pEAQ) הכוללת רקומבינציה בייעודי לאתר שיבוט תואם פרוטוקול בונה (pEAQ -HT- DEST)10,11. רוב pEAQ וקטורים מכילים גם עם עגבניות פעלולים בושי נגזר וירוס P19 שתיקה משתיק קול ג'ין13 בתוך החלק T-DNA בקלטת ביטוי, אשר עוקף את הצורך coinfiltrate זן P19 נושא נפרד, ונותנת לו מאוד ביטוי חלבון ברמה גבוהה במארח הצמח תא10,11.
שימוש benthamiana (ש ע) כמו מארח ביטוי יש יתרונות מסוימים בעת עבודה עם מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר הצמח. הארכיטקטורה תא תומך מיסודו mRNA המתאים לעיבוד חלבון, ואת מידור תקין, בנוסף פו-טי של אנזימים הדרושים לעבודה, reductases (עבור CYP450s) ו מבשרי מטבולית. מקור הפחמן הוא הפוטוסינתזה; לפיכך, ניתן פשוט לגדל צמחים קומפוסט איכותי, המחייב רק מים, CO2 (מן האוויר), ואור שמש כקלט. הפלטפורמה היא גם מאוד נוח עבור ביטוי משותף של צירופים שונים של חלבונים, כמו זה ניתן להשיג facilely באמצעות חדירה שיתוף של זנים שונים של tumefaciens א, שלילת הצורך לבנות ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים גדול קלטות. יתר על כן, התהליך וניתן באופן ליניארי ובאמינות לשנותם פשוט על-ידי הגדלת מספר צמחים המשמשים את הניסוי.
העבודות הקודמות במעבדה שלנו הוכיחה את התועלת של הפלטפורמה עבור ניסויים בקנה מידה מפוח. זה כלל את הכנת triterpenes הרומן לשימוש אתריים מבחני בקנה מידה למעלה כדי להשיג גרם כמויות של מוצר בודד. יתר על כן, ניתן להגדיל הצטברות של מוצרים טריטרפן heterogenous כמה לקפל על ידי ביטוי משותף של טופס N-מסוף-קטום, משוב-רגישות של הידרוקסי 3, 3-methyglutary-קואנזים רדוקטאז (tHMGR), הגבלת קצב נגד הזרם אנזים מסלול mevalonate8.
המפתח ניסויים מפוח בקנה מידה כזה הוא היכולת בנוחות עד בקנה מידה תהליך הסתננות. בניסוי טיפוסי, עשרות עד מאות צמחים עשוי להידרש כדי להשיג את המטרה כמות המוצר מבודד. הסתננות עלים בודדים באופן ידני (באמצעות מזרק מיותר) היא מבצעית תובעניים, וצורך לעתים קרובות מדי, עיבוד בשיטה זו מעשי עבור הסולם שגרתית. הסתננות ואקום מציעה יתרונות חדירה יד, הוא אינו תלוי רמת המיומנות של המפעיל ומאפשר החדירה של אזור רחב יותר של פני העלים. הליך זה משמש מסחרית לייצור בקנה מידה גדול של חלבונים התרופות14. פרוטוקול זה מנצל מכשירים חדירה ואקום בקלות ניתן לשכפול, אשר יכול להיות בנוי חלקים זמינים מסחרית. דבר זה מאפשר חדירה בו זמנית של עד 4 צמחים, מנקר מהירה ומעשית batch-wise חדירה של מאות צמחים בתקופה קצרה של זמן (איור 2 א -2b). מנגנון ואקום הסתננות מורכב תנור ואקום המהווה תא חדירה (2f איור). התנור מחובר משאבה באמצעות מאגר ואקום. זה מפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להשיג את הואקום הרצויה בבית הבליעה הסתננות. צמחים מאובטח ב בעל העידו והפכתי לתוך אמבט מים מפלדת 10 L מלא עם הבולם tumefaciens א (איור 2 א -2 c). טבילה מלאה חלקים אווירי של הצמחים חשוב חדירה יעיל. המים הרותחים הוכנסה בתוך תא חדירה (איור דו-ממדי -2e), את ואקום להחיל כדי לצייר את האוויר מתוך הרווחים interstitial עלה. ברגע הלחץ הופחת 880 mbar (תהליך אשר לוקח כ 1 דקות) תא הסתננות הוא החזיר במהירות הלחץ האטמוספרי 20-30 s על-ידי פתיחת שסתום כניסת את התנור, ואז חדירה הושלם.
חמישה ימים לאחר חדירה חומר צמחי מוכן עבור חילוץ האיסוף ובעקבות ובידוד של המוצר הרצוי. מנקודה זו התהליך הוא פשוט אחד מוצר טבעי מיצוי וטיהור מחומר עלה, זרימת עבודה המוכרת כל כימאי מוצר טבעי. שיטות שונות רבות הראשונית מיצוי וטיהור הבאים קיימים15. הבחירה המתאימה ביותר של שיטות בדיוק את אותם התנאים בשימוש תלויה מאוד התכונות הכימיות מסוים של המתחם של עניין, בנוסף זמינותו של מיומנויות ו/או ציוד. . זה לא ניתן לכלול בפרוטוקול זה שיטה להכליל באופן מלא, שלב אחר שלב העיבוד במורד הזרם של חומר צמחי שנקטפו עלה על מוצר בודד יכול להיות אחריו באופן עיוור על כל מוצר טריטרפן עניין, וגם זה יהיה מתאים כדי לנסות לעשות זאת. עם זאת, פרוטוקול זה יספק סקירה כללית של העבודה הבסיסי בשימוש המעבדה שלנו כמה שיטות בשלבים המוקדמים של התהליך, אשר מניסיוננו הוכיחו להכליל למוצרים טריטרפן אגליקון ביותר מחומצן. זה כולל שתי טכניקות נדיר יחסית, כלומר, חילוץ הממס בלחץ (פסי), ו שיטה נוחה שלב heterogenous להסרת כלורופיל באמצעות שרף יונים בסיסיים מאוד.
פסי היא טכניקה יעילה במיוחד לצורך הוצאת מולקולות אורגניות קטן ממטריצות מוצק. עקירות נעשות תחת לחץ (ca. 100-200 bar), היתרון העיקרי להיות היכולת להשתמש להקלה טמפרטורות אשר חורגים הרתיחה הצבע של הממס החילוץ. זה יכול להפחית באופן משמעותי את הזמן ואת כמות הממס הדרוש להשגת הוצאה ממצה, לעומת טכניקות אחרות ממס חם כגון refluxing פשוטה או עקירות Soxhlet16. מסחרי ספסל-העליון PSE כלים זמינים, אשר לנצל את תאי החילוץ להחלפה, הממס אוטומטיות טיפול חימום, ניטור. זה הופך את הטכניקה הזו מאוד נוח. . זה גם ניתן לטעון מסוכנים פחות, במיוחד עבור אופרטורים בעלי ניסיון בכימיה המעשית מוגבלת.
סיבון של תמציות עלה גולמי תחת ריפלוקס ואחריו נוזלי/נוזל למחיצות היא טכניקה נפוצה להסרת בצובר chlorophylls לפני טיהור עוקבות או ניתוח. עם זאת, זה לעיתים קרובות מבצעית דורשת הרבה על סולמות גדול יותר. יתר על כן, זיהוי של ממשק או אובדן המוצר עקב היווצרות של אמולסיות יכול להיות בעייתי. השימוש בחום בסיסי חילוף יונים-שרפים לבצע הידרוליזה heterogenous שלב יכול לשמש כתחליף נוח. החלק פיגמנט של כלורופיל הידרוליזה נשאר מודבקת שרף, ו ניתן להסיר רק באמצעות סינון. פרוטוקול זה מנצל עיבוד מפוח בקנה מידה של ההליך האנליטי שדווחה בעבר17 מעסיקה שרף יונים בסיסיים זמינים מסחרית.
להלן נתאר פרוטוקול מפורט, מהיר ומדויק לייצור בקנה מידה מפוח triterpenes ניצול פלטפורמה זו מבוססת על צמחים. פרוטוקול זה משמש באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי להכין עשרות למאות מיליגרם של המוצר טריטרפן מבודדים עבור יישומים כגון אפיון מבניים על-ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה ו / או המשך מחקר בפונקציונלי מבחני.
Protocol
הערה: לפני הבאים פרוטוקול זה, להכיר נתוני בטיחות חומרים עבור כל החומרים המשמשים, ולנקוט זהירות מתאימים. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים: משקפיים בטיחות בעבודה עם זכוכית תחת ואקום, וטיפול יבש סיליקה ג'ל בתוך ארון fume. . זה גם הכרחי כי חקיקה מקומית לגבי עבודה עם חומר מהונדס בדק, בחן, להלן לרבות הצורך תהליכי בלימה.
1. ליצור זנים tumefaciens א חדירה
הערה: אנו מספקים כאן תיאור מפושט של כל השלבים הדרושים להפקת מתאימים tumefaciens א זנים לביטוי ארעית. פרטים נוספים על פעולות אלה מתוארים על ידי סיינסבורי. et al. 8.
- להגביר באמצעות PCR או לסנתז חלבון קידוד האזור של הגן עניין ולצדו 5' ו 3' attB רצפים מתאים לדור של שיבוט ערך לשימוש עם רקומבינציה בייעודי לאתר שיבוט פרוטוקול18,19.
- השתמש פריימר לפנים: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, פריימר הפוכה: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN. = רצף מסוים רצף).
- להשתמש בתנאי ה-PCR (נציג): תגובת תערובת (25 µL, סה כ), מאגר (5 x, 5 µL, ראה טבלה של חומרים), dNTPs (10 מ"מ, 0.5 µL), פריימר לפנים (10 מיקרומטר, 1.25 µL), פריימר הפוכה (10 מיקרומטר, 1.25 µL), תבנית ה-DNA (הריכוז משתנה, 50 – 250 ng, 0.5 µL ), ה-DNA פולימראז (2000 U/mL, 0.25 µL, ראה טבלה של חומרים), מים ללא נוקלאז (כדי 25 µL). הפעל את thermocycler כדלקמן: דנטורציה הראשונית (98 ° C, 30 s); להתחיל מחזור (98 ° C, 30 s; 45 – 72 ° C, 20 s; 72 ° C, s 30/kb) לסיים את מחזור; מחזורים 35; הרחבה הסופי (72 ° C, 10 דקות).
- בצע של רקומבינציה בייעודי לאתר רגיל שיבוט פרוטוקול18,19 כדי ליצור שיבוט של כניסה באמצעות כל וקטור כניסה שאינה מבוססת על kanamycin (אנו משתמשים pDONR207 אשר זמין מסחרית).
הערה: התקינות של השיבוט ערך צריך להיות מאושרות על ידי רצף, לפני השימוש כדי לייצר pEAQ -HT-לבנות ביטוי DEST1. PEAQ -HT-DEST1 הינו זמין לפי בקשה מהמעבדה Lomonossoff במרכז ג'ון אינס נוריץ, אנגליה. - לבודד את pEAQ -HT-DEST1 וקטור של השיבוט הביטוי שנוצר צעד 1.1.3, ולאחסן ב-20 ° C לפני השימוש בשלב 1.3.
הערה: כל ערכת טיהור פלסמיד מבוססי עמודה ספין נוח זמינים מסחרית תוכנן עבור חילוץ פלסמידים של שיבוט זנים של החיידק מתאימה. עקוב אחר ההוראות הספציפיות של הטיהור פלסמיד שבחרת קיט (ראה טבלה של חומרים).
- . היכונו לשינוי כשיר מבחינה כימית tumefaciens א
- לחסן LB סלקטיבי של (לוריא-Bertani בינוני: 10 גרם/L מה נשארתי-טריפטון 10 גרם/ליטר NaCl, תמצית שמרים 5 g/L, אגר 10 גרם/ליטר pH 7.0) צלחת אגר (50 μg/mL ריפאמפיצין, סטרפטומיצין μg/מ ל), על ידי ומבטא tumefaciens א LBA4404 מתרבות מניות גליצרול. דגירה בין לילה ב 28 ° C בחממה עמידה.
- לחסן 50 מ של מדיה סלקטיבי LB נוזלי (50 ריפאמפיצין μg/mL, סטרפטומיצין μg/mL 100) באמצעות דגימה של תאים LBA4404 tumefaciens א מ שלב 1.2.1. דגירה בין לילה-28 מעלות צלזיוס חממה חזק ב 200 סל ד.
- מגניב התרבות מהשלב 1.2.2 על קרח למשך 10 דקות, ואז הצניפה התאים tumefaciens א על ידי צנטריפוגה-4 ° C ו- g x 4500 במשך 5 דקות (להשליך תגובת שיקוע).
- Resuspend בגדר של שלב 1.2.3 ב 1 מ ל תמיסה2 CaCl מימית כקרח 20 מ מ, חזור על השלב צנטריפוגה מהשלב 1.2.3 (להשליך תגובת שיקוע).
- Resuspend בגדר של שלב 1.2.4 ב 1 מ ל תמיסה2 CaCl מימית כקרח 20 מ מ ו- aliquot התליה שנוצר ב כדי 50 קבוצות µL. פלאש להקפיא את aliquots נוזלי N2 , חנות ב-80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- להפוך את מוכנה tumefaciens א LBA4404 עם pEAQ מבודדים -HT-DEST1 וקטורית שנוצרה בשלב 1.2.
- 50 µL tumefaciens א השעיה שנוצר בשלב 1.2 על הקרח להפשיר, דגירה עם 100 \u2012 200 ng של pEAQ מבודדים -HT-וקטור DEST1, שנוצר בשלב 1.1, ב-0 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- קר לזעזע את המתלים incubated מהשלב 1.3.1 נוזלי N2 ב-30 s, ואז אפשר לחמם לטמפרטורת החדר.
- להוסיף 200 μL בינוני SOC (SOC: 20 g/L מה נשארתי-טריפטון, תמצית שמרים 5 g/L, 0.58 g/L NaCl, 0.19 g/L אשלגן כלורי, 2.03 g/L MgCl2, 2.46 g/L מגנזיום גופרתי 7-הידרייט..., 3.6 g/L גלוקוז) כדי ההשעיה קר בהלם מכל צעד 1.3.2 ואת תקופת דגירה של h 4 28 ° ג ב חממה חזק ב 200 סל ד.
- לחסן צלחת אגר סלקטיבי ליברות (50 ריפאמפיצין μg/mL, 50 μg/mL kanamycin, סטרפטומיצין μg/mL 100) עם התרבות SOC מהשלב 1.3.3. מורחים ביסודיות ולאחר תקופת דגירה של 3 ימים-28 מעלות צלזיוס חממה עומד.
- לחסן 5 מיליליטר סלקטיבי מדיה ליברות (50 ריפאמפיצין μg/mL, 50 μg/mL kanamycin, סטרפטומיצין μg/mL 100) עם מושבה בודדת מ שלב 1.3.4. דגירה בין לילה-28 מעלות צלזיוס חממה חזק ב 200 סל ד.
- להוסיף 200 μL של גליצרול 1 מ"ל של התרבות נוזלי מהשלב 1.3.5, לערבב ביסודיות, לאחסן ב- 80 ° c
הערה: תרבות זו יכול והחיו לניסויים עתידיים ומבטא על פלטות אגר ליברות עם אנטיביוטיקה מתאימה (יפורט בהמשך).
2. מכינים הסתננות השעיה
- לחסן צלחת אגר LB סלקטיבית עם פסים של הרצוי זני tumefaciens א גליצרול במניה תרבויות שנוצר בשלב 1. דגירה בין לילה ב 28 ° C בחממה עמידה.
הערה: זן נושאת tHMGR בטווח pEAQ -HT-DEST1 וקטור עשויות גם הן להיכלל.- בנפרד לחסן 50 מ של מדיה LB סלקטיבית עם מדגם של כל זן tumefaciens א גדל בשלב 2.1, דגירה בין לילה-28 מעלות צלזיוס חממה חזק ב 200 סל ד.
- בנפרד להעביר התרבויות 50 מל מ שלב 2.1.1 עד 1000 מ ל סלקטיבי מדיה ליברות (ריפאמפיצין 50 μg/mL, kanamycin, 50 μg/mL סטרפטומיצין 100 μg/mL), דגירה בין לילה-28 מעלות צלזיוס חממה חזק ב 200 סל ד.
- גלולה בנפרד את tumefaciens א על ידי צנטריפוגה (4000 x g), מתרבויות נוזל שנוצר בשלב 2.1.2 (להשליך תגובת שיקוע).
- Resuspend כדורי מ שלב 2.1.3 ב 50 מ של מאגר MMA שזה עתה הוכנו בנפרד (MMA מאגר: חומצה-(N-morpholino)-ethanesulphonic 10 מ מ 2, pH 5.6 (KOH), 10 מ מ MgCl2, 150 μM 3'5 '-dimethoxy-4'-acetophenone) דגירה בטמפרטורת החדר החשכה לשעה.
- שלב האחסון המתאים של כל השעיה MMA tumefaciens א (שנוצר ב שלב 2.1.4) כדי לייצר OD סופית600 של 0.2 לפחות עבור כל זן ב 10 L הנפח הסופי הכולל.
- להוסיף מאגר MMA נוספים המתלים המשולב שנוצר בשלב 2.1.5 לאמצעי הסופי של 1 ליטר (שימוש מיד בשלב 3).
הערה: רצוי להכין L 2 נוספים של הסתננות השעיה על שמירה על רמת נוזלים במהלך תהליך הסתננות. - להכין 1 ליטר 10 x כוח MMA המאגר.
3. לבצע חדירה ואקום
הערה: ראה איור 2 תיאור בניית מכשיר ואקום הסתננות. השתמש בת שבוע 5 ש benthamiana צמחים בעציצים 9 ס"מ x 9 ס"מ עבור השלבים בהליך. שתילי צריך להיות שנזרעו F1 קומפוסט (למשל מ- Levington), גדל 2 שבועות לפני שהועבר ל סירים נפרדים המכילים F2 קומפוסט. צמחים צריך לגדול בחממה ב 25 ° C, h 16 לכל יום של אור (שימוש משלים תאורה בעת הצורך), מים מדי יום, צפיפות מקסימלית של 100 מפעלי/m2.
- העברה של 1 ליטר של השעיה הסתננות המופקים שלב 2 ו- 1 ליטר של 10 x כוח מאגר MMA לאמבטיה הסתננות, ואחריו L 8 נוספים של מים.
- הסר את הכנפיים ניתן להפרדה של בעל המפעל העידו, להוסיף 4 צמחים (בן בשבוע-5 צמחים ראה הערה לעיל) ולאחר לחבר מחדש את הכנפיים. היפוך המחזיק ומניחים על גבי האמבטיה חדירה כדי להטביע את העלים ההשעיה הסתננות.
הערה: להבטיח שרמת ההשעיה מגיע לפני השטח העליון של בעל המפעל. להעלות את הרמה עם התוספת של הבולם חדירה נוספת במידת הצורך. - להעביר את האמבטיה חדירה עם צמחים המשוקע תא הסתננות וסגור את הדלת. ודא שסתום היניקה אוויר סגורה על המסתנן. הפעל את משאבת ואקום ולאחר לפתוח את השסתום מוטבעת למאגר ואקום ואחריו שסתום היניקה ואקום-תא הסתננות.
- ברגע הלחץ בבית הבליעה הסתננות הפחיתה מאת 880 mbar, תסגור את השסתום צריכת ואקום ופתח את שסתום הכניסה של האוויר. ברגע תא הסתננות חזר הלחץ האטמוספרי, פתח את הדלת, ולהסיר את האמבט הסתננות.
- להעלות על בעל המפעל עד הצמחים כבר לא טובע ההשעיה הסתננות, ואז בעדינות לנער בעל כדי לאפשר ההשעיה עודף לברוח העלים בחזרה לתוך האמבט הסתננות.
- להחזיר את המחזיק במצב זקוף, להסיר את הכנפיים ניתן להפרדה והסר את הצמחים.
- חזור על שלבים 3.1.1 כדי 3.1.5 עד כבר חדרו מספר צמחים הרצוי.
- אוטוקלב ההשעיה הסתננות בשימוש לפני סילוק.
- אוטוקלב החדירה אמבטיה לפני שימוש חוזר בניסויים הבאים.
- לחטא את הפנים של החדר חדירה על-ידי ניקוי עם 70% אתנול ולהשאיר אוויר יבש לפני שימוש חוזר בניסויים הבאים.
- הסר את הכנפיים ניתן להפרדה של בעל המפעל העידו, להוסיף 4 צמחים (בן בשבוע-5 צמחים ראה הערה לעיל) ולאחר לחבר מחדש את הכנפיים. היפוך המחזיק ומניחים על גבי האמבטיה חדירה כדי להטביע את העלים ההשעיה הסתננות.
4. לגדל את הצמחים הסתנן
- לארגן את הצמחים הסתנן משלב 3-צפיפות מקסימלית של 100 מפעלי/m2 בחממה.
- לגדול במשך 5 ימים-25 ° C ו- h 16 לכל יום של אור (שימוש משלים תאורה בעת הצורך), ומים מדי יום.
5. הקציר העלים הסתנן
- לאחר 5 ימים של צמיחה, לקצור את העלים.
- אוטוקלב לבזבז חומר צמחי, סירים, אדמה לפני סילוק.
6. לייבש את העלים שנקטפו
הערה: ההליך המדויק lyophilization המתוארים להלן תלוי באופי של המנגנון lyophilization הזמינים הזמינים.
- Lyophilize את העלים שנקטפו עד יבש.
- מניחים את העלים שנקטפו בתוך תיק פוליפרופילן 2 מ מעבה. להקפיא את העלים שנקטפו על-ידי אחסון במקפיא-80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לנקב את השקית עם חורים קטנים רבים באמצעות מספר זיהוי אישי. המקום ארוחות קפואות משאיר החדר המרכזי של איזה שהוא לופילייזר. ודא כל הבקבוק מצורף הברזים סגורים, ולאחר מכן לעבור על איזה שהוא את לופילייזר. להבטיח הקבל מגיע לפחות-50 ° C ומפחית הלחץ כדי mbar לפחות 0.15 ולאחר מכן להשאיר למשך הלילה.
- . תכבה את איזה שהוא לופילייזר, לפרוק את הואקום על-ידי פתיחת ברז המצורף את הבקבוק. להסיר עלים מיובשים של החדר המרכזי, המשך לשלב 7.
7. מווסת החילוץ הממס
הערה: השלבים בהליך מתייחסים לשימוש של נגינה PSE זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים). נא לפנות לספרות היצרן לקבלת מידע מפורט יותר על הפעולה. הכלי מבצע 4 עקירות במקביל.
- לטחון את העלים יבשים לאבקה הקורס באמצעות שיטה נוחה (למשל, עבור רוב תרכובות טריטרפן עניין להשתמש מעבד מזון ביתי, או באופן ידני לרסק את העלים בזמן הכלול בתוך שקית).
הערה: שחיקה איחדו ובחומר מליטה תחת חנקן נוזלי אינה הכרחית בדרך כלל.- מערבבים את אבקת עלה עם חול קוורץ (\u2012 0.3 מ מ, 20% לפי נפח) במיכל מתאים; זה פועל כמו dispersant ומשפר את היעילות של תהליך החילוץ.
- הכנת מיצוי 4 תאים (120 מ ל) למילוי. בשביל זה, להפוך את התאים החילוץ והכנס את המסנן סיבי זכוכית, ואחריו את frit מתכת והחזקת הכנס. לחזור לתאים החילוץ זקוף הצב ומוסיפים שכבה עמוקה 1 ס מ של חול קוורץ (0.3 \u2012 מ מ).
- למלא את התאים החילוץ.
- למלא את התאים חילוץ עם אבקה מוכנה עלה שנוצר בשלב 7.1 עד לקו המילוי. אם יש צורך, בעדינות לדחוס את האבקה בתהליך זה כדי להקל על תוספת של כמות גדולה יותר בכל תא החילוץ.
- להוסיף שכבה קטנה של חול קוורץ (0.3 \u2012 מ מ) לחלק העליון של אבקת ארוזה, הוספה למסנן תאית העליון.
- הוספת התאים החילוץ ארוז מכשיר PSE ולהפעיל בשיטה הרצויה. השתמש בהגדרות הבאות חומר; הממס: 100% אתיל אצטט; טמפרטורה: 100 ° C, לחץ: 130 בר. לרוץ 3 מחזורים כדלקמן: מחזור 1: 0 דקות זמן, מחזור 2, 3: 5 דקות זמן, בסופו של דבר רצף הממס 2 דקות ו 12 דקות חנקן גז מיושרות.
הערה: רצוי קודם למטב את שיטת החילוץ בקנה מידה קטן. לעומת זאת, השיטה הבאה היא לעיתים קרובות מספיק עבור aglycones טריטרפן ביותר מחמצנים. המשקאות של כל תא החילוץ ניתן לשלב אותה הספינה אוסף חיצוני על-ידי ציון הקו פסולת כיעד החילוץ, במקום הקווים אוסף אישי רגיל. להיות מודע כמות הממס בשימוש תלויה אריזת תאי החילוץ ואת הטמפרטורה להגדיר לחץ. השיטה הנ ל בדרך כלל יוצר כ 800 מ ל ליקר חילוץ עבור 4 עקירות מקבילים. - חזור על שלבים 7.2 כדי 7.3.3 עד כל האבקה עלה תטופל.
- רכז המשקאות החילוץ משולב ליובש, באמצעות אידוי רוטרי תחת ואקום. בדוק הפלט הצפוי (קרי, slurry ירוק כהה).
הערה: הנוהל המדויק עשויים להשתנות בהתאם לקבוצת למעלה של המאדה זמינים. תמיד לענוד הגנה העין בעת ביצוע אידוי סיבוביים, לבדוק כלי זכוכית עבור נזק לפני העמדת תנאים ואקום.- להפעיל את recycler chiller, ולאפשר את הנוזל העברת חום לטמפרטורה לפחות 5 ° C. להפעיל את המים הרותחים, והגדר את הטמפרטורה 35 ° C.
- להעביר את האלכוהול החילוץ הבקבוק אידוי (אל תמלא יותר מחצי הנפח של הבקבוק). להתרכז המשקאות batch-wise (ב- הבקבוקון אותו) אם אמצעי האחסון הכולל עולה על זה. לצרף את הבקבוקון אידוי מלא אדי-צינור של המאדה סובב (מאובטח עם קליפ משותף).
- התאימו את המיקום להרים את הבקבוק ואת זווית, כדי להטביע התחתון השלישי + בקבוקי שתייה צידניות אידוי באמבט מים בבית כ 45 ° זווית. התחל את הבקבוקון מסתובב במהירות אשר מתחילה להתפשט המשקאות החילוץ על הקירות של הבקבוק.
- להבטיח הברז האוורור סגור ולהתחיל להפחית את הלחץ (באמצעות הבקר של המשאבה ואקום) עד טפטוף מתונה נצפית בין הבקבוק מעבה ומקלט.
הערה: אל תאפשר המשקאות החילוץ להתחיל להרתיח. אם מצב זה מתרחש להפחית את עוצמת הוואקום להביא זיקוק תחת שליטה. - לעקוב ולהתאים את המהירות ואקום הכוח ואת ספין לפי הצורך עד כל הממיס הוא התאדה.
8. בסיסי יונים שרף טיפול להסרת Chlorophylls
הערה: הכמויות מצוטט בשלבים הבאים להניח היקף העבודה המקורי של צמחים \u2012 150 100. שלב 8 אינו מתאים מוצרים המכילים חומצה קרבוקסילית קבוצות או קבוצות פונקציונליות זה הידרוליזה בתנאים בסיסיים כגון אסטרים.
- להמיס את תמצית גולמי שנוצר בשלב 7 באמצעי אחסון מינימלי של אתנול.
- להוסיף 50 מ של חרוזים שרף חילוף יונים בסיסיים (ראה טבלה של חומרים) הפלט של השלב 7.1.1 ו- shake בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
הערה: לא מחליפים רועד לשימוש של ערבוב המנגנון. תקורה מגנטי או מכני זע יכול להתפשר על היושרה של חרוזים שרף. עצבנות מתאימים גם בנוחות תושג על ידי סיבוב איטי של התגובה הבקבוק על המאדה עם שואב האבק להגדיר בלחץ אטמוספירי או מנותק. - הוספה של 50 מ ל נוספים של חרוזים שרף חילוף יונים בסיסיים כל 30 דקות עד התגובה איננו לסיום; החרוזים שרף חילוף יונים בסיסיים להשתנות מורוד לירוק בצבע ולאחר השלב הנוזלי ישתנו ירוק כתום או צבע חום עכור בהתאם מידה.
- במקרה של ספק זה התגובה נעלם עד לסיומו לטעום 0.5 מ"ל של הנוזל. לסנן את הדגימה דרך העמודה קטן של כדור הארץ diatomaceous ולבחון את צבע פילטרט; התגובה היא בדרך כלל מלאה בתוך 1.5 h.
- לסנן את התערובת התגובה דרך העמודה קצרה של הארץ diatomaceous.
- לבצע זאת באמצעות סינון אבק, או באמצעות כרומטוגרפיה פלאש זכוכית עמודה באמצעות מפוח יד כדי להפעיל לחץ. אם מאט את קצב הסינון, להפריע העליון של משטח כדור הארץ diatomaceous עם מוט מלהיב. לאסוף את פילטרט.
- יש לשטוף את החרוזים שרפים שנאספו עם אתנול, ואחריו 1:1 אתנול: הקסאן, ולבסוף הקסאן. השתמש אמצעי שטיפה מספיק כדי resuspend את החרוזים בראש העמודה diatomaceous הארץ.
- לשלב את פילטרט של מהשלב 8.4, של שטיפות מהשלב 8.5, להתרכז ליובש אידוי רוטרי תחת ואקום.
9. הראשונית Fractionation מחוספס
הערה: השיטה הבאה מתאים בדרך כלל טריטרפן מחמצנים טיפוסי aglycones, ומעסיקה מכשיר וואקום פלאש אוטומטי. עיין בספרות של היצרן לקבלת פרטים נוספים על המבצע.
- לספוח את המוצר גולמי שנוצר בשלב 8 על פלאש כיתה סיליקה ג'ל (גודל הנקבוביות: 60, גודל החלקיקים: 35 \u2012 75 μm) ליישום מחסנית כרומטוגרפיה פלאש באמצעות מתודולוגיה הטעינה יבש.
- להמיס את המוצר גולמי שנוצר בשלב 8 באמצעי אחסון מינימלי של הממס האורגני מתאימים. ודא התפרקות מוחלטת.
הערה: דיכלורומתאן עם התוספת של מספר טיפות של מתנול הוא בדרך כלל הבחירה המתאימה של הממס. - מהכיפה של מחסנית כרומטוגרפיה פלאש שמולאו מראש 100 גרם (ראה טבלה של חומרים), הסר את תותב כדי לחשוף את המרחב הראשי הטעינה יבש. להשתמש בשטח הראש כדי למדוד את נפח מתאים של סיליקה ג'ל לטעינה יבש.
- להעביר את הנפח נמדד של סיליקה ג'ל לטעינה יבש הפתרון של המוצר גולמי ולאחר מכן להסיר את הממס על ידי אידוי רוטרי תחת ואקום.
הערה: ג'ל סיליקה לחזור אבקה ללא הגבלה. לקראת סוף תהליך אידוי עדין גירוד עשוי להידרש כדי לשחרר את סיליקה ג'ל מהצד של הבקבוק אידוי. - Equilibrate הדיו כרומטוגרפיה פלאש 100 גרם ב- 100 מ ל/דקה לפחות 5 כרכים עמודה של 100% הקסאן, אבל אידיאלי עד התוכן מחסנית הוא אחיד באופן מלא wetted.
- להעביר את טעינת יבש מוכן סיליקה ג'ל שנוצר בשלב 9.1.3 למרחב הראשי הטעינה יבש של המחסנית כרומטוגרפיה פלאש equilibrated 100 גרם, על ידי מזיגת. ההשעיה הקסאן, פיפטה בפה רחב יכול לשמש כדי לסייע בהעברת כל הנותר יבש הטעינה סיליקה ג'ל.
- רטוב טעינת יבש שהועברו סיליקה ג'ל מיטה עם 100% הקסאן להסיר את האוויר קראוון הטעינה יבש.
- להפעיל את שיטת כרומטוגרפיה הבאים: ממס [א]: הקסאן, ממס [B]: אתיל אצטט, קצב הזרימה: 100 מ ל/דקה, הדרגתי: 0% [B] ל- 100% [B] מעל 3000 מ ל, אוסף: לאסוף את כל, גודל השבר: 250 מ ל.
- לנתח השברים על ידי שכבה דקה כרומטוגרפיה (TLC)8 או גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)8, ריכוז ליובש fraction(s) המכילה את המתחם עניין באמצעות אידוי רוטרי תחת ואקום.
- להמיס את המוצר גולמי שנוצר בשלב 8 באמצעי אחסון מינימלי של הממס האורגני מתאימים. ודא התפרקות מוחלטת.
- לבצע טיהור בסדר במורד הזרם עד הרמה הרצויה של טוהר.
הערה: טיהור בסדר במורד הזרם הנו ספציפי מורכבים לחלוטין וזה לא ניתן לספק שלבים מתוקנן (ראה הסעיף דיון).
Representative Results
התשואות מבודד טיפוסי תלויות השילוב אנזים/אנזים תחת חקירה, את היציבות הכימית של המתחם היעד, איך מאתגר את תהליך החיטוי היה. בעבר דיווחנו התשואות מבודד של β-amyrin נגזרים מן הניסויים שלנו ביוסינטזה קומבינטורית ועד 0.12 מ ג 3.87 גרם של יבש benthamiana ש אבקה. תרכובות אלו נע באופן נרחב רמת חמצון, וכללה שילובים לא טבעי של אנזימים (איור 3)8. פרוטוקול זה משמש באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לייצר עשרות או מאות מיליגרם של המוצר מטוהרים עבור אפיון מבניים NMR ספקטרוסקופיה ו מבחני פונקציונלי במורד הזרם. גם הראו את התועלת מפוח של פלטפורמה זו על-ידי הפקת 0.8 גר' טריטרפן לגרדום β-amyrin-טוהר של יותר מ-98%. ניסוי זה נעשה שימוש בצמחים 459, ומייצג של התשואה מבודד של 3.3 מ ג לגרם של יבש benthamiana ש העלה אבקת8.
איור 1: סיכום סכמטי. ייצוג סכמטי של תהליך ניצול הביטוי ארעית של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana ש עלה להטיית אנדוגני אספקה של 2, 3-oxidosqualene לכיוון לייצור מוצרים חדשים בעלי ערך גבוה טריטרפן מפוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ואקום המסתנן ובניה בתהליך.) העידו צמח בעל כנף אחד מנותק. b) Bespoke צמח בעל כנפיים המצורפת. c) היפוך, ועלייתו של צמחים. d) החדרת האמבט הסתננות. e) הסתננות אמבטיה במקום בתוך תא הסתננות. המסתנן ואקום f) ביצוע: משאבת ואקום (1) (2) התקשרות של משאבת ואקום כדי מאגר ואקום (3) ואקום מאגר בידוד שסתום (4) הקשר בין מאגר ואקום שסתום היניקה (7) (5) מד הלחץ (6) אוויר קאמרית הסתננות הסתננות קאמרית (8) ואקום המאגר. g) נציג עלים מצמח אחד שחדר עם לבנות ביטוי עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לאחר חמישה ימים שלאחר הסתננות צמיחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: בעבר דיווחו על תוצאות נציג לייצור מיכשור וציוד נגזרים β-amyrin באמצעות פרוטוקול זה8. טבלה זו הוא הורה על ידי תשואות מבודד. עמודות מעוצבים באופן מותנה עם צבע אינדיקציה הערך היחסי. אדום = גבוה, ירוק = נמוך (למרות ביניים צהוב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
הסתננות ואקום גבוה-דרך-הניח מאפשרת פרוטוקול זה לשמש באופן שגרתי במעבדה שלנו לייצור מיכשור וציוד של תרכובות טריטרפן עניין ליישומים שונים במורד הזרם. מנגנון ואקום הסתננות המתוארים כאן בקלות משוכפלת. תוספת של המאגר ואקום, מומלץ להקטין את הזמן הנדרש כדי למשוך את הואקום הכרחי, אולם ניתן פשוט מחדש תנור ואקום יאומתו כמו תא הסתננות. הגנה על משאבת ואקום באמצעות תוספת של הקבל מתאימים תיאורטית הגיונית, אבל במעבדה שלנו אנחנו גילינו שזה יהיה מיותר.
כיסוי הסתננות בסכנה אם העלים לא שקועים לחלוטין ההשעיה הסתננות. בעיה זו ממוזער על-ידי הבטחת כי הרמה של המתלה מגיע לפני השטח העליון של בעל המפעל, כי בעל המפעל הוא צר על האמבטיה הסתננות. הערה מאיור 2 כי המשטח העליון של בעל המפעל שקוע לאמבטיה הסתננות כאשר במקום. זו מושגת על ידי פאנלים על הקצוות האמצעי של בעל אשר מהווים נקודת העיגון עם החלק העליון של האמבטיה הסתננות. המתלה הסתננות יחייב תוספות תקופתיים כדי לשמור על רמת ההשעיה. זו מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי תוספת של חדירת עודפי ההשעיה כדי למנוע צמצום הדרגתי של ה OD600 במהלך החדירה batch-wise גדול. עם זאת, בידיים שלנו, החלפת מים לא נראה יש השפעה ניכרת על התשואות הצפויה בקנה מידה מפוח, אמנם זה לא היה quantitively חקר. ועמדו להסתנן כמה צמחים של אצווה אחת של הסתננות ההשעיה היא עדיין שאלה פתוחה. אנחנו באופן שגרתי לחדור בין צמחים 100 ו-200 עם אצווה בודדת של הסתננות ההשעיה. בנוסף, זה נורמלי עבור אדמה תסנן לתוך ההשעיה חדירה במהלך תהליך הסתננות. זה לא נמצאה השפעה ניכרת על הסתננות היעילות.
במשך הקציר. זה רצוי (אך לא קריטית) כדי לקצור רק העלים היו שחדרו (כמה עלים תהיה גדול שלאחר חדירה). בציר סלקטיבי מונע דילול עם רקמת יצרנית, אשר אחרת להגביר את היחס של זיהומים אנדוגניים יחסית למתחם של ריבית. זה יש השפעה הנומינלית על הקלות של טיהור במורד הזרם ומגביר את קנה המידה של תהליכים אלה. בעת שימוש tHMGR כדי להגביר את אספקת קודמן, הפנוטיפ necrosed נצפית לעיתים קרובות לפתח על התקופה שלאחר הסתננות צמיחה. זה נורמלי, למעשה מסייע בציר סלקטיבי, תהליך הייבוש במורד הזרם. ניתן לאחסן את האבקה עלים יבשים בדרך כלל במיכל אטום במקום קריר, יבש, חשוך, אבל באופן אידיאלי desiccator תחת ואקום. זה תלוי היציבות של המתחם של עניין. לנקוט זהירות אם בוחר לאחסן במקפיא-80 ° C. להבטיח את יבשים העלים הם במיכל עמיד למים, על הסרה של אחסון, לאפשר את המכל כדי לחמם לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה. כך תגרום rewetting של העלים, הפרעה עיבוד מטה-stream.
השלבים שלאחר הקציר של פרוטוקול זה ניתנים להמחשה, וניסיון כדי לסייע החוקרים האלה תהיה מוגבלת כימיה מעשית. הם הרבה מכדי רבים טכניקות החילוץ/טיהור אחרות מוצר טבעי. כמפורט במבוא, פסי יתרונות רבים, אולם הבירה עלות המנגנון PSE זמינים מסחרית ייתכן שהעלות ולאחר זה לא חיוני. טיפול בסיסי חילוף יונים-שרף היא שיטה מאוד נוח להחליף המסורתי סיבון ואחריו נוזלי/נוזל למחיצות. עם זאת, היא לא מתאימה עבור מוצרים המכילים חומצה קרבוקסילית קבוצות או קבוצות פונקציונליות זה הידרוליזה בתנאים בסיסיים, כגון אסטרים. מוצרים אלה יהיה צפוי יישמרו על שרף חילוף יונים בסיסיים. עם זאת, יש פוטנציאל לנצל את זה עבור לכידה, לשחרר את ההליך (לא מתועדים כאן). איפה סיבון מסורתי יהיה הולם, טיפול בסיסי חילוף יונים-שרף מגישה כתחליף נוח. כבר מצאו את שיטת כרומטוגרפיה שמתואר בשלב 9, ניתן להכליל עבור תרכובות המתואר באיור3. עם זאת, תרכובות של קוטביות מוגברת עשוי לדרוש 100% אתיל אצטט • תנאי תקופה ארוכה. התייחסות צעד 9.2, טיהור בסדר במורד הזרם הוא ספציפי מורכבים לחלוטין, הוא גם תלוי בקנה מידה. סיבובים חוזרים ונשנים של כרומטוגרפיה פלאש מידה קטן יותר עם מעברי צבע ממוטב, מספיקה בדרך כלל להשגת טוהר המתאים לניתוח NMR. על קשקשים גדולים, התגבשות לעתים קרובות חלופה נוחה. במקרים קשים, מפוח או מפוח למחצה ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) יכול להיות מועסק בהתאם לכמות הרצויה של המתחם מבודד. דוגמאות של תהליכי טיהור במורד הזרם עבור מגוון של תרכובות נציג ניתן למצוא במקום8.
בפרוטוקול הנוכחי, כפי שהוצג כאן, משמש באופן שגרתי במעבדה שלנו, הוכיח את השירות. עם זאת, ישנו טווח עדיין משמעותיים נוספים מיטוב של פלטפורמת הביטוי. עבודה מתמשכת במעבדה שלנו לחקור איך נוסף מסלול הנדסה, שליטה דיפרנציאלית על רמות ביטוי החלבון יכול לשפר טריטרפן הפקה נוספת, תוך תיווכה רעילות לתאים המארח. יש גם פוטנציאל לחקור המניפולציה של20,של מערכות תחבורה תאיים21, הכיוון של אנזימים תאים סלולריים שונים22,23, השדרות אשר יכול לשפר היעילות של אירועי חמצון מרובים. גם ניתן לסייר היתרונות הפוטנציאליים לפעילות שינוי המבנה הבסיסי של organelles מפתח. לדוגמה, ביטוי של התחום ממברנה של תודרנית לבנה HMGR נצפתה לזירוז היפרטרופיה של רשתית תוך-פלזמית צמחים24; אתר המפתח לפעילות CYP450. פרוטוקול זה הוא אידיאלי עבור הייצור של מיליגרם ל בקנה מידה גרם כמויות של מוצרים טריטרפן, יכול להיות מועסק במסגרת מחקר כדי לגשת תרכובות למחקר במורד הזרם (למשל, חקר מבנה-פעילות שיטתית קשרי הגומלין ולאחר חקירות ראשוני למאפיינים pharmacodynamic ו פרמוקוקינטיים של אחרים-ריאקטיבים עניין קליניים). עם זאת, הפלטפורמה היא לינארית, באופן אמין ומדרגי פשוט על-ידי הגדלת מספר צמחים בשימוש, ומעשיות של ביטוי חולף דרך agroinfiltration הוכח בקנה מידה תעשייתי לייצור של חלבונים התרופות 14, לפיכך יש פוטנציאל עבור הפלטפורמה שיורחבו לייצור מסחרי של triterpenes בעלי ערך גבוה. לחלופין, זה גם אפשרי לדמיין את הייצור של transformants יציב נושאת את המעבר biosynthetic הוחלף נגזר multigene הגדול יצורים עילאיים הרצון גיבוש, המאפשר גידול המוני והמשיך "חקלאות" של הטרנסגניים benthamiana ש זנים ייצור תרכובות שונות של ערך מסחרי.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי נוריץ מחקר פארק Studentship (הבן), הנדסת הג'וינט ואת המועצה מחקר מדעי/Biotechnological במימון מחקר מדעי ביולוגי, המועצה BBSRC OpenPlant סינתטי ביולוגיה המרכז לחקר הענק (BB / L014130/1) (M.J.S., ואחרות); ג'ון אינס מרכז הידע Exchange ומסחור הענק (BB/KEC1740/1) (בי); ואת המענק תוכנית אסטרטגית BBSRC מכון 'מולקולות מן הטבע' (BB/P012523/1) וקרן ג'ון אינס (ואחרות). ברצוננו להודות ג'ורג Lomonossoff למתן את הווקטורים pEAQ אנדרו דייוויס לצילום.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC-MS instrument | any | n/a | |
| Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
| Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
| Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
| Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
| Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Standing incubator | any | n/a | |
| Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
| Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
| 9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
| Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
| Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
| Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
| Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
| Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
| Balance (2 figures) | any | n/a | |
| Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
| A -80 freezer | any | n/a | |
| Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
| Safety glasses | any | n/a | |
| Lab coat | any | n/a | |
| Autoclave | any | n/a | |
| Consumables | |||
| Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
| Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
| Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
| Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
| Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
| Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
| Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
| Reagents | |||
| Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
| Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
| Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
| LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
| Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
| Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
| Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| Ethanol | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q water | any | n/a | |
| Levington F1 Compost | any | n/a | |
| Levington F2 Compost | any | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
| Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |
References
- Thimmappa, R., et al. Triterpene biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).
- Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins. Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).
- Roy, A., Saraf, S. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).
- Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).
- Liby, K. T., Sporn, M. B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease. Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).
- Yadav, V. R., et al. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer. Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).
- Christensen, L. P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).
- Reed, J., et al. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).
- Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).
- Peyret, H., Lomonossoff, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).
- Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
- Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).
- Voinnet, O., et al. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).
- Holtz, B. R., et al. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals. Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).
- Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).
- Kaufmann, B., Christen, P. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction. Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).
- Larsen, E., Christensen, L. P. Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables. Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).
- Sainsbury, F., et al. Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways. Methods Enzymology. , 185-202 (2012).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA Cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).
- Ting, H., et al. SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).
- Wang, B., et al. Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
- Nielsen, A. Z., et al. Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis. ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).
- Dong, L., et al. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209, 679-690 (2016).
- Ferrero, S., et al. Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells. Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).
