Summary
ベンサミアーナ タバコ葉の生合成酵素の過渡の異種発現は新トリテルペン高付加価値製品の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。ここは、トリテルペン、この強力な植物ベースのプラットフォームを活用した類縁体の急速 (5 日間) 分取スケールの生産のための詳しいプロトコルを記述しました。
Abstract
トリテルペン、最大の 1 つ、植物天然物のほとんどの構造的に多様な家族。多くのトリテルペン誘導体医薬関連の生物学的活性を有することが示されています。しかし、これまでこの可能性に翻訳はないクリニックでトリテルペンから派生した薬の茄多。これは間違いなく (少なくとも部分的に) 化合物のこのクラスに実用的な合成アクセスが制限の結果、問題の構造活性相関の探鉱・開発を抑えることができる伝統的な医薬品候補をリード化学のワークフロー。彼らの広大な多様性にもかかわらずトリテルペン、すべてから派生した単一の線形の前駆体 2, 3 オキシドスクアレン閉。(名) 植物の生合成酵素の過渡の異種発現は、自然このホストによって生成されるしない新しいトリテルペン高付加価値製品の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。農業-浸潤はある(名) ベンサミアーナに一過性発現を達成するための効率的な手段です。プロセスには、関心の式 construct(s) を運ぶアグロバクテリウムの懸濁液と植物葉の浸潤が含まれます。追加A. 根頭がんしゅ病菌の共同浸潤ひずみ運ぶ前駆体供給を大幅向上する酵素は増加するエンコード式構造が得られます。5 日間の期間の後浸透した葉の材料を収穫し、抽出し、結果として得られるトリテルペン製品を分離処理できます。これは、実験で使用される植物の数を増やすことによって単に直線的かつ確実にスケーラブルなプロセスです。ここにはこの植物ベースのプラットフォームを活用したトリテルペンの迅速分取スケール用プロトコルを記述しました。プロトコルは、植物の何百もの時間の短い期間での浸潤バッチを有効にする 4 つまでの植物の同時浸透を可能にする、簡単に複製可能な真空浸潤装置を利用しています。
Introduction
トリテルペン、最大の 1 つ、植物天然物のほとんどの構造的に多様な家族。彼らの広大な多様性にもかかわらずすべてトリテルペン天然物は同じ線形前駆体 2, 3-オキシドスクアレン、植物におけるメバロン酸経路の製品に由来すると考えられています。2, 3 オキシドスクアレンの環化反応を開始し、オキシドスクアレン閉環酵素 (受動) と呼ばれる酵素の家族によって制御されます。この環化反応ステップは、何百もの異なるトリテルペン足場性質1から報告されている、多様化の最初のレベルを表します。これらの足場はチトクローム p450 に限定されない、(CYP450s)1,2を含む酵素を調整することによってさらに多様化します。このような生合成経路は、巨大な複雑さ、時々 親トリテルペンからほとんど認識である最終製品の結果につながります。たとえば、tirucallane タイプ3の四環系トリテルペンから派生する強力な殺虫剤は、摂食のリモノイド アザジラクチンの複雑な構造が考えられています。
多くトリテルペンから派生した自然な製品であっても比較的そのまま親足場では、医薬関連生物活性4,5,6,7を所有する示されています。しかし、これまでこの可能性に翻訳はないクリニックでトリテルペンから派生した薬の茄多。これは間違いなく (少なくとも部分的に) 化合物のこのクラスに実用的な合成アクセスが制限の結果、問題の構造活性相関の探鉱・開発を抑えることができる伝統的な医薬品候補をリード化学のワークフロー。
(名) ベンサミアーナ葉に他の植物種のトリテルペンの生合成酵素の一過性の発現は、新しい高付加価値トリテルペン製品 (図 1) の製作に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。このプロセスは、候補酵素の機能的特徴し、重要な自然発生する代謝産物の生合成経路を再構築する使用することができます。同様に、この新規トリテルペン製品、構造活性相関の体系的な検証ができるように構造的に関連の類似のライブラリにつながる戦略を生成する生合成アプローチの組合せでも悪用することができます。生物学的活性の鉛の化合物の8,9。
Agroinfiltration は(名) ベンサミアーナ葉に一過性発現を達成するための効率的な手段です。プロセスには、関心の二項式 construct(s) を運ぶA. 根頭がんしゅ病菌の懸濁液で葉の浸潤が含まれます。これは、気孔、細胞間隙に空気を追い出し、 A. 根頭がんしゅ病菌のサスペンションの交換を介して液体を強制する圧力のアプリケーションを介して達成されます。細菌は、浸透した葉のティッシュのローカライズと一時的な蛋白質の表現の結果として、植物細胞の内部にそれぞれ T Dna を転送します。
適切な任意のバイナリ ベクトル中利用可能な一過性発現に使用されるかもしれない遺伝子組換え植物を生成するササゲ モザイク ウイルス CPMV から派生したHypertranslational (HT) タンパク質発現システム10, 11. このシステムでは目的の遺伝子が隣接している非翻訳領域 (UTR) CPMV RNA 2 から。5' UTR ウイルス複製12への依存なしで非常に高いレベルのタンパク質翻訳結果の変更が含まれています。この手法は、プロトコルと互換性のある構成要素 (pEAQ -HT- DEST)10,11をクローニング部位特異的組換えを含む (pEAQ) 簡単および簡単な二進ベクトル シリーズに開発されています。ほとんど pEAQ ベクトルもトマトふさふさしたスタント ウイルス由来 P19 サイレンシング抑制遺伝子13 coinfiltrate 別 P19 運ぶひずみする必要性を回避して非常に支払う式カセットの T-DNA 部分内に含むホストの高度な蛋白質の表現は植物細胞10,11です。
(名) 植物の使用発現用宿主植物の生合成経路を操作するとき特定の利点があります。セル アーキテクチャは、本質的に適切な mRNA やタンパク質の処理と必要な共同酵素、還元酵素 (CYP450s) の代謝前駆体を有するほか、適切な区分をサポートします。炭素源は光合成です。したがって、植物は、単に入力として水 CO2 (空気) から、日光を必要とする良質の堆肥で栽培できます。プラットフォームはまた、共発現蛋白質のさまざまな組み合わせのため非常に便利なA. 根頭がんしゅ病菌、大規模な発現式を構築する必要性を否定することの異なった緊張の共同含浸による facilely これ達成することができます。カセット。さらに、プロセス直線的かつ確実にスケールできます実験で使用される植物の数を増やすことによって単に。
私たちの研究室の前の仕事は、分取スケール実験は、このプラットフォームの有用性を実証しています。これは隔離された製品のグラム量を達成するためを新規トリテルペンの活性アッセイおよびスケールで使用するための準備を含まれています。さらに、異種トリテルペン製品の蓄積を増やすことができますいくつかはレート制限還元酵素 (tHMGR)、3-ヒドロキシ 3-methyglutary-コエンザイムの N ターミナル切り捨て、フィードバックを区別しないフォームの共発現によるフォールド上流メバロン酸経路8酵素。
このような分取スケール実験の鍵は、浸透過程のアップ スケールを便利にする機能です。典型的な実験で何百もの植物の数十は、分離製品の目標量を達成するために必要があります。運用要求、および多くの場合たいへん時間がかかりますが (言うまでもなく注射器を使用して) 個々 の葉を手で浸潤レンダリングこの手法を日常のスケール アップのため実用的ではないです。真空浸潤は演算子のスキルレベルには依存しないにより、葉の表面のより大きい区域の浸透と手浸潤上の利点を提供しています。この手順は、製薬タンパク質14の大規模な生産のため商業的に使用されます。このプロトコルは、市販部品から構築することができます簡単に複製可能な真空浸潤装置を利用しています。これにより、迅速かつ実用的なバッチ浸透植物の何百もの時間の短い期間で主事まで 4 つの植物の同時浸透 (図 2 a -2b)。浸潤の商工会議所 (図 2 f) を形作る真空オーブン真空浸潤装置で構成されます。オーブンは、真空リザーバーを介してポンプに接続されます。これは、浸潤室で必要な真空を達成するために必要な時間を大幅に削減します。植物は特注のホルダーで保護、 A. 根頭がんしゅ病菌の懸濁液でいっぱい 10 L のステンレス製水槽に反転 (図 2 a -2 c)。植物の地上部の完全な浸漬は、効率的な浸透のため重要です。浸潤チャンバ内で風呂の水を入れます (図 2 d -2e)、および空気を引き出す葉間質性スペースに適用される真空。880 mbar (約 1 分かかりますプロセス) によって圧力が減った後浸透室に戻されるすぐに大気圧の浸透が完了するとすぐにオーブン入口弁を開くことによって 20-30 秒。
5 日後植物材料は収穫とその後の抽出とご希望のプロダクトの分離の準備ができて。この点から、プロセスは単に天然物抽出・精製葉材の天然物化学者になじみのあるワークフローの 1 つです。初期抽出とそれに続く浄化のための多くの異った方法には、15が存在しています。正確な条件・方法の最も適切な選択はスキルや機器の可用性に加えて、興味の化合物の特定の化学的性質に大きく依存。完全に一般化、ステップバイ ステップ、関心のトリテルペン製品の盲目的に続くことができる分離製品に収穫された植物葉材料の下流の処理法はこのプロトコル、不可能はないだろうそれこれを行うにしようとする適切です。ただし、このプロトコルは、当研究室と私たちの経験で最も酸素アグリコン トリテルペン製品の汎化可能な証明しているプロセスの初期の段階のいくつかのメソッドで使用される基本的なワークフローの概要を提供します。これは、2 つの比較的稀な技術、すなわち、高圧溶媒抽出 (PSE)、強塩基性のイオン交換樹脂を用いたクロロフィル除去のための便利な異種相法を含まれます。
PSE は、固体マトリックスからの小さな有機分子の抽出の非常に効率的な手法です。圧力 (約100-200 bar) の下での抽出が実行されます、沸騰を超える緩和の温度を使用する能力をされている主な利点は、抽出溶媒のポイントします。時間と単純な還流またはソックスレー抽出16など他のホット溶剤技術と比較されたとき完全な抽出を達成するために必要な溶媒の量が大幅に削減することができます。商業ベンチ上 PSE 器具があります、交換可能な抽出セル、および自動溶剤処理、加熱、および監視を利用しました。これはこのテクニックを非常に便利になります。また、間違いなく少ない危険、特に限られた実用的な化学の経験を持つ演算子です。
還流液液分配が続く原油葉抽出物の鹸化はそれに続く浄化や分析の前にクロロフィルの一括除去のための一般的な手法です。しかし、この厳しいことがしばしばする運用より大きいスケールで。さらに、インターフェイス、またはエマルジョンの形成による製品の損失の検出が問題となります。異種相加水分解を実行する強塩基性イオン交換樹脂の使用は、便利な代替手段として使用できます。加水分解のクロロフィルの色素部分は樹脂に付着のまま、単に濾過により除去することができます。このプロトコルは、市販の塩基性イオン交換樹脂を採用しています以前に報告された分析手順17の分取スケール適応を利用しています。
以下この植物ベースのプラットフォームを活用したトリテルペンの分取スケールの生産のための詳細なプロトコルについて述べる。このプロトコルを使って定期的に当研究室で核磁気共鳴 (NMR) 分光法によるそのような構造解析用十分離トリテルペン製品のミリグラムの何百もの準備および/または機能でさらに研究を試金。
Protocol
注:このプロトコルを実行する前に使用すると、すべての物質の化学物質等安全データを熟知し、適切な安全対策を講じる。これらは含みますに限定されない: 真空下でガラスを使用する場合、安全メガネを着用し、発煙食器棚で乾燥シリカゲルを処理します。また、含む次適切な封じ込めプロシージャ、遺伝子組換え素材の使用に関する地域の法律がチェックされ、観察は不可欠です。
1. A. 根頭がんしゅ病菌系統の浸透のための生成します。
注:我々 はここで適したA. 根頭がんしゅ病菌の生成するために必要な手順の簡単な説明を提供する一過性発現の系統。これらの手順の詳細については、セインズベリーらによって記述されます。8。
- PCR によって増幅したり、タンパク質コード領域のクローニング プロトコル18,19部位特異的組換えの両脇に 5' と 3' attB 配列用エントリ クローンの生成に適したによって興味の遺伝子を合成します。
- 前方のプライマーを使用して、: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN、逆プライマー: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN. シーケンス特定の順序を =)。
- (代表) PCR 条件を使用: 反応混合物 (25 μ L、合計)、バッファー (5 x、5 μ L、参照テーブルの材料)、dNTPs (10 mM、0.5 μ L)、前方のプライマー (10 μ M、1.25 μ L)、逆プライマー (10 μ M、1.25 μ L) テンプレート DNA (可変濃度、50-250 ng、0.5 μ L)、DNA ポリメラーゼ (2000 U/mL、0.25 μ L、材料表を参照してください)、ヌクレアーゼ フリー水 (25 μ L)。たちを次のように実行: 初期変性 (98 ° C、30 s);サイクルを開始 (98 ° C、30 s; 45-72 ° C、20 s; 72 ° C、30 秒/kb) サイクルを終了35 サイクル最終的な拡張 (72 ° C, 10 分間)。
- クローニング プロトコル18,19 (市販である pDONR207 を使用)、非カナマイシン ベース エントリ ベクトルを使用してエントリのクローンを生成する標準的な部位特異的組換えに従ってください。
注:PEAQ-HTを生成する使用する前に、シーケンスによってエントリ クローンの整合性を確認すべき-DEST1 式構造。PEAQ-HT-DEST1、ノリッチ、イギリスのジョン Innes の中心で Lomonossoff の研究室からのリクエストも承ります。 - PEAQ-HTを分離-DEST1 ベクトル生成式クローンから 1.1.3 をステップし、手順 1.3 で使用する前に-20 ° C で保存します。
注:エシェリヒア属大腸菌の菌株をクローニングからプラスミドを抽出するために設計された市販の便利なスピン カラムベースのプラスミド精製キット、適しています。従って選ばれたプラスミッドの浄化の具体的な指示はキット (材料の表を参照してください)。
- 変換の化学的に有能なA. 根頭がんしゅ病菌を準備します。
- 選択的な LB を接種する (ルリア ベルターニカミラ媒体: 5 g/L 酵母エキス、10 g/L、塩化ナトリウム 10 g/L バクト トリプトン寒天 10 g/L pH 7.0) 寒天 (50 μ g/mL リファンピシン, 100 μ g/mL ストレプトマイシン) グリセロール ストック文化からA. 根頭がんしゅ病菌LBA4404 をストリー キングで。立ってのインキュベーターで 28 ° C で一晩インキュベートします。
- A. 根頭がんしゅ病菌LBA4404 ステップ 1.2.1 から細胞のサンプルを選択液体 LB 培地 (50 μ g/mL リファンピシン、100 μ g/mL ストレプトマイシン) の 50 mL を接種します。28 ° c 200 rpm での振動のインキュベーターで一晩インキュベートします。
- 1.2.2 10 分間氷の上のステップから文化を冷却し、4 ° C および 5 分 (破棄上清) 4500 × g で遠心分離によってA. 根頭がんしゅ病菌の細胞をペレットします。
- 冷たい 20 mM CaCl2水溶液のステップ 1.2.3 で 1 mL からペレットを再懸濁します、(破棄上清) ステップ 1.2.3 から遠心分離手順を繰り返します。
- 50 μ L のバッチに冷たい 20 mM CaCl2水溶液の因数で結果サスペンション ステップ 1.2.4 で 1 mL からペレットを再懸濁します。フラッシュは、使用前に液 N2 -80 ° c 店の因数を固定します。
- 変換準備A. 根頭がんしゅ病菌分離 pEAQ-HTと LBA4404-DEST1 ベクトル ステップ 1.2 で生成されます。
- 手順 1.2 を氷の上で生成されたA. 根頭がんしゅ病菌の懸濁液 50 μ L を解凍し、分離 pEAQ-HTの 100 \u2012 200 ng と孵化-DEST1 ベクトル、5 分の 0 の ° C で 1.1、ステップで生成されます。
- コールド ショック 30 液体 N2のステップ 1.3.1 から孵化懸濁液 s、その後常温にすることができます。
- 200 μ L の SOC 培地を追加 (SOC: 20 g/L バクト-トリプトン、5 グラム/L の酵母エキス、0.58 g/L 塩化ナトリウム 0.19 g/L KCl、2.03 g/L MgCl2、2.46 g/L 硫酸マグネシウム 7 水和物、ブドウ糖 3.6 g/L) からコールド ショックを懸濁液にステップ 1.3.2 と 28 ° で 4 時間インキュベート200 rpm で揺れのインキュベーターで C。
- 1.3.3 のステップから SOC 文化と選択的 LB 寒天培地プレート (50 μ g/mL リファンピシン、50 μ g/mL カナマイシン、100 μ g/mL ストレプトマイシン) を接種します。徹底的に、広がり、立ってのインキュベーターで 28 ° C で 3 日間孵化させなさい。
- 1.3.4 のステップから単一コロニーを選択 LB 培地 (50 μ g/mL リファンピシン、50 μ g/mL カナマイシン、100 μ g/mL ストレプトマイシン) 5 mL を接種します。28 ° c 200 rpm での振動のインキュベーターで一晩インキュベートします。
- 1.3.5 のステップから液体文化の 1 mL にグリセロールの 200 μ L を追加、混和、-80 ° C で保存
注:この文化は、LB 寒天培地プレート (後述) 適切な抗生物質でストリー キングで将来実験のため復活すること。
2. 浸潤懸濁液を準備します。
- 目的の縞と選択的 LB 寒天培地プレートを接種するA. 根頭がんしゅ病菌菌株グリセロールからストック手順 1 で生成されたカルチャ。立ってのインキュベーターで 28 ° C で一晩インキュベートします。
注:PEAQ-HT内でtHMGRを運ぶひずみ-DEST1 ベクトルも含まれます。- 個別に手順 2.1 で成長した各A. 根頭がんしゅ病菌菌株のサンプルと LB 培地 50 mL を接種し、28 ° c 200 rpm での振動のインキュベーターで一晩インキュベート.
- 個別にステップ選択 LB 培地 (リファンピシン 50 μ g/mL、カナマイシン、50 μ g/mL ストレプトマイシン 100 μ g/mL) の 2.1.1 に 1000 mL から 50 mL の文化を転送し、200 rpm で揺れのインキュベーターで 28 ° C で一晩インキュベート.
- 2.1.2 (破棄上清) のステップで生成される液体文化から遠心分離 (4000 x g) によってA. 根頭がんしゅ病菌を個別にペレットします。
- 個別にステップ 2.1.3 で 50 mL の作りたての MMA バッファーからペレットを再懸濁します (MMA バッファー: 10 mM 2-(N-morpholino) ethanesulphonic 酸、pH 5.6 (KOH) 10 mM MgCl2、150 μ M 3'5 '-ジメトキシ-4'-アセトフェノン) し、室温でインキュベート1 h の闇。
- 少なくとも 0.2 10 L 合計最終巻でそれぞれの株の最終的な OD600を生産する各のA. 根頭がんしゅ病菌の MMA サスペンション (2.1.4 で生成されたステップ) の適切な量を兼ね備えてください。
- 1 L (すぐに手順 3 で使用) の最終巻に 2.1.5 ステップで生成される結合された懸濁液に追加の MMA バッファーを追加します。
注:浸透過程における液体のレベルを維持するための浸透の懸濁液の追加 2 L を準備することをお勧めします。 - 10 x 強度 MMA バッファーの 1 L を準備します。
3. 真空浸透を実行します。
注:真空浸潤装置建設の説明の図 2を参照してください。5 週齢を使用進む手順 9 cm × 9 cm ポット(名) 形質転換植物。苗を (例えばLevington から) F1 堆肥に播種し、F2 堆肥を含む個々 のポットに転送される前に 2 週間のために栽培する必要があります。植物は、100 個体/m2の最大密度光 (補助照明必要時使用)、水の毎日、1 日あたり 16 h の 25 ° C の温室で成長する必要があります。
- ステップ 2 と x 強度 MMA バッファー追加の 8 L の水に続いて、浸潤のお風呂に 10 の 1 L で生成された浸潤懸濁液 1 L を転送します。
- オーダーメイド プラント ホルダーの着脱式の翼を取り外して挿入 4 植物 (5 週古い植物は、上記のメモを参照)、翼に接続し直します。ホルダーを反転し、浸潤の懸濁液で葉を水中に沈めるために浸潤お風呂の上に置きます。
注:懸濁液レベルに達する植物ホルダーの上面を確認します。必要な場合は、余分な浸透の懸濁液を追加してレベルを上げます。 - 浸潤室に沈水植物と浸透浴を転送し、ドアを閉じます。確実に、侵入者に吸気弁を閉じる。真空ポンプをオンにし、浸潤チャンバーの真空の吸気バルブに続いて真空リザーバーにインライン バルブを開きます。
- 880 mbar に浸潤チャンバー内の圧力は減りますが後、真空吸気バルブをシャット ダウンし、吸気弁を開きます。浸潤室は大気圧に戻ると、一度ドアを開き、浸透浴を取り外します。
- 植物はもはや浸潤サスペンションに沈んでいるし、余分な懸濁液浸潤お風呂に葉をオフに実行するを許可するようにホルダーを軽く振るまで植物ホルダーを上げます。
- ホルダーを直立の位置に戻り、取り外し可能な翼、植物を取り外します。
- 植物の必要な数に潜入されておりまで、手順 3.1.1 に 3.1.5.
- オートクレーブ廃棄の前に使用される浸透サスペンション。
- オートクレーブ浸透はその後の実験で再利用する前にお風呂します。
- 70% のエタノール洗浄による浸潤室の内部を殺菌し、空気に残して乾燥前にその後の実験で再利用。
- オーダーメイド プラント ホルダーの着脱式の翼を取り外して挿入 4 植物 (5 週古い植物は、上記のメモを参照)、翼に接続し直します。ホルダーを反転し、浸潤の懸濁液で葉を水中に沈めるために浸潤お風呂の上に置きます。
4. 浸透した植物を育てる
- 温室で 100 個体/m2の最大密度でステップ 3 から浸透した植物を配置します。
- 毎日 25 ° C で 16 時間、水と光 (補助照明必要時使用)、日 1 5 日間の成長します。
5. 浸透した葉を収穫します。
- 成長の 5 日後に、葉を収穫します。
- オートクレーブ廃棄物の植物材料、鍋、および廃棄の前に土。
6. 収穫した葉を乾燥させます。
注:以下の正確な凍結乾燥手順は、利用可能な利用可能な凍結乾燥装置の性質に依存します。
- 収穫した葉を乾燥するまで凍結乾燥します。
- 2 mm 厚のポリプロピレン袋に収穫した葉を配置します。収穫した葉を固定するには、30 分間-80 ° C のフリーザーで保存します。
- Pin を使用して多くの小さな穴と袋に穴を開けます。場所は、エアカーテンの中央の部屋で袋詰め冷凍葉します。水栓フラスコの添付ファイルをすべて閉じているし、エアカーテンに切り替えてを確認します。コンデンサー、少なくとも-50 ° C に達すると、少なくとも 0.15 mbar へ圧力の軽減を確保し、一晩おきます。
- 電源、エアカーテン、フラスコ添付ファイル タップを開いて真空を発散します。中央の部屋から乾燥した葉を削除し、手順 7 に進みます。
7. 高圧溶媒抽出
注:市販 PSE 楽器の使用を参照して続行手順 (材料の表を参照してください)。操作の詳細について、製造元の文献を参照してください。楽器は、並列に 4 の抽出を行っています。
- 便利なメソッドを介してコース パウダーに乾燥した葉を挽く (国内フード プロセッサを使用して、または手動で袋内に含まれる間葉を粉砕など興味のほとんどのトリテルペン化合物)。
注:乳棒と乳鉢液体窒素による研削は通常必要ではありません。- リーフ パウダーを混ぜて適当な容器; の石英砂 (0.3 \u2012 0.9 mm、容積 20%)これは分散剤として機能し、抽出処理の効率を向上させます。
- 4 抽出細胞 (120 mL) を充填に備えます。このため、抽出セルを反転し、ガラス繊維フィルター、金属釉薬に続いて、プラグを保持を挿入します。直立する抽出セル位置と石英砂の 1 cm 深い層を追加 (0.3 \u2012 0.9 mm)。
- 抽出セルに入力します。
- 充填ラインまで手順 7.1 で生成された準備ができて葉粉末を抽出セルに入力します。必要な場合、優しく各抽出セルに大きな額の追加を容易にするこのプロセス中に粉体を圧縮します。
- 水晶砂の小さなレイヤーを追加 (0.3 \u2012 0.9 mm) 粉と挿入トップ セルロース フィルターのトップへ。
- PSE 機器でパックされた抽出セルを挿入し、目的のメソッドを実行します。次の設定と素材を使用します。溶剤: 100% 酢酸エチル;温度: 100 ° C、圧力: 130 バー。3 つのサイクルを次のように実行: 1: 0 の最小保持時間、サイクル 2 および 3:5 分保持時間、2 分溶媒フラッシュで終了のサイクルし、12 分窒素ガスのフラッシュ。
注:まず小さな規模で抽出を最適化することをお勧めします。ただし、次のメソッドは、通常、最も酸化トリテルペン度の増加のため十分です。各抽出セルから酒は、同じ外部コレクション容器内標準個々 のコレクション ラインではなく、抽出先として廃棄ラインを指定することによって結合できます。溶剤の使用量、抽出細胞と設定温度と圧力のパッキングに依存して認識します。上記の方法は通常 4 並列抽出抽出液の約 800 mL を生成します。 - リーフ パウダーのすべてが処理されるまで、手順 7.2 に 7.3.3。
- 乾燥、真空下で回転蒸発を介して複合抽出液を集中します。(すなわち、暗い緑スラリー) の予想される出力を確認します。
注:正確な手順は利用ロータリーエバポレーターのセットによって異なる場合があります。常に回転蒸発の際に目の保護具を着用し、真空条件を施す前にガラス破損を確認します。- 冷凍機リサイクラーを有効にでき、少なくとも 5 ° C に冷却する熱伝達液体風呂の水をオンにし、35 ° c. に温度を設定
- 抽出液を蒸発フラスコに転送 (フラスコの半分以上のボリュームを記入しないでください)。Batch-wise 酒を集中 (で同じフラスコに) 合計量がこれを超える場合。(ジョイント クリップで固定)、ロータリーエバポレーターの蒸気管に塗りつぶされた蒸発フラスコを接続します。
- フラスコ リフト位置と下部が水没するように角度を調整水のお風呂での蒸発フラスコの 3 番目を約 45 ° の角度。フラスコ フラスコの壁を抽出液を普及し始めている速度で回転を開始します。
- 口タップが閉じていることを確認し、(真空ポンプのコント ローラーを使用して) 圧力を減らすために開始コンデンサーとレシーバーのフラスコの間適度な点滴が観察されるまで。
注:抽出液が沸騰を開始できないようにします。これが発生した場合は、制御の下で蒸留させる真空の強さを減らします。 - 監視し、すべての溶剤が蒸発するまで適切な真空の強度とスピンの速度を調整します。
8 クロロフィルの除去のための塩基性イオン交換樹脂処理
注:次の手順で引用される数量は、100 \u2012 150 植物の元の作業規模を想定しています。手順 8 は、カルボン酸基やエステルなどの基本的な条件の下で加水分解、官能基を含む製品に適したはありません。
- 最小量のエタノールで手順 7 で生成された粗抽出物を溶解します。
- ステップ 7.1.1, と 30 分間室温で振るの出力に 50 mL の塩基性イオン交換樹脂ビーズ (材料の表を参照) を追加します。
注:攪拌装置の使用のため揺れを代用しないでください。磁気または機械的オーバーヘッド攪拌は、樹脂ビーズの整合性を損なうことができます。適切な撹拌も便利な可能であるロータリーエバポレーターで反応フラスコの低速回転真空切断または大気圧で設定。 - まで完了するまで反応が消え、塩基性イオン交換樹脂ビーズ 30 分毎の追加の 50 mL を追加します。塩基性イオン交換樹脂ビーズ ピンクからの色の緑に変更され、液相がグリーンからオレンジや規模によって濁った茶色の色に変更されます。
- 反応が完了になっている疑いがある場合、液 0.5 mL のサンプルします。珪藻土の小さな列サンプルのフィルターし、; 濾液の色を観察反応は通常 1.5 時間以内完了です。
- 珪藻土の短い列を反応混合物をフィルター処理します。
- 真空ろ過、または手ベローズを使用して圧力を適用するガラス フラッシュ クロマトグラフィー コラム経由でこれを実行します。ろ過速度が遅くなる場合は邪魔攪拌棒で珪藻土パッドの上部です。濾液を収集します。
- 続いて、1:1 エタノール: ヘキサンと最後にヘキサン、エタノールで収集した樹脂ビーズをすすいでください。珪藻土カラムの上にビーズを再懸濁しますに十分なリンス ボリュームを使用します。
- 8.4 のステップから濾液とステップ 8.5 からリンスを組み合わせるし、真空下で回転蒸発によって乾燥に集中。
9. 最初の大まかな分別
注:次のメソッドは通常典型的な酸化トリテルペン度の増加のために適切、自動フラッシュ クロマトグラフィー装置を採用しています。操作の詳細について、製造元の文献を参照してください。
- フラッシュ グレード シリカゲルに手順 8 で生成された粗製品を吸着 (細孔サイズ: 60 Å、粒子径: 35 \u2012 75 μ m) 乾燥読み込み手法を介してフラッシュ クロマトグラフィー カートリッジへの適用のため。
- 適当な有機溶媒量が最小限で手順 8 で生成された粗製品を溶解します。完全な分解を確認します。
注:ジクロロ メタンをメタノールを数滴加えて、通常溶剤の適切な選択肢です。 - 100 g 事前フラッシュ クロマトグラフィー カートリッジの上部を外し (材料の表を参照) と乾燥の読み込みヘッド スペースを明らかにするカバーを取り外します。ヘッド スペースを使用して、シリカゲル乾燥のローディングのための適切な量を測定します。
- 原油製品のソリューションにシリカゲル乾燥のローディングのための測定のボリュームに転送し、溶媒を真空下で回転蒸発によって削除します。
注: シリカゲルは自由に流れる粉に戻ります。蒸発プロセス穏やかスクレーピングの終わりに向かって蒸発フラスコの側からシリカゲルを解放する必要があります。 - カートリッジ コンテンツが完全にそして均一に接するまでは理想的な場所、少なくとも 5 列 100% ヘキサン量 100 mL/分で 100 g フラッシュ クロマトグラフィー カートリッジを平衡します。
- 注ぐことによって平衡 100 g フラッシュ クロマトグラフィー カートリッジの乾燥読み込みヘッド スペースに 9.1.3 手順で生成された準備ができて乾燥読み込みシリカゲルを転送します。ヘキサンと広い口広ピペットの懸濁液は、残りの乾燥読み込みのシリカゲルの転送を支援するために使用できます。
- 転送乾燥読み込みシリカゲル ベッド乾燥読み込みヘッドから空気を除去する 100% ヘキサン湿式。
- 次のクロマトグラフィー法を実行: 溶媒 [A]: ヘキサン、溶媒 [B]: 酢酸エチル、流量: 100 mL/分、グラデーション: 0% 100% [B] 3000 mL 以上コレクション [B]: すべて、分数サイズの収集: 250 mL。
- 真空下で回転蒸発を介して目的の化合物を含む fraction(s) 薄層クロマトグラフィー (TLC)8またはガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC/MS)8乾燥に集中して分数を分析します。
- 適当な有機溶媒量が最小限で手順 8 で生成された粗製品を溶解します。完全な分解を確認します。
- 純度の所望のレベルに達するまで、下流側の良い浄化を実行します。
注:下流の高級精製は完全化合物の特定、標準化された手順 (ディスカッション セクションを参照) を提供することが不可能します。
Representative Results
典型的な分離収穫調査、ターゲット化合物の化学的安定性および浄化プロセスに挑戦はいかがでしたの下で酵素/酵素の組み合わせに依存しています。我々 は以前 β-アミリンの分離の利回りを報告しているに至る 0.12 グラムあたり 3.87 mg コンビナトリアル生合成実験から誘導体乾燥(名) ベンサミアーナリーフ パウダー。これらの化合物は酸化のレベルで広くあったし、酵素 (図 3)8の不自然な組み合わせが含まれています。このプロトコルは日常的に使用当研究室で数十または精製した製品構造特性のミリグラムの数百を生成する NMR 分光学および下流の機能アッセイによって。98% 以上の純度でトリテルペン足場 β-アミリンの 0.8 g を生産することによってこのプラットフォームの分取の有用性も実証しました。この実験 459 植物を使用し、ドライのグラムあたり 3.3 mg の単離収率を表します(名) ベンサミアーナ葉粉末8。
図 1: 概要。新トリテルペン高付加価値製品の分取の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給を転換する(名) ベンサミアーナ葉の生合成酵素の一過性の発現を悪用するプロセスの模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 侵入者の建設やプロセスの真空、)オーダーメイドの一戸建て植物ホルダー 1 つの翼。b) Bespoke 植物ホルダー翼を接続します。c) 反転と植物の水没。d) 浸透浴の挿入。e) 浸潤浸潤チャンバー内でお風呂。f) 完全な真空の侵入者: (1) 真空ポンプ真空ポンプ真空リザーバー (3) 真空タンク分離バルブ (4) 真空リザーバーと浸潤商工会議所圧力計 (5) (6) の吸気バルブ (7) 間の接続から接続 (2)浸潤商工会議所 (8) 真空貯水池があります。g) 代表の葉緑色蛍光タンパク質 (GFP) を発現コンストラクトを浸透させた 1 つの工場から 5 日後の浸潤成長後。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 以前このプロトコル8を使用して β-アミリン誘導体の分取用の代表的な結果を報告します。このテーブルは分離の利回り順に。列は、相対値の色の表示を条件付きで書式設定されます。赤 = 高、緑 = 低 (しかし中間黄色)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
高を入れて真空浸潤では、様々 な下位アプリケーションにとってのトリテルペン化合物の分取用研究室で日常的に使用するこのプロトコルをことができます。ここで説明した真空浸潤装置は簡単に複製されます。真空リザーバーの追加ですが、浸潤室としてそのまま真空オーブンを単に再利用することは、必要な真空をプルする必要時間を短縮することをお勧め。適当なコンデンサーの追加を通して真空ポンプを保護することは理論的には理にかなっているが、私たちの研究室で私たちは必要がないとこれが見つけた。
場合は、葉が完全に浸潤の懸濁液に浸漬されていません、浸潤範囲が損なわれます。プラント ホルダーの上面を懸濁液のレベルに達するし、植物ホルダーが浸透浴のタイトなフィットを確保することによってこの問題を最小化します。図 2から植物ホルダー上面が際浸透浴で凹んでいる注意してください。これは浸潤お風呂の上部にアンカー ポイントを形作る者の中央の端にパネルで実現されます。浸潤懸濁液懸濁液レベルを維持するために定期的な追加が必要になります。これは最も大きなバッチ浸潤のコースで OD600の漸次の縮小を防ぐために余分な浸透を懸濁液の添加により達成されます。しかし、私たちの手で水の代替思えない分取スケールの期待利回りに顕著な効果を持っているこれは曲率の調査をしていませんが。浸潤の懸濁液の 1 つのバッチから潜入することができますどのように多くの植物はまだ未解決の問題であります。我々 は日常的に浸潤懸濁液の 1 つのバッチで 100 と 200 の植物の間に潜入します。さらに、いくつかの土壌浸透過程にわたって浸透サスペンションに濾すこと正常です。これは見つかっていない浸透効果に顕著な効果を持っています。
お勧め (しかし重要ではない) だが収穫時期に潜入していた葉だけを収穫する (いくつかの葉が成長している後浸透)。選択的な収穫は、関心の化合物に対する内因性不純物の割合が増加すると非生産的な組織で希釈を防止します。これは下流側の浄化のしやすさは、公称の影響とこれらのプロセスの規模が大きくなります。前駆体の供給を高めるに tHMGR を使用している場合、後浸透成長期間を開発するされた壊死の表現型がよく見られます。これは正常であり、実際にエイズ選択的収穫と乾燥工程。乾燥葉粉末は、涼しく乾燥した、暗い場所に、理想的には真空下で乾燥器で密封された容器で通常格納できます。これは興味の化合物の安定性に依存します。-80 ° C のフリーザーで保存するを選択する場合は注意が必要です。乾燥したことを確認ようにするこのコンテナーを開く前に常温の葉が防水コンテナーで、記憶域から削除します。そう失敗は、ダウン ストリームの処理を妨げ、葉のリウェッティングになります。
このプロトコルでは収穫後の手順は、説明のために提供され、実用的な化学が限られていることがありますこれらの者が経験を支援します。他の多くの天然物の抽出・精製技術に置き換えることができます。導入の詳細として PSE には多くの利点、禁則であるかもしれないしかし首都は市販の PSE 器具の費用、それは必須ではありません。塩基性イオン交換樹脂加工は伝統的な鹸化液液分配続いてを交換する非常に便利な方法です。しかし、カルボン酸基やエステルなどの基本的な条件の下で加水分解、官能基を含む製品に適したはありません。これらの製品は、塩基性イオン交換樹脂上に保持されるように期待されます。ただし、キャプチャのためにこれを悪用 (ここでは説明しません) の手順を解放する可能性があります。伝統的な鹸化が適切な場合、塩基性イオン交換樹脂加工は、便利な代替手段として提供しています。手順 9、クロマト グラフ法は、図 3に記載の化合物のため一般化する発見されています。しかし、増加の極性の化合物は、拡張 100% 酢酸エチルの溶出期間を必要があります。9.2 の手順を参照して下流側の細かい浄化完全化合物の特定し、規模にもよります。小規模な最適化されたグラデーション フラッシュ クロマトグラフィーの繰り返しラウンドで通常 NMR 解析の適切な純度を達成するために十分です。大きなスケールの結晶化はしばしば便利な代替手段です。困難な場合は、単離した化合物の所望の量によって分取やセミ分取高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を用いることができます。代表的な化合物の範囲の下流側の浄化プロセスの例としては、他の場所で8で見つけることができます。
現在のプロトコルでは、ここに示された我々 の研究室で日常的に使用し、ユーティリティを証明しました。ただし、式プラットフォームのさらなる最適化のためのまだ重要な範囲があります。継続的な作業は、どのようにさらに経路工学を調査する研究室および差動制御タンパク質発現レベルの宿主細胞への毒性を仲介しながらさらに、トリテルペンの生産を改善できます。細胞内輸送システム20,21の操作と異なる細胞コンパートメント22,23, 酵素を改善できる道の方向を検討する可能性もあります。複数の酸化イベントの効率。主要器官の基になる形態を変更する潜在的な利点を検討も可能性があります。たとえば、過剰発現シロイヌナズナにおける HMGR のドメインの膜は植物24; 小胞体の肥大を誘導するために観察されています。CYP450 活動の重要なサイト。このプロトコルはトリテルペン類、グラム スケール量ミリグラムの生産に最適で、下流の研究 (例えば、構造活性の組織的な探検の化合物へ研究の場で用いることができます。リレーションシップ、および事前調査の薬力学及び薬物動態学的特性に導く臨床的に興味深い化合物)。しかし、プラットフォームは直線的、使用される、植物の数と agroinfiltration を介して一過性発現の実用性を増やすことによって単に信頼性の高いスケーラブルな製薬蛋白質の生産のための産業規模で実証されています。14、従ってある高価値トリテルペンの商業生産の拡張にこのプラットフォームの潜在的です。また、それはまた安定した形質転換体確定欲求発現の生合成経路を運ぶ、大量培養の生産を想像することと '農業' トランスジェニック(名) 栽培の継続的な系統商業的価値の異なる化合物を生産しています。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、ノリッジ研究公園就労 (JR) によってサポートされていた、共同工学と物理科学研究協議会/バイオ生物科学研究評議会 BBSRC 資金要約合成生物学研究センター (BB を付与します。/L014130/1) (M.J.S.、A.O.)。ジョン Innes の中心部知識の交換と商品化許可 (BB/KEC1740/1) (B.B.)。BBSRC 研究所戦略的プログラム グラント「自然から分子」(BB/P012523/1) とジョン ・ イネス財団 (A.O.)。PEAQ ベクトルを提供するためのジョージ ・ Lomonossoff とアンドリュー ・ デイビス写真撮影のために感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC-MS instrument | any | n/a | |
| Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
| Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
| Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
| Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
| Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Standing incubator | any | n/a | |
| Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
| Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
| 9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
| Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
| Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
| Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
| Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
| Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
| Balance (2 figures) | any | n/a | |
| Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
| A -80 freezer | any | n/a | |
| Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
| Safety glasses | any | n/a | |
| Lab coat | any | n/a | |
| Autoclave | any | n/a | |
| Consumables | |||
| Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
| Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
| Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
| Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
| Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
| Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
| Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
| Reagents | |||
| Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
| Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
| Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
| LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
| Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
| Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
| Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| Ethanol | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q water | any | n/a | |
| Levington F1 Compost | any | n/a | |
| Levington F2 Compost | any | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
| Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |
References
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