Summary
Nicotiana benthamiana 잎에서 생 합성 효소의 일시적인 분리 식 생 공급 2, 3-oxidosqualene 새로운 고부가가치 보관 제품의 생산으로의 착륙 장이 있습니다. 여기는 triterpenes 그리고이 강력한 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 아날로그의 빠른 (5 일) 대리점 규모 생산을 위한 상세한 프로토콜을 설명.
Abstract
triterpenes는 최대 규모의 식물 천연물의 대부분 구조적으로 다양 한 가족. 많은 보관 파생 상품 약 관련 생물 활성을가지고 표시 되었습니다. 그러나, 지금까지이 잠재력은 하지로 번역 클리닉에서 보관 파생 약물의 과다. 이것은 틀림 없이 (적어도 부분적으로) 화합물의이 클래스에 제한 된 실용적인 합성 접근의 결과, 구조 활동 관계의 탐사 및 개발의 억압 수 있습니다 문제가 약 전통에 의해 후보자 리드 화학 워크플로입니다. 그들의 엄청난 다양성에도 불구 하 고 triterpenes 모두에서 파생 된 단일 선형 전조, 2, 3-oxidosqualene. 명. benthamiana 에서 생 합성 효소의 일시적인 분리 식에는 자연스럽 게이 호스트에 의해 생산 되지 않습니다 새로운 고부가가치 보관 제품의 생산으로 2, 3 oxidosqualene의 생 공급 착륙 장이 있습니다. 농업-침투는 북 아 일 benthamiana에 과도 식 달성의 효율적이 고 간단한 방법 이다. 프로세스는 Agrobacterium tumefaciens 관심의 식 construct(s) 운반의 현 탁 액으로 식물 잎의 침투를 포함 한다. 추가 A. tumefaciens 의 공동 침투 변형 생성 효소 선구자 공급을 크게 향상 증가 인코딩 식 구문 들고. 5 일의 기간 후 침투 잎 재료는 수확 고 추출 하 고 결과 보관 제품을 분리 처리 될 수 있습니다. 이 실험에 사용 되는 식물의 수를 증가 하는 것 만으로도 선형 및 안정적으로 확장 되는 프로세스입니다. 여기는 triterpenes 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 빠른 대리점 규모 생산을 위한 프로토콜을 설명. 프로토콜 활용 쉽게 복제할 진공 침투 기구, 시간의 짧은 기간에 식물의 수백의 batch-wise 침투 수 있도록 최대 4 개까지 식물의 동시 침투를 허용 합니다.
Introduction
triterpenes는 최대 규모의 식물 천연물의 대부분 구조적으로 다양 한 가족. 그들의 엄청난 다양성에도 불구 하 고 모든 천연 제품을 보관 같은 선형 전조 2, 3-oxidosqualene, 식물에 mevalonate 통로의 제품에서에서 파생 될 여겨진다. 2, 3 oxidosqualene의 cyclization 시작 하 고 oxidosqualene cyclases (OSCs) 라고 하는 효소의 가족에 의해 제어. 이 cyclization 단계 자연1에서 보고 되었습니다 데 다른 보관 장비의 수백 다양화의 첫 번째 레벨을 나타냅니다. 이러한 건설 기계는 효소 (CYP450s)1,2포함 하 되이 제한 되지 않고, 시 토 크롬 p450s 조정에 의해 더 다변화 된다. 이러한 생 합성 경로 때로는 부모 보관에서 거의 인식할 수 있는 최종 제품의 결과로 엄청난 복잡성으로 이어질 수 있습니다. 예를 들어 강력한 살 충 용 및 antifeedant limonoid azadirachtin의 복잡 한 구조 tirucallane 유형3의 tetracyclic 보관에서 믿어진다.
많은 보관 파생 된 천연 제품, 심지어 그 상대적으로 수정 되지 않은 부모 건설 기계, 약 관련 생물 학적 활동4,5,,67을가지고 표시 되었습니다. 그러나, 지금까지이 잠재력은 하지로 번역 클리닉에서 보관 파생 약물의 과다. 이것은 틀림 없이 (적어도 부분적으로) 화합물의이 클래스에 제한 된 실용적인 합성 접근의 결과, 구조 활동 관계의 탐사 및 개발의 억압 수 있습니다 문제가 약 전통에 의해 후보자 리드 화학 워크플로입니다.
명. benthamiana 잎에 다른 식물 종에서 보관 생 합성 효소의 일시적인 식 생 공급 2, 3-oxidosqualene 새로운 고부가가치 보관 제품 (그림 1)의 생산으로의 착륙 장이 있습니다. 이 프로세스는 기능적으로 특성화 후보 효소 자연스럽 게-발생 중요 한 대사 산물의 생 합성 경로 재구성 하 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 또한 악용 될 수 있습니다 소설 보관 제품, 구조 활동 관계의 체계적인 탐사 수 있도록 구조적으로 관련된 유사 체의 라이브러리에서 발생할 수 있는 전략 생산 조합 생 합성 접근 생물학적 활성 화합물8,9.
Agroinfiltration는 과도 식 명 benthamiana 잎에 달성의 효율적이 고 간단한 방법 이다. 프로세스는 A. tumefaciens 들고 관심의 이진 식 construct(s)의 서 스 펜 션의 침투를 포함 한다. 이 stomata, 세포 공간에 공기를 전치 하 고 A. tumefaciens 현 탁 액으로 교체를 통해 액체 압력의 응용 프로그램을 통해 달성 된다. 박테리아는 침투 잎 조직에 지역화 및 과도 단백질 표정 인 식물 세포의 내부에 각각 T-DNAs를 전송 합니다.
어떤 이진 벡터 적합 한 동안 생성 하는 유전자 변형 식물 과도 식에 대 한 고용 수 있습니다에 대 한 활용 Cowpea 모자이크 바이러스 CPMV 파생 된 Hypertranslational (HT) 단백질 표정 시스템10, 11.이 시스템에서 관심사의 유전자는 번역 되지 않은 영역 (UTR) CPMV RNA-2에서에 의해 형벌 이다. 5' UTR 수정 없이 의존 바이러스 성 복제12와 단백질 번역의 매우 높은 수준의 결과 포함 합니다. 이 기술은 복제 프로토콜 호환 구문 (pEAQ-HT-DEST)10,11사이트별 재결합을 포함 하는 쉬운 및 빠른 (pEAQ) 이진 벡터 시리즈도 개발 되었습니다. 대부분 pEAQ 벡터도는 토마토 덤 불 같은 곡예 바이러스 파생 P19 입을 억압 유전자13 circumvents 별도 P19 들고 긴장 coinfiltrate 필요 하 고 매우 월급 식 카세트의 T DNA 부분을 포함 호스트에서 고급 단백질 표정 식물 세포10,11.
명. benthamiana 의 식 호스트 장점이 특정 식물 생 합성 경로 작업할 때 사용 합니다. 셀 구조는 본질적으로 적절 한 mRNA, 단백질 처리, 및 필요한 공동 효소, (CYP450s)에 대 한 reductases 및 대사 선구자 뿐만 아니라 적절 한 구획을 지원 합니다. 탄소 소스가 이다 광합성; 따라서, 식물 입력으로만 물, CO2 (공중에서), 그리고 햇빛을 필요로 하는 좋은 품질 퇴 비에서 자란 단순히 있습니다. 플랫폼은 또한 단백질의 다른 조합의 공동 식에 대 한 매우 편리한으로이 손 쉽 세 A. tumefaciens 큰 multigene 식 구축 필요성을 negating의 다른 긴장의 공동 침투에 의해 달성 될 수 있다 카세트입니다. 또한, 과정 확장할 수 있습니다 선형 및 안정적으로 실험에 사용 되는 식물의 수를 증가 하는 것 만으로도.
우리의 실험실에 이전 작업 대리점 규모 실험을 위해이 플랫폼의 유틸리티를 시연 하고있다. 이 절연된 제품의 그램 수량을 달성 하기 위해 최대 bioactivity 분석 실험 규모에 사용 하기 위해 소설 triterpenes의 준비를 포함. 또한, 이기종 보관 제품의 축적을 증가 시킬 수 있다 몇몇 reductase (tHMGR), 속도 제한 3-hydroxy, 3-methyglutary-코엔자임의 N 터미널 잘립니다, 피드백을 구분 하지 않는 형태의 공동 식 여 접을 업스트림 mevalonate 통로8효소입니다.
키 같은 대리점 규모 실험을 편리 하 게 최대 규모 침투 과정을 기능입니다. 전형적인 실험에서 식물의 수백 수만 절연된 제품의 목표 수량 달성 하기 위해 필요할 수 있습니다. (불필요 한 주사기를 사용 하 여) 개별 잎 손으로 침투 운영 요구 하 고 종종 매우 시간이 걸리는,이 방법은 비현실적 일상적인 스케일-업에 대 한 렌더링. 연산자의 기술 수준에 종속 되지 않습니다 그것과 잎 표면의 더 중대 한 지역에의 침투를 허용 한다 진공 침투 손 침투, 이점을 제공 합니다. 이 절차는 제약 단백질14의 대규모 생산을 위해 상업적으로 사용 됩니다. 이 프로토콜 상용 부분에서 생성 될 수 있습니다 쉽게 복제할 진공 침투 기구를 이용 한다. 그러면 최대 4 식물, 시간의 짧은 기간에의 신속 하 고 실용적인 batch-wise 침투 식물의 수백을 affording의 동시 침투 (그림 2a -2b). 침투 챔버 (그림 2f)을 형성 하는 진공 오븐 진공 침투 기구에 의하여 이루어져 있다. 오븐 진공 저수지를 통해 펌프에 연결 된다. 이 크게 침투 챔버에 원하는 진공을 달성 하는 데 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. 식물에 맞춤된 홀더 확보 및 A. tumefaciens 현 탁 액으로 가득 10 L 스테인리스 물 목욕으로 거꾸로 (그림 2a -2 c). 완전 한 침수 식물의 공중 부분의 효율적인 침투에 대 한 중요 하다. 물 목욕 챔버 내에 침투 배치 됩니다 (그림 2d -2e), 및 잎 중간 공간에서 공기를 그릴에 적용 하는 진공. 일단 압력 880 mbar (프로세스는 약 1 분 소요)으로 단축 되었습니다 침투 챔버는 들어온 신속 하 게 다시 대기압에 침투 완료 되 면 위에 오븐 입구 밸브를 개방 하 여 20-30 s.
침투 후 5 일 식물 재료는 수확 하 고 후속 추출 및 원하는 제품의 절연에 대 한 준비. 이 시점에서 과정은 단순히 자연 제품 추출 및 잎 소재, 모든 자연 제품 화학자에 익숙한 워크플로에서 정화의 하나. 초기 추출 및 후속 정화에 대 한 여러 가지 방법15를존재 한다. 방법 및 정확한 조건 사용의 가장 적절 한 선택 높은 관심, 능력 및 장비의 가용성 뿐만 아니라 화합물의 특정 화학 속성에 따라 달라 집니다. 그것은 관심, 보관 제품에 대 한 맹목적으로 따라 할 수 있는 절연된 제품에 수확된 식물 잎 재료의 다운스트림 처리에 대 한 완벽 하 게 받아들이기는, 단계별 방법이이 프로토콜에 포함 될 수도 있을 것 이라고 그렇게 하려고 하는 것 적절 한. 그러나,이 프로토콜은 우리의 실험실에 있는 우리의 경험에서 가장 산소 aglycone 보관 제품 받아들이기는 입증 과정의 초기 단계에 대 한 몇 가지 방법을 사용 하는 기본 워크플로 대 한 개요를 제공 합니다. 2 비교적 드문 기술, 즉, 가압 용 매 추출 (PSE) 및 강하게 기본적인 이온 교환 수 지를 사용 하 여 엽록소 제거에 대 한 편리한 이기종 단계 방법 포함 됩니다.
PSE 고체 행렬에서 작은 유기 분자의 추출에 대 한 매우 효율적인 기술입니다. 추출 압력 (ca. 100-200 bar)에서 수행 됩니다, 그리고 끓는 초과 하는 의료진된 온도 사용 하 되 주요 장점은 추출 용 매에의 합니다. 이 크게 시간과 간단한 환류 등 Soxhlet 추출16다른 뜨거운 용 매 기술에 비교 될 때 완전 한 추출, 달성 하는 데 필요한 용 매의 양을 줄일 수 있습니다. 상업적인 벤치탑 PSE 악기는 상호 추출 셀 및 자동된 용 매 처리, 난방, 그리고 모니터링을 활용 수, 있습니다. 이것은이 기술을 매우 편리 합니다. 그것은 또한 틀림 없이 덜 위험, 특히 제한 된 실용적인 화학 경험을 가진 사업자에 대 한입니다.
비 누화 퇴조 액체/액체 분할 뒤에서 원유 잎 추출 물의 후속 정화 또는 분석 전에 chlorophylls의 대량 제거를 위한 일반적인 기술입니다. 그러나,이 수 자주 될 운영 체제 요구 더 큰 가늠 자에. 또한, 인터페이스, 또는 유화 액의 형성으로 인 한 제품 손실의 문제가 될 수 있습니다. 이기종 단계 가수분해 수행을 강하게 기본적인 이온 교환 수 지를 사용 하 여 편리한 대안이 될 수 있습니다. 분해 된 엽록소의 색소 부분 수 지에 준수 남아 있고 단순히 여과 의해 제거 될 수 있다. 이 프로토콜의 상용 기본 이온 교환 수 지를 사용 하는 이전에 보고 된 분석 절차17 대리점 규모 적응을 활용 합니다.
아래는 triterpenes 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 대리점 규모 생산에 대 한 상세 하 고 빠른 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 사용 정기적으로 우리의 실험실에 격리 보관 제품의 밀리 그램의 수백 수만 응용 프로그램에 대 한 구조적 특성화 하 여 준비 핵 자기 공명 (NMR) 분광학, 추가 기능에서 공부 하 분석 실험입니다.
Protocol
참고: 이 프로토콜을 수행 하기 전에, 사용 하는 모든 물질에 대 한 물질 안전 데이터에 잘 알고 되 고 적절 한 안전 예방 조치를 취해야. 이들은 포함 하지만 제한 되지 않는다: 유리 진공, 아래 작업 시 안전 안경을 착용 하 고 연기 찬에서 실리 카 젤을 건조 처리. 그것은 또한 유전자 변형 물질 사용에 관하여 지역의 법규를 확인 하 고 관찰, 포함 한 다음 적절 한 견제 절차 필수입니다.
1. 침투에 대 한 A. tumefaciens 변종 생성
참고: 여기 적당 한 A. tumefaciens 를 생성 하는 데 필요한 단계의 단순화 된 설명 제공 과도 식에 대 한 긴장. 이러한 단계에 자세한 내용은 세 인 외 에 의해 설명 8.
- PCR에 의해 amplify 또는 사이트별 재조합 복제 프로토콜18,19와 5'과 3' attB 시퀀스를 사용 하기 위해 항목 복제의 생성을 위해 적당 한에 의해 형벌 관심사의 유전자의 코딩 하는 단백질을 합성.
- 앞으로 뇌관을 사용 하 여: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, 반전 뇌관: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN... = 특정 시퀀스).
- (대표) PCR 조건 사용: 반응 혼합물 (25 µ L, 총), 버퍼 (5 x 5 µ L, 재료의 표참조), dNTPs (10 m m, 0.5 µ L), 앞으로 뇌관 (10 µ M, 1.25 µ L), 역방향 뇌관 (10 µ M, 1.25 µ L) 템플릿 DNA (가변 농도, 50-250, 0.5 µ L ), DNA 중 합 효소 (2000 U/mL, 0.25 µ L, 재료의 표참조), Nuclease 무료 물 (25 µ L). 다음과 같이 thermocycler 실행: 초기 변성 (98 ° C, 30 s); 주기 시작 (98 ° C, 30 s; 45-72 ° C, 20 s; 72 ° C, 30 s/kb) 끝 주기; 35 주기; 마지막 확장 (72 ° C, 10 분)입니다.
- 복제 프로토콜18,19 (우리는 상업적으로 사용할 수 있는 pDONR207 사용) 모든 항목 대 기반 벡터를 사용 하 여 항목 복제를 생성 하는 표준 사이트 재결합을 따릅니다.
참고: PEAQ-HT를 생성 하려면 사용 하기 전에 연속 항목 복제의 무결성을 확인 한다-DEST1 식 구조. PEAQ-HT-DEST1 노 리치, 영국에서 존 인 스 센터에서 Lomonossoff 실험실에서 요청에 사용할 수 있다. - PEAQ-HT분리-DEST1 벡터에서 생성 된 식 클론에서 1.1.3, 고-20 ° C 단계 1.3에서에서 사용 하기 전에 저장.
참고: 어떤 상업적으로 이용 가능한 편리한 스핀 열 기반 플라스 미드 정화 키트 변종 대장균 의 복제에서 플라스 미드를 추출 하기 위한 설계 적당 하다. 따라 선택한 플라스 미드 정화의 특정 지침 키트 ( 재료의 표참조).
- 변환에 대 한 화학적 유능한 A. tumefaciens 를 준비 합니다.
- 선택적 파운드 접종 (Luria Bertani 매체: 10 g/L bacto tryptone, 10 g/L NaCl, 그리고 5g/L 효 모 추출 물 한 천 10 g/L pH 7.0) 한 천 배지 (50 μ g/mL 리 팜 피신, 100 μ g/mL 스), 글리세롤 주식 문화에서 A. tumefaciens LBA4404를 줄이 여. 밤새를 품 어 서 인큐베이터에 28 ° C에서.
- 단계의 1.2.1 A. tumefaciens LBA4404 세포의 샘플 (50 μ g/mL 리 팜 피신, 100 μ g/mL 스) 선택적 액체 LB 미디어의 50 mL를 접종. 28 ° c 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 밤새 품 어.
- 단계 10 분 동안 얼음에 1.2.2에서에서 문화를 냉각 하 고 4 ° C와 5 분 (삭제는 상쾌한) 4500 x g에서 원심 분리 하 여 A. tumefaciens 셀을 펠 렛.
- Resuspend 얼음 20 m m 수성 CaCl2 솔루션의 단계 1에서 1.2.3 mL에서 펠 릿 고 (삭제는 상쾌한)에 단계 1.2.3에서에서 원심 분리의 단계를 반복 합니다.
- 50 µ L 일괄 차가운 20 m m 수성 CaCl2 솔루션 및 약 수에 결과 서 스 펜 션의 단계 1.2.4에 1 mL에서 펠 릿 resuspend 플래시 동결 액체 N2 에-80 ° C에 게 aliquots를 사용 하기 전에.
- 준비 된 변환 격리 pEAQ-HT와 A. tumefaciens LBA4404-1.2 단계에서 생성 된 DEST1 벡터.
- A. tumefaciens 현 탁 액, 얼음에 1.2 단계에서 생성 된의 50 µ L를 녹여 그리고 격리 pEAQ-HT의 100 \u2012 200 ng와 함께 품 어-1.1, 5 분 동안 0 ° C에 단계에서 생성 된 DEST1 벡터.
- 차가운 액체 N2 30 단계 1.3.1에서에서 incubated 정지 충격 s, 실내 온도를 따뜻하게 하 수 다음.
- 200 μ SOC 매체의 추가 (SOC: 20 g/L bacto tryptone 5 g/L 효 모 추출 물, 0.58 g/L NaCl, KCl 0.19 g/L, 2.03 g/L MgCl2, 2.46 g/L 황산 마그네슘 7-하이드 레이트, 3.6 g/L 포도 당) 1.3.2 단계에서 차가운 충격 을된 정지 하 고 4 h 28 °에서 품 어 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 C입니다.
- 1.3.3 단계에서 SOC 문화 선택적 파운드 한 천 배지 (50 μ g/mL 리 팜 피신, 50 μ g/mL 대, 100 μ g/mL 스) 예방. 철저 하 게,와 서 인큐베이터에 28 ° C에서 3 일 동안 품 어.
- 1.3.4 단계에서 단일 식민지와 선택적 파운드 미디어 (50 μ g/mL 리 팜 피신, 50 μ g/mL 대, 100 μ g/mL 스)의 5 mL을 접종. 28 ° c 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 밤새 품 어.
- 단계 1.3.5에서에서 액체 문화의 1 mL에 글리세롤의 200 μ를 추가 하 고, 철저 하 게 혼합 하 고-80 ° c.에 저장
참고: 이 문화 (아래 설명 참조) 적절 한 항생제로 파운드 한 천 배지 위에 질주 하 여 미래 실험을 위한 부활 될 수 있습니다.
2. 침투 정지 준비
- 원하는의 줄무늬와 선택적 파운드 천 배지 접종은 글리세롤에서 A. tumefaciens 긴장 재고 문화 단계 1에서에서 생성 된. 밤새를 품 어 서 인큐베이터에 28 ° C에서.
참고: THMGR 는 pEAQ-HT내 들고 긴장-DEST1 벡터도 포함 될 수 있습니다.- 개별적으로 단계 2.1에서에서 성장 각 A. tumefaciens 스트레인의 샘플 선택적 파운드 미디어의 50 mL를 접종 하 고 하룻밤 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 28 ° C에서 품 어.
- 개별적으로 단계의 선택적 파운드 미디어 (리 팜 피신 50 μ g/mL, 대, 50 μ g/mL 스 100 μ g/mL)의 2.1.1 1000 mL 50 mL 문화를 전송 하 고 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 28 ° C에서 밤새 품 어.
- 2.1.2 (삭제는 상쾌한) 단계에서 생성 된 액체 문화에서 A. tumefaciens 원심 (4000 x g)에 의해 개별적으로 작은.
- 개별적으로 갓된 MMA 버퍼의 단계 2.1.3에 50 mL에서 펠 릿 resuspend (MMA 버퍼: 10 m m 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic 산, pH 5.6 (코), 10 m m MgCl2, 150 μ M 3'5 '-dimethoxy-4'-acetophenone)와 실내 온도 품 어 1 시간에 대 한 짙은
- 적절 한 양의 각 A. tumefaciens mma의 서 스 펜 션 (에서 생성 된 단계 2.1.4) 최종 세600 이상 0.2 10 L 총 최종 볼륨 각 변형에 대 한 생산을 결합 합니다.
- 2.1.5 1 L (3 단계에서 즉시 사용)의 최종 볼륨을 단계에서 생성 된 결합된 정지를 추가 MMA 버퍼를 추가 합니다.
참고: 그것은 침투 과정에서 액체 레벨을 유지 하기 위한 침투 정지의 추가 2 L를 준비 하는 것이 좋습니다. - 10 x 강도 MMA 버퍼 1 리터를 준비 합니다.
3. 진공 침투 수행
참고: 진공 침투 기구 건설의 설명 그림 2 를 참조 하십시오. 5 주 오래 사용 진행 단계 9 cm x 9 cm 냄비에 명 benthamiana 식물. 묘 목 (예: Levington에서) F1 퇴 비에 뿌 렸 고 F2 퇴 비를 포함 하는 개별 냄비에 전송 하기 전에 2 주 동안 성장 해야 합니다. 식물 100 식물/m2의 최대 밀도 하루 빛 (조명 필요한 경우 보충 사용), 물, 매일 16 h와 25 ° C에서 온실에서 재배 한다.
- 침투 서 스 펜 션 강도 MMA 버퍼 침투 목욕, 물 추가 8 L 다음에 x 10의 1 L 단계 2에서 생성 된 1 리터를 전송 합니다.
- 맞춤된 공장 소유자의 분리 가능한 날개를 제거 하 고 삽입 4 식물 (5 주 된 식물 위의 참고 참조), 날개를 다시 연결. 홀더를 반전 하 고 잠수함 침투 정지에서 잎 만큼 침투 목욕 위에 배치 합니다.
참고: 서 스 펜 션 수준 공장 소유자의 상단 표면에 도달을 보장 합니다. 필요한 경우 추가 침투 정지의 추가 레벨을 올립니다. - 침수 식물 침투 목욕 침투 실로 전송 하 고 문을 닫습니다. 공기 흡입구 밸브는 infiltrator 휴관입니다 확인 하십시오. 진공 펌프를 켜고 진공 저수지 침투 챔버에 진공 흡입구 밸브 뒤에 인라인 밸브를 엽니다.
- 일단 880 mbar 침투 챔버에 압력은 감소 하는 진공 흡입 밸브를 종료 하 고 공기 흡입 밸브를 엽니다. 일단 침투 챔버는 대기압에 반환에, 문을 열고 침투 목욕을 제거 합니다.
- 식물 이상 침투 정지에 잠긴 다음 부드럽게 흔들어 초과 정지 침투 목욕으로 다시 나뭇잎에서 실행 수 있도록 홀더까지 식물 홀더를 올립니다.
- 수직 위치에 홀더를 반환, 분리 가능한 날개를 제거 하 고 식물을 제거.
- 3.1.1 3.1.5 단계를 반복 하 여 식물의 원하는 번호를 침투 했습니다.
- 오토 클레이 브 처리 전에 사용된 침투 정지.
- 고압 침투 후속 실험에 재사용 전에 목욕.
- 70% 에탄올으로 청소 하 여 침투 챔버의 내부를 소독 하 고 후속 실험에서 다시 사용 하기 전에 건조 공기에 둡니다.
- 맞춤된 공장 소유자의 분리 가능한 날개를 제거 하 고 삽입 4 식물 (5 주 된 식물 위의 참고 참조), 날개를 다시 연결. 홀더를 반전 하 고 잠수함 침투 정지에서 잎 만큼 침투 목욕 위에 배치 합니다.
4. 침투 식물 성장
- 온실에서 100 식물/m2 의 최대 조밀도에 3 단계에서 침투 식물을 정렬 합니다.
- 5 일 동안에 25 ° C 및 일 빛 (조명 필요한 경우 보충 사용)의 물 당 16 h 매일 성장 합니다.
5. 침투 잎 수확
- 5 일 후의 성장, 잎 수확.
- 고압 공장 설비 재료, 남 비, 및 토양 처리 전에 낭비.
6. 수확된 잎 건조
참고: 아래 설명 하는 정확한 동결은 절차 사용할 수 있는 사용 가능한 동결은 기구의 성격에 따라 달라 집니다.
- 건조까지 수확된 하는 잎을 lyophilize.
- 2 m m 두께 폴 리 프로필 렌 가방에 수확된 나뭇잎을 놓습니다. 30 분-80 ° C 냉동 고에 저장 하 여 수확된 잎을 고정 합니다.
- 많은 작은 구멍 핀을 사용 하 여 가방을 꿰뚫기. 장소는 lyophilizer의 중앙 상공에 냉동 체포 나뭇잎. 모든 플라스 크 첨부 파일 탭은 닫히고는 lyophilizer에 다음 스위치를 확인 합니다. 콘덴서 이상-50 ° C를 도달 하 고 적어도 0.15 mbar 압력 감소를 확인 하 고 하룻밤 둡니다.
- Lyophilizer는 떨어져 전환 하 고 진공 플라스 크 첨부 파일 탭을 열어 환기 합니다. 중앙 약 실에서 말린된 잎을 제거 하 고 7 단계로 진행.
7. 가압된 용 매 추출
참고: 진행 단계 상용 PSE 악기의 사용을 참조 ( 테이블의 자료를 참조). 제조업체의 문학에 대 한 자세한 내용은 작업을 참조 하십시오. 악기 4 기사 병렬로 수행합니다.
- 편리한 방법을 통해 코스 분말으로 말린된 잎을 갈아 (예: 관심의 대부분 보관 화합물에 대 한 국내 푸드 프로세서를 사용 하 여 또는 수동으로 가방 안에 포함 된 동안 나뭇잎을 부 술).
참고: 액체 질소에서 박격포와 유 봉이 일반적으로 필요 하지 않습니다.- 석 영 모래 (0.3 \u2012 0.9 m m, 볼륨 20%); 적합 한 컨테이너에와 잎 분말을 혼합 이 분산 제 역할 하 고 추출 프로세스의 효율성을 향상 시킵니다.
- 4 추출 셀 (120 mL) 작성을 위한 준비. 이 위해 추출 셀을 반전 하 고 유리 섬유 필터, 금속 릿 플러그를 잡고 삽입 합니다. 추출 셀 직을 놓고 석 영 모래의 1 cm 깊은 층 추가 반환 (0.3 \u2012 0.9 m m).
- 추출 셀을 입력 합니다.
- 추출 셀을 채우기 줄 7.1 단계에서 생성 된 준비 잎 분말을 채우십시오. 필요한 경우, 각 추출 셀에 큰 금액의 추가 촉진 하기 위하여이 과정 부드럽게 가루를 압축.
- 석 영 모래의 작은 레이어 추가 (0.3 \u2012 0.9 m m) 포장된 분말과 삽입 가기 룰 필터의 상단에.
- PSE 악기를 포장된 추출 셀을 삽입 하 고 실행 하는 방법에서 원하는 방법을. 다음 설정 및 소재;을 사용 하 여 용 매: 100% 에틸 아세테이트; 온도: 100 ℃, 압력: 130 바. 3 주기를 다음과 같이 실행: 1: 0 분 대기 시간, 주기 2와 3: 5 분 대기 시간, 2 분 용 매 플 러쉬, 끝 주기 및 12 분 질소 가스 플러시.
참고: 그것은 먼저 작은 규모에 추출 메서드를 최적화 하는 것이 좋습니다. 그러나, 다음과 같은 메서드는 종종 가장 산화 보관 aglycones에 대 한 충분 한. 각 추출 셀에서 주류는 표준 개별 컬렉션 라인 대신 추출 대상으로 폐기물 라인을 지정 하 여 동일한 외부 컬렉션 선박에 결합할 수 있습니다. 용 매 사용은 추출 셀 설정된 온도 압력의 포장에 다는 것을 유의 하십시오입니다. 위의 메서드는 일반적으로 4 병렬 기사에 대 한 적 출 술의 약 800 mL를 생성합니다. - 7.2 7.3.3 단계를 반복 하 여 모든 잎 분말 처리 된.
- 집중 건조, 진공에서 회전 증발을 통해에 결합 된 추출 주류. 예상된 출력 (즉, 어두운 녹색 슬러리)를 확인 합니다.
참고: 정확한 절차 사용 가능한 회전 증발 기의 최대 설정에 따라 달라질 수 있습니다. 항상 회전 증발, 수행할 때 눈 보호를 착용 하 고 진공 조건에 복종 하기 전에 유리 손상에 대 한 확인.- 냉각기 휴지통 설정 하 고 적어도 5 ° c 냉각 열 전송 액체 허용 물 목욕, 설정 하 고 설정 온도 35 ° c
- 증발 플라스 크를 추출 주류를 전송 (플라스 크의 절반 이상이 볼륨을 기입 하지 않습니다). Batch-wise에 술을 집중 (에 동일한 플라스 크를) 총 볼륨 이것을 초과 하는 경우. 로터리 증발 기 (공동 클립 보안)의 증기 덕트에 채워진된 증발 플라스 크를 연결 합니다.
- 플라스 크 리프트 위치와 하단 잠수함 만큼 각도 조정에서 물 탕에서 증발 플라스 크의 세 번째는 약 45 ° 각도. 플라스 크는 플라스 크의 벽에 추출 술을 전파 하기 시작 하는 속도에 회전을 시작 합니다.
- 환기 탭 닫혔는지 확인 하 고 압력 (진공 펌프의 컨트롤러를 사용 하 여)을 줄이기 위해 시작 적당 한 물방울 콘덴서 및 수신기 플라스 크 사이 관찰 때까지.
참고: 종 시작 추출 주류를 허용 하지 않습니다. 이 경우 제어에서 증 류를가지고 진공의 강도 줄일 수 있습니다. - 모니터링 하 고 모든 용 매 증발 때까지 적절 한 진공 힘과 회전 속도 조정 합니다.
8. 기본 이온 교환 수 지 처리 Chlorophylls의 제거를 위한
참고: 다음 단계에서 인용 수량 100 \u2012 150 식물의 원래 작업 규모를 가정 합니다. 단계가 8 carboxylic 산 그룹, 또는 에스테 르 등 기본적인 조건 하에서 분해 될 것 이다 기능적인 그룹을 포함 하는 제품에 적합 하지 않습니다.
- 에탄올의 최소 볼륨에서 7 단계에서 생성 된 원유 추출 해산.
- 7.1.1, 단계 그리고 30 분 동안 실내 온도에 쉐이크의 출력을 기본 이온 교환 수 지 구슬 ( 재료의 표참조) 50 mL를 추가 합니다.
참고: 교 반 장치 사용에 대 한 동요를 대체 하지 않습니다. 마그네틱 또는 기계적 오버 헤드 교 반 수 지 구슬의 무결성을 손상 수 있습니다. 적합 한 동요 수 또한 편리 하 게 달성 될 회전 증발 기에 반응 플라스 크의 느린 회전에 의해 진공 대기압에서 설정 또는 연결 끊김. - 반응 완료; 갈 때까지 기본 이온 교환 수 지 구슬 마다 30 분의 추가 50 mL를 추가 기본 이온 교환 수 지 구슬 색상, 녹색 분홍색에서 변경 됩니다 그리고 액체 단계 오렌지 또는 규모에 따라 어두운 갈색 색상을 녹색에서 변경 됩니다.
- 반응 완료 간 의심 하는 경우에 액체의 0.5 mL 샘플. 규조토의 작은 열을 통해 샘플을 필터링 하 고; 여과 액의 색을 관찰 반응이 일반적으로 1.5 h 내에서 완료 했다입니다.
- 규조토의 짧은 칼럼을 통해 반응 혼합물을 필터링 합니다.
- 진공 여과, 또는 압력 핸드 벨로 우즈를 사용 하 여 유리 플래시 크로마토그래피 칼럼을 통해이 수행 합니다. 여과 율 저하, 교 반 막대와 규조토 패드의 상단을 방해. filtrate를 수집 합니다.
- 에탄올, 1:1 에탄올: 헥 산, 및 마지막으로 hexane 수집된 수 지 구슬 린스. Diatomaceous 지구 열 위에 구슬 resuspend 충분 한 린스 볼륨을 사용 합니다.
- 단계의 8.4, 여과 액 및 단계의 8.5, 린스를 결합 하 고 진공에서 회전 증발에 의해 건조에 집중.
9. 초기 거친 분류
참고: 다음 방법 일반적인 산화 보관 aglycones, 일반적으로 적합 하며 자동된 플래시 크로마토그래피 악기를 사용 합니다. 제조업체의 문학에 대 한 자세한 내용은 작업을 참조 하십시오.
- 플래시 학년 실리 카 젤에 8 단계에서 생성 된 원유 제품 흡착 (기 공 크기: 60 Å, 입자 크기: 35 \u2012 75 μ m) 건조 로드 방법론을 통해 플래시 크로마토그래피 카트리지를 응용 프로그램에 대 한.
- 최소한의 양의 적당 한 유기 용 매에 8 단계에서 생성 된 원유 제품을 분해. 완전 한 해체를 확인 합니다.
참고: 메탄올의 몇 방울의 추가 함께 Dichloromethane 일반적으로 용 매의 적절 한 선택입니다. - 100 g prefilled 플래시 크로마토그래피 카트리지의 상단 나사 ( 재료의 표참조) 건조 로드 머리 공간을 삽입을 제거 하 고. 머리 공간을 사용 하 여 실리 카 젤 건조 로드에 대 한 적절 한 볼륨을 측정.
- 원유 제품의 솔루션을 실리 카 젤 건조 로드의 측정된 볼륨을 전송 다음 진공에서 회전 증발에 의해 용 매를 제거 합니다.
참고: 실리 카 젤 무료 흐르는 분말을 반환 해야 합니다. 증발 과정 부드러운 스크의 끝으로 증발 플라스 크의 측면에서 실리 카 젤을 필요할 수 있습니다. - Equilibrate 100% 헥 산의 적어도 5 열 량 100 mL/min에서 100 g 플래시 크로마토그래피 카트리지 하지만 이상적으로 카트리지 콘텐츠는 완벽 하 고 균일 하 게 젖은 때까지.
- 붓는 의해 단계 9.1.3 equilibrated 100 g 플래시 크로마토그래피 카트리지 건조 로드 머리 공간에서에서 생성 준비 건조 로드 실리 카 젤을 전송 합니다. 헥 산 및 넓은 짖 어 대 피 펫에 서 스 펜 션 전송 모든 나머지 건조 로드 실리 카 젤의 도움을 사용할 수 있습니다.
- 젖은 전송된 건조 로드 실리 카 젤 건조 로드 headspace에서 공기를 제거 하는 100% 헥 침대.
- 실행 다음 크로마토그래피 방법: 용 매 [A]: 제 초 제, 용 매 [B]: 에틸 아세테이트, 유량: 100 mL/min, 그라데이션: 100% [B] 3000 mL 이상 컬렉션 0% [B]: 수집 모든, 분수 크기: 250 mL.
- 진공에서 회전 증발을 통해 관심의 화합물을 포함 하는 fraction(s) 얇은 층 크로마토그래피 (TLC)8 또는 가스 착 색 인쇄기 질량 분 광 분석 (GC-MS)8, 고 농도 건조 하 여 분수를 분석 합니다.
- 최소한의 양의 적당 한 유기 용 매에 8 단계에서 생성 된 원유 제품을 분해. 완전 한 해체를 확인 합니다.
- 순도의 원하는 수준에 도달할 때까지 다운스트림 잘 정화를 수행 합니다.
참고: 다운스트림 잘 정화 완전히 복합 특정 이며 표준화 단계 (토론 섹션 참조)를 제공할 수는 없습니다.
Representative Results
일반적인 격리 된 수익률 조사, 대상 화합물의 화학 안정성 및 어떻게 했다 도전 정화 과정에서 효소/효소 조합에 따라 달라 집니다. 우리는 이전 β-amyrin의 고립 된 수익률을 보고 3.87 mg의 그램 당 0.12에서까지 우리의 조합 생 합성 실험에서 파생 상품 명. benthamiana 잎 분말 건조. 이러한 화합물의 산화의 수준에 넓게 배열 하 고 부자연 스러운 조합의 효소 (그림 3)8포함. 이 프로토콜이 사용 됩니다 정기적으로 우리의 실험실에 수십 또는 수백 밀리 그램 구조 특성에 대 한 정제 제품의 생산을 NMR 분광학 및 하류 기능 분석 실험. 우리도 보관 비 β-amyrin에서 98% 이상의 순도의 0.8 g을 생산 하 여이 플랫폼의 대리점 유틸리티 시연 했다. 이 실험은 459 식물을 사용 하 고 드라이의 그램 당 3.3 m g의 고립 된 수익률을 나타냅니다 명. benthamiana 잎 분말8.
그림 1: 도식 요약. 새로운 고부가가치 보관 제품의 대리점 생산으로 2, 3 oxidosqualene의 생 공급을 다른 곳으로 명. benthamiana 잎에서 생 합성 효소의 일시적인 식 악용 하는 프로세스의 도식 적인 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 진공 infiltrator 건설과 과정.는) 공장 소유자 한 날개 분리 맞춤 b) 서비스 공장 홀더 날개 부착. c) 역전과 식물의 침수. d) 침투 목욕의 삽입. e) 침투 침투 챔버 내에 목욕. f) 완전 한 진공 infiltrator: (1) 진공 펌프 진공 펌프 진공 저수지 (3) 진공 저수지 격리 밸브 진공 저수지와 침투 챔버 (5) 압력 게이지 (6) 공기 흡입구 밸브 (7) (4) 연결에서에서 연결 (2) 침투 챔버 (8) 진공 저수지 g) 대표는 5 일 후 침투 성장 후 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대 한 식 구문을 함께 침투 한 공장에서 출발 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3:8이 프로토콜 사용 하 여 β-amyrin 파생 상품의 대리점 생산에 대 한 대표적인 결과 이전 보고. 이 테이블은 고립 된 수익률으로 정렬 됩니다. 열 조건에 따라 상대적인 값의 색상 표시로 포맷 됩니다. 레드 그린 = 높은, 낮은 (비록 중간 노란색) =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
넣어 통해 높은 진공 침투가이 프로토콜을을 다양 한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 관심의 보관 화합물의 대리점 생산에 대 한 우리의 실험실에서 일상적으로 사용 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 진공 침투 기구 쉽게 복제 됩니다. 그러나 진공 저수지의 추가 이다 그것은 단순히 침투 챔버로 수정 되지 않은 진공 오븐 repurpose 수 필요한 진공을 당겨 하는 데 필요한 시간을 감소 하는 것이 좋습니다. 적합 한 콘덴서의 추가 통해 진공 펌프를 보호 하는 것은 이론적으로 합리적인, 하지만 우리의 실험실에서 우리가 발견이 필요 하다.
침투 범위는 나뭇잎 침투 정지에 완전히 몰입 하지 하는 경우 손상 됩니다. 이 문제는 서 스 펜 션의 수준 공장 소유자의 상단 표면에 도달 그리고 식물 홀더 침투 목욕에 대 한 꽉 맞는 함으로써 최소화 됩니다. 때 장소에에서 침투 목욕 공장 소유자의 위쪽 표면에 중단은 그림 2 에서 참고. 이 침투 목욕의 상단으로 앵커 포인트를 형성 하는 소유자의 중간 가장자리에 패널에 의해 이루어집니다. 침투 정지 정지 수준을 유지 하기 위해 정기적으로 추가 해야 합니다. 이것은 가장 큰 batch-wise 침투의 과정을 통해 세600 의 점진적 감소를 방지 하기 위해 과잉 침투 정지의 추가 의해 달성 된다. 그러나, 우리의 손에서 물에 대 한 대체 같지 않습니다 대리점 규모, 예상된 수익률에 눈에 띄는 효과를 비록이 quantitively 조사 되지 않았습니다. 얼마나 많은 식물 침투 서 스 펜 션의 하나의 일괄 처리에서 침투 될 수 있습니다 여전히 열려있는 질문입니다. 우리는 정기적으로 침투 서 스 펜 션의 단일 일괄 처리로 100와 200 식물 사이 침투. 또한, 일부 토양 침투 과정의 과정을 통해 침투 정지로 거르는 것이 정상입니다. 이 아니라 침투 효능에 눈에 띄는 효과가 발견 되었습니다.
수확 하는 동안 그것은 권장 (하지만 중요 하지) 침투 했다 잎만 수확 (일부 잎은 성장 후 침투). 선택적 수확 비생산적인 조직, 그렇지 않으면 관심의 화합물을 기준으로 내 생 불순물의 비율을 증가 것으로 희석을 방지 합니다. 이 다운스트림 정화의 용이성에 대 한 명목상 충격이 고 이러한 프로세스의 규모를 증가 한다. THMGR를 사용 하 여 전조 공급 향상을 necrosed 표현 형 후 침투 성장 기간 동안 개발을 자주 관찰 됩니다. 이것은 정상 고 실제로 선택적 수확 및 다운스트림 건조 과정 합니다. 말린된 잎 가루는 보통 차가운, 건조 하 고, 어두운 장소에서 하지만 이상적으로 진공에서 desiccator 밀봉된 한 콘테이너에서 저장할 수 있습니다. 이 관심의 화합물의 안정성에 따라 달라 집니다. 주의-80 ° C 냉동 고에 저장을 선택 하는 경우. 되도록 건조는 오프닝 전에 실내 온도에 따뜻한이 컨테이너 허용 잎에에서 있고 방수 컨테이너, 저장소, 제거에. 이렇게 하지 않으면 다운 스트림 처리를 방해 하는 잎의 rewetting 발생 합니다.
이 프로토콜의 수확 후 단계 설명을 위해 제공 됩니다 그리고 그 연구자의 실용적인 화학 제한 할 수 있습니다 경험을 돕기 위해. 그들은 많은 다른 천연 제품 추출/정제 기술에 대 한 대체 될 수 있습니다. 그러나에 설명된대로 도입, PSE 많은 장점을, 수도의 상용 PSE 기구 비용 금지 있을 수 있습니다 있으며 중요 하지 않습니다. 기본 이온 교환 수 지 처리 액체/액체 분할 뒤 전통적인 비 누화를 대체 하는 매우 편리한 방법입니다. 그러나, carboxylic 산 그룹 또는 에스테 르 등 기본적인 조건 하에서 분해 될 것 이다 기능적인 그룹을 포함 하는 제품을 위해 적당 하다. 이 제품 기본 이온 교환 수 지에 보관 예상 될 것 이다. 그러나, 잠재적인 캡처를 위해 이것을 악용 및 릴리스 절차 (여기 설명 하지)이 있다. 전통적인 비 누화 적절 한 될 것 이라고, 기본 이온 교환 수 지 처리 편리한 대안 역할. 9, 단계에서 설명 하는 크로마토그래피 방법은 그림 3에 설명 된 화합물에 대 한 일반화할 수 발견 되었습니다. 그러나, 증가 극성의 화합물 100% 에틸 아세테이트 차입 기간이 필요할 수 있습니다. 9.2 단계에 관하여 다운스트림 잘 정화 완전히 복합 특정 이며 또한 규모에 의존. 최적화 된 그라디언트, 작은 규모 플래시 크로마토그래피의 반복된 라운드 일반적으로 NMR 분석에 대 한 적절 한 순도 달성 하기 위해 충분 하다. 큰 저울에 결정 화 자주 편리한 대안 이다. 어려운 경우, 대리점 또는 반 대리점-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 격리 화합물의 원하는 수량에 따라 사용할 수 있습니다. 대표적인 화합물의 범위에 대 한 다운스트림 정화 프로세스의 예 다른8을찾을 수 있습니다.
현재 프로토콜, 여기, 우리의 실험실에서 일상적으로 사용 되 고 유틸리티를 입증 했다. 그러나, 추가 식 플랫폼의 최적화를 위해 아직도 중요 한 범위가입니다. 작업은 얼마나 더 통로 공학 조사를 우리의 실험실에 지속적인 고 단백질 식 레벨의 차동 제어 호스트 세포 독성을 중재 하는 동안 또한, 보관 생산을 향상 시킬 수 있습니다. 또한 있다 잠재적인 세포내 수송 시스템20,21, 조작 및 다른 세포질 구획22,23, 효소 향상 시킬 수 있는 길의 방향을 조사 하 여러 산화 이벤트의 효율성입니다. 잠재적인 혜택 주요 세포의 기본 형태를 수정 하는 또한 탐험 수 있습니다. 예를 들어 애기 thaliana HMGR의 막 도메인의 overexpression 식물24; 바인딩과 그물의 비 대를 유도 하기 위해 관찰 되었습니다. CYP450 활동에 대 한 주요 사이트입니다. 이 프로토콜의 밀리 그램 그램 규모 보관 제품의 수량을 생산 것이 가장 적합 하 고 다운스트림 연구 (예를 들어, 구조 활동의 체계적인 탐사에 대 한 화합물에 액세스 하는 연구에서 채택 될 수 있다 관계, 그리고의 pharmacodynamic pharmacokinetic 속성에 예비 조사 리드 임상 관심사의 화합물). 그러나, 플랫폼은 선형 및 사용, 식물의 수 및 agroinfiltration 통해 과도 식의 실용성을 증가 하면 안정적으로 확장 가능한 입증 되었습니다 제약 단백질의 생산을 위한 산업 규모 14, 이렇게 있다 높은 값 triterpenes의 상업 생산에 대 한 확장을이 플랫폼에 대 한 가능성. 또는, 그것은 또한 최종된 욕망 multigene 생 합성 통로 들고, 대량 재배를 수 있도록 안정적인 transformants의 생산을 구상 하 고 유전자 변형 명 benthamiana 의 ' 농업' 지속적인 긴장 상업적 가치가 다른 화합물을 생산.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 노 리치 연구 공원 재학 (JR)에 의해 지원 되었다, 공동 공학 및 물리 과학 연구 위원회/Biotechnological OpenPlant 합성 생물학 연구 센터 생물 과학 연구 위원회 BBSRC 자금 부여 (BB / L014130/1) (M.J.S., ㅡ); 존이 네 스 센터 지식 교류 및 상용화 부여 (BB/KEC1740/1) (B.B.); 그리고 BBSRC 연구소 전략적 프로그램 그랜트 '자연에서 분자' (BB/P012523/1)와 존 인 스 재단 (ㅡ). 우리는 조지 Lomonossoff pEAQ 벡터를 제공 하 고 사진에 대 한 앤드류 데이비스에 게 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC-MS instrument | any | n/a | |
| Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
| Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
| Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
| Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
| Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Standing incubator | any | n/a | |
| Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
| Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
| 9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
| Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
| Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
| Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
| Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
| Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
| Balance (2 figures) | any | n/a | |
| Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
| A -80 freezer | any | n/a | |
| Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
| Safety glasses | any | n/a | |
| Lab coat | any | n/a | |
| Autoclave | any | n/a | |
| Consumables | |||
| Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
| Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
| Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
| Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
| Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
| Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
| Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
| Reagents | |||
| Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
| Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
| Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
| LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
| Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
| Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
| Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| Ethanol | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q water | any | n/a | |
| Levington F1 Compost | any | n/a | |
| Levington F2 Compost | any | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
| Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |
References
- Thimmappa, R., et al. Triterpene biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).
- Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins. Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).
- Roy, A., Saraf, S. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).
- Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).
- Liby, K. T., Sporn, M. B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease. Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).
- Yadav, V. R., et al. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer. Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).
- Christensen, L. P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).
- Reed, J., et al. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).
- Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).
- Peyret, H., Lomonossoff, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).
- Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
- Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).
- Voinnet, O., et al. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).
- Holtz, B. R., et al. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals. Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).
- Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).
- Kaufmann, B., Christen, P. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction. Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).
- Larsen, E., Christensen, L. P. Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables. Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).
- Sainsbury, F., et al. Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways. Methods Enzymology. , 185-202 (2012).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA Cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).
- Ting, H., et al. SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).
- Wang, B., et al. Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
- Nielsen, A. Z., et al. Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis. ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).
- Dong, L., et al. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209, 679-690 (2016).
- Ferrero, S., et al. Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells. Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).
