Summary
Переходных гетерологичных выражение биосинтетических ферментов в Nicotiana benthamiana листья могут отвлечь эндогенных запасов 2,3-oxidosqualene на производство новой продукции тритерпеновых высокой стоимости. Здесь будет описано подробный протокол для быстрого (5 дней) подготовке масштабного производства тритерпенов и аналогов, используя этот мощный завод-платформе.
Abstract
Тритерпенов являются одним из крупнейших и наиболее структурно различных семей натуральных растений. Многие производные тритерпеновых было показано, обладают лечебных соответствующей биологической активности. Однако до настоящего времени этот потенциал не переведены на множество тритерпеновых производных препаратов в клинике. Это возможно (по крайней мере частично) является следствием ограниченного практического синтетических доступ к этому классу соединения, проблема, которая может задушить исследованию отношений структура активность и развитие привести кандидатов от традиционных лекарственных рабочие процессы химии. Несмотря на огромное разнообразие, тритерпенов все производные от одного линейного прекурсор, 2,3-oxidosqualene. Переходных гетерологичных выражение биосинтетических ферментов в н. benthamiana может отвлечь эндогенных запасов 2,3-oxidosqualene на производство новой продукции тритерпеновых высокой стоимости, которые естественно не производятся этот узел. Агро инфильтрации является эффективным и простым средством достижения переходных выражение в н. benthamiana. Этот процесс включает инфильтрации растений листья с подвеской Agrobacterium tumefaciens перевозящих construct(s) выражение интереса. Совместное проникновение дополнительных A. tumefaciens штамма, перевозящих что выражение конструкции кодировку фермент, который повышает поставок прекурсоров значительно увеличивает урожайность. После в течение пяти дней можно собирают и обрабатываются для извлечения и изолировать результирующий тритерпеновых товар(ов) проникли листовой материал. Это процесс, который масштабируется линейно и надежно, просто увеличив количество растений, используемых в эксперименте. Здесь будет описано протокол для быстрой подготовке масштабного производства тритерпенов, используя этот завод-платформе. Протокол использует аппарат легко воспроизводимые инфильтрации вакуум, который позволяет одновременное проникновение до четырех растений, позволяя загрузочных проникновение сотни растений в течение короткого времени.
Introduction
Тритерпенов являются одним из крупнейших и наиболее структурно различных семей натуральных растений. Несмотря на огромное разнообразие все естественные продукты тритерпеновых считается производным от же линейной прекурсоров 2,3-oxidosqualene, продукт мевалоната пути в растениях. Циклизация 2,3-oxidosqualene инициировал и контролируемая семьей ферментов, называемых oxidosqualene cyclases (ого). Этот шаг циклизация представляет первый уровень диверсификации, с сотнями различных тритерпеновых подмостей, сообщили от природы1. Далее эти леса диверсифицируются пошив ферментов, включая, но не ограничиваясь, цитохром p450s1,(CYP450s)2. Такие биосинтетических пути могут привести к огромной сложности, иногда приводит к готовой продукции, которые едва узнаваемый от родительского тритерпеновых. Например сложная структура мощным описан limonoid инсектицидные и антифидантная полагают, являются производными от тетрациклические тритерпеновых tirucallane типа3.
Многие производные тритерпеновых натуральных продуктов, даже те, с относительно неизмененной родительского подмостей, было показано, обладают лечебных соответствующей биологической активности4,5,6,7. Однако до настоящего времени этот потенциал не переведены на множество тритерпеновых производных препаратов в клинике. Это возможно (по крайней мере частично) является следствием ограниченного практического синтетических доступ к этому классу соединения, проблема, которая может задушить исследованию отношений структура активность и развитие привести кандидатов от традиционных лекарственных рабочие процессы химии.
Переходных выражение тритерпеновых биосинтетических ферментов из других видов растений в N. benthamiana листья могут отвлечь эндогенных запасов 2,3-oxidosqualene на производство новой продукции высокой стоимости тритерпеновых (рис. 1). Этот процесс может использоваться для функционально характеризуют кандидат ферментов и реконструировать биосинтетических пути важных естественных метаболитов. Аналогичным образом она может быть использована также в комбинаторной биосинтетических подходов к Роман тритерпеновых продукцию, стратегия, которая может привести в библиотеках структурно связанных аналогов, что позволяет систематическое изучение связи структура активность свинца биологически активных соединений,8,9.
Agroinfiltration является эффективным и простым средством достижения переходных выражение в N. benthamiana листья. Этот процесс включает проникновение листья с подвеской A. tumefaciens перевозящих двоичного выражения construct(s) интерес. Это достигается посредством применения давления, которое заставляет жидкость через устьиц, вытесняя воздух в межклеточном пространстве и заменив его подвеска A. tumefaciens . Бактерии передавать соответствующие T-ННО в глубь растительных клеток, что приводит к локализованной и переходных белков в ткани проникли листа.
Во время любой бинарный вектор подходит для создания трансгенных растений могут быть использованы для переходных выражения, мы используем вигны мозаика вирус CPMV-производные Hypertranslational (HT) белка выражение системы10, 11. в этой системе гена интереса в окружении непереведенные регионов (утр) от CPMV РНК-2. 5' УТР содержит изменения, что приводит к очень высокий уровень белка перевода с без опоры на вирусной репликации12. Этот метод был разработан в серии бинарный вектор легко и быстро (pEAQ), которая включает участкам рекомбинации клонирования протокола совместимые конструкции (pEAQ -HT- DEST)10,11. Большинство pEAQ векторов также содержат помидор густые трюк вирус производные P19 глушителей подавитель ген13 в T-ДНК части выражения кассету, которая обходит необходимость coinfiltrate отдельный штамм P19-нося и дает очень выражение высокого уровня белка в узле завод ячейки10,11.
Использование N. benthamiana как выражение хост имеет определенные преимущества при работе с завода биосинтетических пути. Архитектура ячейки неразрывно поддерживает соответствующие мРНК белка обработки и надлежащего разобщенности, помимо обладания необходимым совместно ферменты, reductases (для CYP450s) и метаболических прекурсоров. Источника углерода является фотосинтеза; Таким образом растения можно выращивать просто хорошее качество компоста, требующих только вода, CO2 (из воздуха) и солнечного света как входные данные. Платформа также очень удобен для совместного выражения различных комбинаций белков, как это может быть достигнуто в соответствии со проникновения различных штаммов A. tumefaciens, отрицая необходимость создания крупных мультигенных выражения кассеты. Кроме того этот процесс может быть линейно и надежно расширена путем простого увеличения числа растений, используемых в эксперименте.
Предыдущая работа в нашей лаборатории продемонстрировал полезность этой платформы для препаративных масштаб экспериментов. Это включало подготовку Роман тритерпенов для использования в биологическую анализов и масштаба до достижения количества грамм в изолированных продукта. Кроме того, можно увеличить накопление гетерогенных тритерпеновых продуктов несколько раз одним выражением N-терминал усечение, зависящие от обратной связи формы 3-гидрокси, 3-methyglutary кофермент редуктаза (tHMGR), ограничение скорости вверх по течению фермента в путь мевалоната8.
Ключ к такой подготовке масштаб экспериментов является возможность удобно вверх масштабе процесс инфильтрации. В типичном эксперименте десятки и сотни растений могут потребоваться для достижения целевой количество изолированных продукта. Проникновения отдельные листья вручную (с помощью излишне шприца) оперативно требовательных и часто чрезмерно длительным, делает этот метод непрактично для обычного масштаба. Вакуумные инфильтрации предлагает преимущества над проникновение руки, как это не зависит от квалификации оператора и позволяет проникновение большую площадь листовой поверхности. Эта процедура используется в коммерческих целях для крупномасштабного производства фармацевтических белки14. Этот протокол использует аппарат легко воспроизводимые инфильтрации вакуум, который могут быть построены из коммерчески доступных частей. Это позволяет одновременное проникновение до 4 растений, предоставляя быстрый и практических загрузочных инфильтрации сотни растений в течение короткого времени (Рисунок 2a -2b). Аппарат вакуумной инфильтрат состоит из вакуумной печи, который образует инфильтрации камеры (Рисунок 2f). Печь подключена к насоса через вакуумный резервуар. Это значительно уменьшает время, необходимое для достижения желаемого вакуум в камере инфильтрации. Растения в заказ держателя и перевернутый в 10 Л воды из нержавеющей стали Ванна, заполнены с A. tumefaciens подвеска (Рисунок 2a -2 c). Полное погружение надземной части растений имеет важное значение для эффективного проникновения. Водяной бане затем помещается в зале инфильтрат (Рисунок 2d -2e) и вакуум, применяется обратить воздуха из интерстициальных пространств листа. Как только давление был сокращен на 880 мбар (процесс, который занимает приблизительно 1 мин) инфильтрации палата возвращается быстро атмосферного давления 20-30 s, открыв печь впускного клапана, после чего инфильтрации является полным.
Через пять дней после проникновения растительный материал готов для уборки и последующего извлечения и изоляции желаемой продукции. С этого момента процесс является просто одним из натурального продукта добычи и очистки от листовой материал, Рабочий процесс, который знаком в любой аптеке натуральный продукт. Много различных методов для извлечения начальной и последующей очистки существуют15. Наиболее подходящий выбор методов и точные условия, используемые сильно зависит от конкретной химические свойства соединения интересов, помимо наличия навыков или оборудования. Это не возможно включить в этот протокол полностью обобщенным, шаг за шагом метод течению обработки материала листьев заготавливаемым завод изолированных продукт, который можно было бы следовать слепо для любого продукта тритерпеновых интереса, не будет целесообразным попытаться сделать это. Однако этот протокол будет обеспечивать обзор основного рабочего процесса, используемые в нашей лаборатории и некоторые методы для ранних этапов процесса, которые в наш опыт доказали обобщаемым для наиболее насыщенной кислородом aglycone тритерпеновых продуктов. Это включает в себя два сравнительно редко методы, а именно, под давлением экстракции растворителем (PSE) и удобно разнородные фазы метод для удаления хлорофилла, используя сильно основных ионообменных смол.
PSE — это высокоэффективный метод для извлечения мелких органических молекул из твердых матрицах. Удаление зубов выполняются под давлением (ОК. 100-200 бар), основным преимуществом является возможность использования упрощенной температура которых превышает кипения точку экстракции растворителем. Это может значительно уменьшить время и количество растворителя, необходимых для достижения исчерпывающий экстракции, когда по сравнению с другими горячей растворителя методы, такие как простой орошения или Soxhlet экстракции16. Коммерческие-стендовые PSE инструментов доступны, который используют взаимозаменяемые извлечение клеток и автоматизированных растворителя, обработка, Отопление и мониторинга. Это делает эту технику очень удобно. Это также возможно менее опасными, особенно для операторов с ограниченным практическая химия опыт.
Омыление сырой лист выписок по рефлюкса, следуют секционирование жидкость/жидкость является общий метод для массового удаления хлорофиллов до последующей очистки или анализа. Однако это может часто рабоче требуя на больших масштабах. Кроме того определение интерфейса, или потерю продукта за счет формирования эмульсии может быть проблематичным. Использование сильно основных ионообменных смол для выполнения гетерогенных этапа гидролиза может служить удобной альтернативой. Пигментированный часть гидролизованный хлорофилла по-прежнему соблюдать смолы и может быть просто удалены путем фильтрации. Этот протокол использует препаративные масштаба адаптации сообщалось ранее аналитические процедуры17 , которая использует коммерчески доступных основных ионообменных смол.
Ниже мы описываем подробный и быстрый протокол для препаративные масштаба производства тритерпенов, используя этот завод-платформе. Этот протокол используется в нашей лаборатории регулярно готовить десятки и сотни миллиграммов изолированных тритерпеновых продукта для приложений таких структурных характеристик методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), и/или дальнейшего изучения в функциональных анализов.
Protocol
Примечание: До после этого протокола, ознакомиться с данными безопасности материалов для всех веществ, используемых и принимать соответствующие меры предосторожности. Они включают, но не ограничиваются: носить защитные очки при работе со стеклом в вакууме и обработка сухого силикагеля в вытяжной шкаф. Важно также и то, что местное законодательство, касающиеся работы с трансгенных материал проверяется и наблюдается, включая следующие соответствующие процедуры сдерживания.
1. создать A. tumefaciens штаммов для проникновения
Примечание: Мы предоставляем здесь упрощенное описание шагов, необходимых для создания подходящих A. tumefaciens штаммов для переходных выражение. Более подробная информация об этих шагах описаны Sainsbury и др. 8.
- Усилить методом ПЦР или синтезировать белок, кодирование региона гена интереса, обрамленная 5' и 3' attB последовательностей, подходит для поколения клон вход для использования с конкретным участкам рекомбинации, клонирование протокол18,19.
- Используйте вперед грунтовка: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, обратный грунтовка: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN... = последовательности определенной последовательности).
- Используйте (представитель) условия PCR: буфера (25 мкл, всего), смеси реакции (5 x 5 мкл, см. Таблицу материалы), дНТФ (10 мм, 0,5 мкл), Форвард грунтовка (10 мкм, 1,25 мкл), обратный грунтовка (10 мкм, 1,25 мкл), шаблон ДНК (переменная концентрации, 50 – 250 нг, 0.5 мкл ), ДНК-полимеразы (2000 ед/мл, 0,25 мкл, смотрите Таблицу материалы), свободной от нуклеиназы воды (до 25 мкл). Запустить Термоциклер следующим: первоначальный денатурация (98 ° C, 30 s); Начало цикла (98 ° C, 30 s; 45-72 ° C, 20 s; 72 ° C, 30 s/КБ) конец цикла; 35 циклов; окончательное расширение (72 ° C, 10 мин).
- Следуйте стандартным участкам рекомбинации, клонирование протокол18,19 для создания клона запись, с помощью любого вектора на основе канамицин вход (мы используем pDONR207, который является коммерчески доступных).
Примечание: Целостность клон вступления должны быть подтверждены последовательности, перед использованием для создания pEAQ -HT-DEST1 выражение конструкции. PEAQ -HT-DEST1 по запросу из Lomonossoff лаборатории в центре Innes Джона в Норвич, Великобритания. - Изолировать pEAQ -HT-DEST1 вектор из выражения клона, созданного в шаге 1.1.3 и хранить при-20 ° C до использования в шаге 1.3.
Примечание: Подходит любой коммерчески доступных удобно спина на основе столбцов плазмида очистки комплект, предназначенный для извлечения плазмиды от клонирования штаммов E. coli . Следуйте инструкциями выбранного плазмида очистки комплекта (см. Таблицу материалы).
- Подготовьте химически компетентным A. tumefaciens для преобразования.
- Прививать селективного фунтов (Лурия-Бертани средний: 10 г/Л bacto Триптон, 10 г/Л NaCl и дрожжевой экстракт 5 г/Л, агар 10 г/Л рН 7,0) агар плиты (50 мкг/мл рифампицин, этамбутол 100 мкг/мл), мелирование A. tumefaciens LBA4404 от культуры биржевых глицерин. Инкубируйте на ночь, на 28 ° C в инкубаторе стоя.
- Прививать 50 мл селективного жидких сред фунтов (50 мкг/мл рифампицин, этамбутол 100 мкг/мл) с образцом A. tumefaciens LBA4404 клеток из шаг 1.2.1. Инкубируйте на ночь, на 28 ° C в тряску инкубатор на 200 об/мин.
- Прохладный культуры от шага 1.2.2 на льду за 10 мин и затем Пелле A. tumefaciens клетки центрифугированием при 4 ° C и 4500 x g 5 мин (удалить супернатант).
- Ресуспензируйте гранулы от шага 1.2.3 в 1 мл ледяной 20 мм водного раствора2 CaCl и повторите шаг центрифугирования от шага 1.2.3 (удалить супернатант).
- Ресуспензируйте гранулы от шага 1.2.4 в 1 мл ледяной 20 мм водный раствор2 CaCl и Алиготе результате подвеска в 50 мкл пакеты. Вспышки заморозить аликвоты в жидкости N2 и хранить при температуре-80 ° C перед использованием.
- Трансформировать подготовленный A. tumefaciens LBA4404 с изолированной pEAQ -HT-вектор DEST1, созданного на шаге 1.2.
- Оттепель 50 мкл суспензии A. tumefaciens , созданного на шаге 1.2 на льду и проинкубируйте с 100 \u2012 200 ng изолированных pEAQ -HT-DEST1 вектор, созданного на шаге 1.1, при 0 ° C за 5 мин.
- Холодный шок инкубирован подвеска из шага 1.3.1 в жидкости N2 по 30 сек, затем позволяют нагреться до комнатной температуры.
- Добавить 200 мкл SOC среды (SOC: 20 г/Л bacto Триптон, 5 г/Л дрожжевой экстракт, 0,58 г/Л NaCl, 0,19 г/Л хлористого калия, 2,03 г/Л MgCl2, 2,46 г/Л сульфата магния 7-гидрат, глюкоза 3,6 г/Л) для холодного потрясен подвеска от шаг 1.3.2 и инкубировать в течение 4 часов при 28 ° C в тряску инкубатор на 200 об/мин.
- Прививать селективного LB агар плита (50 мкг/мл рифампицин, 50 мкг/мл канамицин, 100 мкг/мл стрептомицина) с SOC культуры из шага 1.3.3. Распространение тщательно и Инкубируйте 3 дней на 28 ° C в инкубаторе стоя.
- Прививать 5 мл селективного СМИ фунтов (50 мкг/мл рифампицин, 50 мкг/мл канамицин, 100 мкг/мл стрептомицина) с одной колонии от шага 1.3.4. Инкубируйте на ночь, на 28 ° C в тряску инкубатор на 200 об/мин.
- Добавить 200 мкл глицерина в 1 мл жидкого культуры от шага 1.3.5, тщательно перемешать и хранить при температуре-80 ° C.
Примечание: Эта культура может быть возрождена для дальнейших экспериментов мелирование на плиты агара LB с соответствующие антибиотики (описано ниже).
2. подготовить инфильтрации подвеска
- Прививать селективного LB агар тарелку с прослоями желаемого A. tumefaciens штаммов из глицерина сток культура, созданного на шаге 1. Инкубируйте на ночь, на 28 ° C в инкубаторе стоя.
Примечание: Штамм, перевозящих tHMGR в пределах pEAQ -HT-DEST1 вектор также могут быть включены.- Индивидуально прививок 50 мл с образца каждого штамма A. tumefaciens , выращенных в шаге 2.1 селективного LB СМИ и Инкубируйте на ночь на 28 ° C в тряску инкубатор на 200 об/мин.
- Индивидуально передача 50 мл культур из шага 2.1.1 до 1000 мл селективного СМИ фунтов (рифампицин 50 мкг/мл, канамицин, 50 мкг/мл стрептомицина 100 мкг/мл) и Инкубируйте на ночь на 28 ° C в тряску инкубатор на 200 об/мин.
- Индивидуально на гранулах A. tumefaciens центрифугированием (4000 x g), жидкого культур, созданного на шаге 2.1.2 (удалить супернатант).
- Индивидуально Ресуспензируйте гранулы от шага 2.1.3 в 50 мл свежеприготовленные ММА буфера (Buffer ММА: 10 мм 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic кислота, pH 5.6 (KOH), 10 мм MgCl2, 150 мкм 3'5 '-диметокси-4'-ацетофенон) и инкубации при комнатной температуре в темное время суток на 1 ч.
- Объединить соответствующий объем каждого A. tumefaciens ММА подвеска (созданный в шаге 2.1.4) производить окончательный ОД600 минимум 0,2 для каждого штамма в окончательный объем 10 Л.
- Добавьте дополнительный буфер ММА в комбинированных суспензий, созданного на шаге 2.1.5 окончательный объемом 1 Л (использование сразу на шаге 3).
Примечание: Желательно подготовить дополнительные 2 Л инфильтрации подвески для поддержания уровня жидкости во время процесса инфильтрации. - Подготовка 1 Л 10 x прочность ММА буфера.
3. выполнение вакуумного инфильтрации
Примечание: Смотрите Рисунок 2 описание конструкции аппарат вакуумной инфильтрации. Используйте 5-недельных N. benthamiana растения в горшках 9 х 9 см для этапов разбирательства. Саженцы должны Сеется в F1 компоста (например от Levington) и вырос за 2 недели до перевода баранчики, содержащие F2 компоста. Растения должны быть выращены в Теплице при 25 ° C, с 16 ч. в день света (использование дополнительного освещения при необходимости), воды ежедневно, максимальная плотность 100 растений/м2.
- Передача 1 Л инфильтрации подвеска, созданное в шаге 2 и 1 Л 10 x прочность ММА буфера для проникновения Ванна, следуют дополнительные 8 Л воды.
- Удалить съемный крылья держателя заказ завода, вставка 4 растений (5-недельных растений см. выше Примечание) и прикрепить крылья. Инвертируйте держателем и наложить на проникновение Ванна с тем, чтобы погрузить листья в инфильтрации подвеска.
Примечание: Убедитесь, что подвеска уровень достигает верхней поверхности держателя завода. Поднимите уровень с добавлением дополнительных инфильтрации подвеска, если требуется. - Передача инфильтрации Ванна с погруженной растений в палату инфильтрации и закрыть дверь. Убедитесь, что воздух впускной клапан закрыт на лазутчик. Включите вакуумный насос и откройте клапан Встроенный вакуумный резервуар, следуют вакуумные впускной клапан инфильтрации камеры.
- Как только давление в камере инфильтрации сократилось на 880 мбар, закрыл вакуумные впускного клапана и открыть воздуха впускного клапана. После проникновения палата вернулся в атмосферном давлении, открыть дверь и удалить в бане инфильтрата.
- Поднимите держатель завод пока растения больше не погруженной в инфильтрации подвеска, затем осторожно встряхните держатель, чтобы разрешить превышение подвеска убегала листья обратно в бане инфильтрата.
- Возвращение держателя в вертикальном положении, удалить съемный крылья и удалите растений.
- Повторите шаги 3.1.1 для 3.1.5 проникли нужное количество растений.
- Автоклав используются инфильтрата подвеска перед удалением.
- Автоклав проникновение ванны до повторного использования в последующих экспериментов.
- Стерилизовать интерьер инфильтрации камеры путем очистки с 70% этанола и оставить воздух сухой до повторного использования в последующих экспериментов.
- Удалить съемный крылья держателя заказ завода, вставка 4 растений (5-недельных растений см. выше Примечание) и прикрепить крылья. Инвертируйте держателем и наложить на проникновение Ванна с тем, чтобы погрузить листья в инфильтрации подвеска.
4. растут проникли растений
- Организовать проникли растений из шага 3 при максимальной плотности 100 растений/м2 в парнике.
- Растут на 5 дней, при 25 ° C и 16 h в день света (использование дополнительного освещения при необходимости) и воды ежедневно.
5. урожай проникли листья
- После 5 дней роста урожай листьев.
- Автоклав отходов растительного сырья, горшки и почвы до удаления.
6. сухие собранные листья
Примечание: Точное лиофилизации описанной ниже процедуры зависит от характера имеющихся доступных лиофилизации аппарата.
- Lyophilize листьев заготавливаемым до полного высыхания.
- Место собранные листья в 2 мм толстой полипропиленовый мешок. Заморозить собранные листья, хранение в морозильной камере-80 ° C за 30 мин.
- Перфорировать мешок с много маленьких отверстий, с помощью ПИН-кода. Место мешках замороженные листья в центральной палате лиофилизатор. Обеспечить все колбу вложение краны закрыты и затем включите лиофилизатор. Конденсатора достигает по меньшей мере-50 ° C и давление уменьшает по крайней мере 0,15 мбар, а затем оставить на ночь.
- Выключить лиофилизатор и вент вакуум, открыв кран привязанности колбу. Удаление высушенные листья из Центральной камеры и перейдите к шагу 7.
7. под давлением жидкостной экстракции
Примечание: Шаги производства относятся использование коммерчески доступных PSE документа (см. Таблицу материалы). Пожалуйста, обратитесь к литературе производителя для более подробной информации об операции. Прибор осуществляет 4 извлечений параллельно.
- Измельчить высушенные листья в порошок курс через удобный метод (например, для большинства тритерпеновых соединений интерес использовать внутренние питания процессора, или вручную раздавить листья хотя содержащихся в сумке).
Примечание: Шлифование с пестиком и раствора под жидкого азота обычно нет необходимости.- Смешайте порошок листьев с кварцевым песком (0,3 \u2012 0,9 мм, 20% по объему) в подходящую емкость; Это действует как диспергент и повышает эффективность процесса извлечения.
- Подготовка 4 извлечение клеток (120 мл) для заполнения. Для этого инвертировать извлечение клеток и вставьте стекло волокна фильтра, следуют металла фритты и Холдинг вилку. Возвращение извлечение клеток в вертикальном позиции и добавить 1 см глубокий слой кварцевого песка (0,3 \u2012 0,9 мм).
- Заполните клетки добычи.
- Заполните клетки извлечения подготовленный лист порошок, созданного на шаге 7.1 до линии заполнения. При необходимости, слегка сжать порошок во время этого процесса для облегчения добавления большего количества в каждой ячейке извлечения.
- Добавить небольшой слой песка кварца (0,3 \u2012 0,9 мм) в верхней части Упакованные порошок и вставить фильтр топ целлюлозы.
- Вставить Упакованные извлечение клеток в PSE документа и запустите нужный метод. Использовать следующие параметры и материала; Растворитель: 100% этиловый ацетат; Температура: 100 ° C, давление: 130 бар. Запуск 3 циклов следующим: цикл 1: 0 мин время, цикл 2 и 3: 5 минут время, конец с растворителем флеш 2 мин и 12 мин азот газ заподлицо.
Примечание: Рекомендуется сначала оптимизировать метод экстракции в небольших масштабах. Однако следующий метод часто является достаточным для наиболее окисленных тритерпеновых агликон. Ликер из каждой ячейки извлечения могут быть объединены в то же судно внешней коллекции путем указания линии отходов как добыча назначения, вместо стандартной коллекции отдельных линий. Следует помнить, что количество использованного растворителя зависит от упаковки извлечение клеток и заданной температуры и давления. Выше метод обычно создает около 800 мл ликера извлечения для 4 параллельных экстракции. - Повторите шаги 7.2 для 7.3.3 все порошка листьев был обработан.
- Концентрат ликер комбинированные извлечения к сухости, через Ротари испарения в вакууме. Проверить наличие ожидаемого вывода (то есть, темный зеленый пульпы).
Примечание: Точная процедура может варьироваться в зависимости от набора вверх из доступных роторный испаритель. Всегда носить для защиты глаз при выполнении Ротари испарения и проверить посуда за ущерб, прежде чем подвергать вакуума.- Включите утилизации охладителей и позволяют жидкости остыть до по меньшей мере 5 ° C. Поверните на водяной бане и установите температуру до 35 ° C.
- Передать испарения колбу извлечения ликер (заполнять не более половины объема колбы). Концентрат ликер экстракторах (в к же настой) Если общий объем превышает это. Прикрепите колбе заполненной испарения в пара воздуховод роторный испаритель (безопасный с совместного клипа).
- Отрегулируйте положение лифта колбу и угол, чтобы погрузиться в нижней трети испарения колбу в водяной бане при примерно под углом 45 °. Запустите колбу, спиннинг со скоростью, которая начинает распространяться извлечения ликер вверх стены колбу.
- Обеспечения крана отверстие закрывается и начать, чтобы уменьшить давление (с помощью контроллера вакуумного насоса) до тех пор, пока умеренной капельного наблюдается между конденсатора и приемник колбу.
Примечание: Не позволяйте ликер экстракция начать варить. Если это происходит, уменьшить силу вакуума довести перегонки под контролем. - Контролировать и корректировать скорость вакуума силы и спина в соответствующих случаях, до тех пор, пока весь растворитель испаряется.
8. Основные ионообменные смолы лечение для удаления хлорофиллов
Примечание: Количествах, цитируется в следующих шагах предполагается, оригинальные работы масштаба 100 \u2012 150 растений. Шаг 8 не подходит для продуктов, содержащих группы карбоновые кислоты, или функциональных групп, которые бы гидролизуется в основных условиях таких сложных эфиров.
- Растворите незрелая выдержка, созданного на шаге 7 в минимальным объемом этанола.
- Добавьте 50 мл основных ионообменных смол бусины (см. Таблицу материалов) к выходу шаг 7.1.1 и сотрясения при комнатной температуре за 30 мин.
Примечание: Не заменять, пожимая для использования помешивая аппарат. Магнитные или механической накладные перемешивания может нарушить целостность шарики смолы. Подходящие агитации удобно можно также медленным вращением реакции колбу на роторный испаритель с вакуумной установки при атмосферном давлении или отключен. - Добавить еще 50 мл основных ионообменных смол бисера каждые 30 мин, пока Реакция ушел к завершению; Основные ионообменные смолы бусины будет меняться от розового до зеленого цвета, и жидкой фазы изменится с зеленого на оранжевый или темный коричневый цвет в зависимости от масштаба.
- В случае сомнений, что реакция пошел к завершению, образец 0,5 мл жидкости. Фильтр образец через небольшой столбец диатомит и наблюдать цвета фильтрата; Реакция обычно завершается в течение 1,5 ч.
- Фильтр реакционную смесь через короткий столбец кизельгур.
- Выполните это через вакуум система фильтрации, или через стекло флэш-хроматография столбца с использованием ручной сильфонный применить давление. Если фильтрация скорость замедления, нарушить верхней диатомит площадки помешивая жезлом. Сбор фильтрата.
- Промойте собранных смолы бусы с этанолом, следуют 1:1 этанола: гексан и, наконец, гексан. Используйте полоскания тома достаточно Ресуспензируйте бусы на вершине столбце кизельгур.
- Совместить фильтрата из шага 8.4 и полоскания из шага 8.5 и сосредоточиться досуха Ротари испарения в вакууме.
9. Первоначальные грубой фракционирования
Примечание: Следующий метод обычно подходит для типичных окисленных тритерпеновых агликон и использует инструмент автоматизированного флэш-хроматографии. Обратитесь к литературе производителя для более подробной информации об операции.
- Адсорбирует сырой продукт, созданный на шаге 8 на флэш-класс силикагель (размер пор: 60 Å, размер частиц: 35 \u2012 75 мкм) для приложения Flash-хроматография картриджа через сухой загрузки методологии.
- Растворите сырой продукт, созданный на шаге 8 в минимальный объем подходящих органических растворителей. Обеспечение полного растворения.
Примечание: Дихлорметан с добавлением нескольких капель метанола обычно является подходящим выбором растворителя. - Отвинтить верхней части картриджа заполнены флэш-хроматография 100 g (см. Таблицу материалы) и снимите вставку выявить сухой загрузки пустот. Используйте пространство головы для измерения соответствующий объем силикагель для сухих загрузки.
- Передача измеренного объема силикагель для сухой загрузки в решение сырой продукт, а затем удалить растворителем, роторный испарения в вакууме.
Примечание: Силикагель должен вернуться в сыпучий порошок. В конце нежный соскоб процесс испарения могут потребоваться освободить силикагель от испарения колбу со стороны. - Сбалансировать флэш-хроматография картридж 100 г в 100 мл/мин с по крайней мере 5 томов столбца 100% гексана, но идеально, до тех пор, пока содержимое картриджа полностью и равномерно увлажненной.
- Перенесите подготовленные сухие загрузки силикагель, созданного на шаге 9.1.3 головы пространства сухой загрузки флэш-хроматография картриджа уравновешенной 100 g, при заливке. Подвеска в гексане и широкий рот от удивления пипетки может использоваться для передачи любых оставшихся сухой загрузки силикагель.
- Мокрый, переданных загрузки сухого силикагеля кровать с 100% гексан для удаления воздуха из headspace сухой загрузки.
- Запустите следующий метод хроматографии: растворителя [A]: гексан, растворителя [B]: Этилацетат, скорость потока: 100 мл/мин, градиент: 0% [B] до 100% [B] более 3000 мл, коллекция: собирать все, размер фракции: 250 мл.
- Анализируйте фракций тонким слоем хроматографии (ТСХ)8 или газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС)8и концентрации к сухости fraction(s), содержащие соединения через Ротари испарения в вакууме.
- Растворите сырой продукт, созданный на шаге 8 в минимальный объем подходящих органических растворителей. Обеспечение полного растворения.
- Выполните течению тонкой очистки, пока не будет достигнут желаемый уровень чистоты.
Примечание: Течению тонкой очистки полностью комплекса конкретных и это не позволяет обеспечить стандартизированные шаги (см. раздел "обсуждение").
Representative Results
Типичный изолированных урожайность зависят от комбинации фермента/фермента под расследование, химическая стабильность целевого соединения и как сложный процесс очищения был. Мы уже ранее сообщали отдельные выходы β-очень производные от наших экспериментов комбинаторные биосинтез, начиная от 0,12 до 3,87 мг на грамм сухой порошок листьев н. benthamiana . Эти соединения широко колебались на уровне окисления и включены неестественные сочетания ферментов (рис. 3)8. Этот протокол используется обычно в нашей лаборатории производить десятки или сотни миллиграммов очищенного продукта для структурных характеристик ЯМР спектроскопии и ниже по течению функциональных анализов. Мы также продемонстрировали препаративные полезности этой платформы, производя 0.8 g тритерпеновых эшафот β-очень на чистоту более чем 98%. Этот эксперимент используется 459 растений и представляет собой изолированное урожайность 3,3 мг на грамм сухого N. benthamiana лист порошок8.
Рисунок 1: схема резюме. Схематическое изображение процесса использования переходных выражение биосинтетических ферментов в н. benthamiana лист отвлечь эндогенных запасов 2,3-oxidosqualene к препаративные производства новых продуктов высокой стоимости тритерпеновых. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: вакуумные лазутчик строительство и процесс.) Заказ завод одно крыло держатель отсоединена. b) Bespoke завод держатель крыльев. c) инверсии и погружения растений. d) вставки инфильтрации ванны. Ванна e) инфильтрации в место в зале инфильтрации. f) полная вакуума лазутчик: (1) вакуумный насос (2) подключение вакуумного насоса в вакуумной водохранилище (3) вакуумный резервуар изоляции клапан (4) связь между вакуумный резервуар и инфильтрации камеры (5) манометр (6) воздуха впускного клапана (7) Камеры (8) инфильтрации вакуум водохранилище. g) представитель листья из одного растения, проникли с конструкцией выражение для зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) после пяти дней после проникновения роста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: ранее сообщал представитель результаты для подготовительного производства β-очень производных, используя этот протокол8. Эта таблица упорядочивается по изолированным урожайности. Условно столбцы форматируются с указанием относительного значения цвета. Красный = высокий, зеленый = низкий (хотя промежуточные желтый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Высок через положило инфильтрации вакуум позволяет этот протокол к регулярно использоваться в нашей Лаборатории препаративные производства тритерпеновых соединений, представляющих интерес для различных приложений, вниз по течению. Аппарат вакуумной инфильтрации, описанный здесь легко повторить. Вакуумный резервуар является целесообразным, чтобы уменьшить время, необходимое для тянуть необходимые вакуум, однако это можно просто перепрофилировать неизмененных вакуумной печи как проникновение камеры. Защита вакуумный насос через Добавление подходящих конденсатора теоретически разумное, но в нашей лаборатории мы нашли это ненужным.
Проникновения покрытия нарушается, если листья не являются полностью погружен в инфильтрации подвеска. Эта проблема сводится к минимуму, обеспечивая уровень подвески достигает верхней поверхности держателя растений, и что владелец завода плотное прилегание бане инфильтрата. Из рисунка 2 Обратите внимание, что верхней поверхности держателя завод утоплена в ванну инфильтрации в месте. Это достигается путем панелей по краям среднего держателя, которые формируют опорную точку с верхней части в бане инфильтрата. Проникновение подвеска потребует периодические дополнения для поддержания уровня подвески. Это лучше всего достигается добавлением избыток инфильтрации подвеска для предотвращения постепенного сокращения ОД600 в течение большого загрузочных инфильтрации. Однако в наших руках, замещение воды не кажется иметь заметное влияние на ожидаемые урожаи в препаративных масштабе, хотя это не было quantitively расследование. Как многие растения может быть проникли из одной партии инфильтрации подвеска по-прежнему является открытым вопросом. Мы регулярно проникают между 100 и 200 растений с одной партии инфильтрации подвеска. Кроме того это нормально для некоторых почвы выщелачиваться в подвеска инфильтрации в течение процесса инфильтрации. Это не было установлено, что заметно влияет на эффективность проникновения.
Во время уборки урожая это желательно (но не критично) урожай только листья, которые были проникли (некоторые листья будут выросли после проникновения). Селективный сбор предотвращает разрежения с непродуктивными ткани, которая бы в противном случае повысить соотношение эндогенного примесей относительно комплекса интереса. Это имеет номинального влияние на легкость очистки ниже по течению и увеличивает масштаб этих процессов. При использовании tHMGR для увеличения поставок прекурсоров, разработать на период после проникновения роста часто наблюдается necrosed фенотип. Это нормально и фактически СПИД селективного сбора урожая и ниже по течению процесса сушки. Сушеные листья порошка обычно может храниться в загерметизированном контейнере в прохладном, сухом, темном месте, но в идеале в эксикатор под вакуумом. Это зависит от стабильности состава заинтересованных. Если решили хранить в морозильной камере-80 ° C следует соблюдать осторожность. Убедитесь, что сушеные листья находятся в водонепроницаемый контейнер и на удалении от хранения, разрешить этот контейнер, чтобы нагреть до комнатной температуры до открытия. Невыполнение этого требования приведет к антистатического листьев, препятствуя вниз поток обработки.
Послеуборочных шаги в этом протоколе предоставляются для иллюстративных целей, и для оказания помощи опыт тех исследователей, которые могут иметь ограниченный практический химии. Они могут заменить многие другие методы извлечения/очистки натуральный продукт. Как указано во введении PSE имеет много преимуществ, однако капитальных затрат на коммерчески доступных PSE аппарата может быть непомерно высока, и не важно. Основные ионообменные смолы лечения является очень удобный метод для замены традиционных омыления следуют жидкость/жидкость секционирование. Однако это не подходит для продуктов, содержащих карбоновые кислоты группы или функциональных групп, которые бы гидролизуется в основных условиях, например эфиры. Ожидается, что эти продукты будут храниться на основных ионообменных смол. Однако есть потенциал, чтобы использовать это для записи и выпуска процедуры (не документированы). Там, где традиционные омыления целесообразно, основных ионообменных смол лечения служит удобной альтернативой. Было установлено, что метод хроматографии, описанный в шаге 9, быть обобщению для соединений, описанных в рисунке 3. Однако соединений повышенной полярности может потребовать продолжительного периода элюции 100% этиловый ацетат. Со ссылкой на шаг 9.2 ниже по течению тонкой очистки полностью комплекса конкретных и также зависит от масштаба. Неоднократные раунды меньшего масштаба флэш-хроматографии с оптимизированной градиенты, обычно достаточно для достижения чистоты подходит для ЯМР анализ. В более крупных масштабах кристаллизация часто является удобной альтернативой. В сложных случаях в зависимости от желаемого количества изолированных соединения могут быть использованы препаративные или полу препаративные высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Примеры процессов течению очистки для ряда представительных соединений можно найти в другом месте8.
Текущий протокол, как здесь представлены, обычно используется в нашей лаборатории и доказала свою полезность. Однако есть еще значительные возможности для дальнейшей оптимизации выражение платформы. Работа продолжается в нашей лаборатории расследовать как дальнейшие пути инженерных и дифференциальный контроль над уровнях выражения протеина может улучшить тритерпеновых производства далее, при посреднической токсичности для клеток хозяина. Существует также вероятность расследовать манипуляции внутриклеточных транспортных систем20,21и направление ферментов для различных клеточных отсеков22,23, пути, которые могли бы улучшить эффективность окисления нескольких событий. Можно также изучить потенциальные выгоды для изменения базовой морфологии основных органеллы. К примеру гиперэкспрессия мембраны домена Arabidopsis thaliana HMGR наблюдается побудить гипертрофия эндоплазматического ретикулума растений24; Основные сайта для CYP450 деятельности. Этот протокол идеально подходит для производства миллиграмм на грамм шкала количества тритерпеновых продуктов и может применяться в условиях исследований для доступа соединений ниже по течению исследования (например, систематическое изучение структура активность отношения и предварительные расследования для фармакокинетические и фармакодинамические свойства соединения свинца клинический интерес). Однако платформа линейно и надежно масштабируемой, просто увеличив количество растений используется и практичности переходных выражения через agroinfiltration была продемонстрирована в промышленных масштабах для производства фармацевтических протеинов 14, таким образом существует потенциал для этой платформы, чтобы быть продлен для коммерческого производства тритерпенов высокой стоимости. Кроме того, это также возможно представить производства стабильных трансформантов носить окончательный желание градиентный биосинтетических путь, позволяющий массового культивирования и продолжающееся «выращивание» трансгенных N. benthamiana штаммы производство различных соединений коммерческой ценности.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа получила поддержку исследований студенчества Норвич по парк (JR), Совместный инжиниринг и физических наук исследовательский совет/биотехнологий и финансируемых СИББН Совета исследований биологических наук научно-исследовательский центр синтетической биологии OpenPlant Грант (BB / L014130/1) (M.J.S., А.О.); Джон Иннес Центр обмена знаниями и коммерциализации Грант (BB/KEC1740/1) (B.B.); и СИББН Институт стратегической программы грантов «Молекулы от природы» (BB/P012523/1) и Фонда Джона Innes (даф). Мы хотели бы поблагодарить Джордж Lomonossoff для предоставления векторов pEAQ и Эндрю Дэвис для фотографии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC-MS instrument | any | n/a | |
| Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
| Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
| Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
| Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
| Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Standing incubator | any | n/a | |
| Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
| Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
| 9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
| Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
| Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
| Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
| Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
| Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
| Balance (2 figures) | any | n/a | |
| Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
| A -80 freezer | any | n/a | |
| Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
| Safety glasses | any | n/a | |
| Lab coat | any | n/a | |
| Autoclave | any | n/a | |
| Consumables | |||
| Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
| Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
| Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
| Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
| Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
| Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
| Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
| Reagents | |||
| Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
| Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
| Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
| LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
| Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
| Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
| Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| Ethanol | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q water | any | n/a | |
| Levington F1 Compost | any | n/a | |
| Levington F2 Compost | any | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
| Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |
References
- Thimmappa, R., et al. Triterpene biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).
- Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins. Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).
- Roy, A., Saraf, S. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).
- Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).
- Liby, K. T., Sporn, M. B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease. Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).
- Yadav, V. R., et al. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer. Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).
- Christensen, L. P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).
- Reed, J., et al. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).
- Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).
- Peyret, H., Lomonossoff, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).
- Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
- Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).
- Voinnet, O., et al. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).
- Holtz, B. R., et al. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals. Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).
- Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).
- Kaufmann, B., Christen, P. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction. Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).
- Larsen, E., Christensen, L. P. Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables. Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).
- Sainsbury, F., et al. Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways. Methods Enzymology. , 185-202 (2012).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA Cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).
- Ting, H., et al. SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).
- Wang, B., et al. Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
- Nielsen, A. Z., et al. Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis. ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).
- Dong, L., et al. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209, 679-690 (2016).
- Ferrero, S., et al. Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells. Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).
