Summary
Övergående heterologa uttryck av biosyntetiska enzymer i Nicotiana benthamiana blad kan vidarekoppla endogena leveranser av 2,3-oxidosqualene mot produktion av nya värdefulla triterpene produkter. Är häri beskrivs ett detaljerat protokoll för snabb (5 dagar) förberedande produktion av triterpenes och analoger utnyttja denna kraftfulla växt-baserade plattform.
Abstract
Triterpenes är en av de största och mest strukturellt olika familjer av naturliga växtprodukter. Många triterpene derivat har visat sig ha medicinskt relevant biologisk aktivitet. Hittills dock har denna potential inte översättas till en uppsjö av triterpen-härledda läkemedel i kliniken. Detta är utan tvekan (åtminstone delvis) en följd av begränsade praktiska syntetiska tillgång till denna klass av förening, ett problem som kan kväva utforskandet av struktur-aktivitetssamband och utveckling av ledande kandidater av traditionella läkemedel kemi arbetsflöden. Trots sin enorma mångfald, triterpenes är alla härstammar från en enda linjära föregångare, 2,3-oxidosqualene. Övergående heterologa uttryck av biosyntetiska enzymer i N. benthamiana kan vidarekoppla endogena leveranser av 2,3-oxidosqualene mot produktion av nya värdefulla triterpen-produkter som inte naturligt produceras av denna värd. Agro-infiltration är ett effektivt och enkelt sätt att uppnå övergående uttryck i N. benthamiana. Processen omfattar infiltration av växtblad med en suspension av Agrobacterium tumefaciens bär den uttryck construct(s) av intresse. Samtidig infiltration av en ytterligare A. tumefaciens stam bär en uttryck konstruera kodning ett enzym som ökar föregångare utbudet avsevärt ökar avkastningen. Efter en period av fem dagar, kan infiltrerade leaf materialet skördas och bearbetas för att extrahera och isolera den resulterande triterpene produkt(er). Detta är en process som är linjärt och tillförlitligt skalbar och helt enkelt genom att öka antalet plantor som används i experimentet. Är häri beskrivs ett protokoll för snabb förberedande produktion av triterpenes utnyttja denna växt-baserade plattform. Protokollet använder tredjeparts enkelt replikerbar vakuum infiltration utrustning, som tillåter samtidiga infiltrationen av upp till fyra fabriker, aktivera batch-wise infiltration av hundratals växter i en kort tidsperiod.
Introduction
Triterpenes är en av de största och mest strukturellt olika familjer av naturliga växtprodukter. Trots sin enorma mångfald tros alla triterpene naturliga produkter härledas från den samma linjära föregångare 2,3-oxidosqualene, en produkt av den mevalonate vägen i växter. Ringbildning av 2,3-oxidosqualene är initieras och styrs av en familj av enzymer som kallas oxidosqualene cyclases (OSCs). Detta ringbildning steg representerar den första nivån av diversifiering, med hundratals olika triterpene ställningar har rapporterats från naturen1. Dessa ställningar är mer diversifierad genom att skräddarsy enzymer inklusive, men inte begränsat till, cytokrom p450s (CYP450s)1,2. Sådana biosyntetiska vägar kan leda till enorma komplexitet, ibland resulterar i färdiga produkter som är knappt igenkännliga från den överordnade triterpen. Till exempel tros den komplexa strukturen av den potenta insektsdödande och antifeedant limonoid azadirachtin härröra från en tetracyclic triterpene av tirucallane typ3.
Många triterpen-derived naturliga produkter, även de med relativt oförändrad överordnade ställningar, har visat sig ha medicinskt relevant biologisk aktivitet4,5,6,7. Hittills dock har denna potential inte översättas till en uppsjö av triterpen-härledda läkemedel i kliniken. Detta är utan tvekan (åtminstone delvis) en följd av begränsade praktiska syntetiska tillgång till denna klass av förening, ett problem som kan kväva utforskandet av struktur-aktivitetssamband och utveckling av ledande kandidater av traditionella läkemedel kemi arbetsflöden.
Övergående uttryck för triterpene biosyntetiska enzymer från andra växtarter i N. benthamiana blad kan vidarekoppla endogena leveranser av 2,3-oxidosqualene mot produktion av nya värdefulla triterpene produkter (figur 1). Denna process kan användas att funktionellt karakterisera kandidat enzymer och rekonstruera den biosyntetiska vägar av viktigt naturligt metaboliter. Likaså kan den även utnyttjas i kombinatoriska biosyntetiska metoder att producera roman triterpene produkter, en strategi som kan resultera i bibliotek av strukturellt relaterade analoger, vilket gör att systematiskt utforskande av de struktur-aktivitetssamband biologiskt aktiva bly föreningar8,9.
Agroinfiltration är ett effektivt och enkelt sätt att uppnå övergående uttryck i N. benthamiana blad. Processen omfattar infiltrationen av bladen med en suspension av A. tumefaciens bär det binärt uttryck construct(s) av intresse. Detta uppnås via tillämpningen av trycket som tvingar av vätskan genom de stomata, tränger undan luften i intercellulära utrymmet, och ersätta den med A. tumefaciens fjädring. Bakterierna överföra de respektive T-DNAs till inre av växtcellerna, vilket resulterar i lokaliserade och övergående proteinuttryck i den infiltrerade bladvävnad.
Medan varje binärt vektor som är lämplig för generering av transgena växter får anställas för övergående uttryck, vi använder den Ögonböna mosaik Virus CPMV-derived Hypertranslational (HT) protein uttryck system10, 11. i detta system genen sevärdheter ligger flankerad av oöversatta regioner (UTR) från den CPMV RNA-2. Det 5' UTR innehåller ändringar vilket resulterar i mycket höga halter av protein översättning med ingen tillit till virusreplikation12. Denna teknik har utvecklats till den Easy-och-Quick (pEAQ) binära vector-serien som innehåller sitespecifika rekombination kloning protokoll-kompatibel konstruktioner (pEAQ -HT- DEST)10,11. De flesta pEAQ vektorer också innehålla en tomat yvig stunt virus-derived P19 ljuddämpningssystemet suppressor genen13 inom T-DNA del av uttrycket kassett, som kringgår behovet att coinfiltrate en separat P19-carrying stam och ger mycket hög nivå proteinuttryck i mottagande växten cell10,11.
Användning av N. benthamiana som ett uttryck-värd har särskilda fördelar när du arbetar med växt biosyntetiska vägar. Cell arkitekturen stöder egensäkra lämpliga mRNA och proteinprocessningen och korrekt uppdelning, förutom besitter den nödvändiga Co-enzymer, reductases (för CYP450s) och metaboliska prekursorer. Kolkälla är fotosyntes; växter kan således helt enkelt odlas i bra kvalitet kompost, som kräver endast vatten, CO2 (från luften) och solljus som indata. Plattformen är också mycket praktiskt för samtidig uttryck av olika kombinationer av proteiner, eftersom detta kan uppnås facilely genom samtidig infiltrationen av olika stammar av A. tumefaciens, förneka behovet av att bygga stora multigene uttryck kassetter. Dessutom kan processen vara linjärt och tillförlitligt skalas helt enkelt genom att öka antalet plantor som används i experimentet.
Tidigare arbete i vårt laboratorium har visat nyttan av denna plattform för preparativ skala experiment. Detta inkluderade utarbetandet av romanen triterpenes för användning i bioaktivitetsanalyser och skala upp för att uppnå gram kvantiteter av isolerade produkt. Dessutom ansamling av heterogen triterpene produkter kan ökas flera vik av samtidig uttryck av en N-terminal-stympad, feedback-okänsliga form av 3-hydroxi-, 3-methyglutary-coenzym en reduktas (tHMGR), en anslutningshastighet uppströms enzym i mevalonate väg8.
Nyckeln till sådana förberedande-skala experiment är förmågan att bekvämt upp-skala infiltration processen. I en typisk experiment, kan tiotals till hundratals växter behöva uppnå målet antalet isolerade produkt. Infiltrera enskilda blad för hand (med en onödigt spruta) är operativt krävande och ofta orimligt tidskrävande, vilket gör denna metod opraktiskt för rutinmässig skala upp. Vakuum infiltration erbjuder fördelar över hand infiltration, eftersom det inte är beroende av kunskapsnivån för operatören och tillåter infiltrationen av ett större område av blad yta. Denna procedur används kommersiellt för storskalig produktion av farmaceutiska proteiner14. Detta protokoll använder tredjeparts enkelt replikerbar vakuum infiltration utrustning, som kan konstrueras från kommersiellt tillgängliga delar. Detta tillåter samtidiga infiltrationen av upp till 4 växter, ger snabba och praktiska batch-wise infiltration av hundratals växter i en kort tidsperiod (figur 2a -2b). Vakuum infiltration apparaten består av en vakuumtorkugn som bildar infiltration kammare (figur 2f). Ugnen är kopplad till en pump via en vakuum reservoar. Detta minskar den tid som krävs för att uppnå önskad vakuum i infiltration kammare. Växter är säkrade i en skräddarsydd hållare och inverterad till en 10 L rostfritt stål vattenbad fylld med A. tumefaciens suspension (figur 2a -2 c). Fullständig nedsänkning av antennen delar av växterna är viktigt för effektiv infiltration. Vattenbadet sedan placeras inom infiltration kammare (figur 2d -2e), och det vakuum som tillämpas för att dra luften ur blad interstitiell utrymmen. När trycket har reducerats av 880 mbar (en process som tar ca 1 min) infiltration kammare förs snabbt tillbaka till atmosfärstryck 20-30 s genom att öppna ugnen inloppsventilen, varefter infiltration är klar.
Fem dagar efter infiltration är växtmaterial redo för skörd och efterföljande utvinning och isolering av de önska produkterna. Från denna punkt är processen helt enkelt en av naturlig produkt extraktion och rening från leaf material, ett arbetsflöde som är bekant för någon naturlig produkt kemist. Det finns15många olika metoder för inledande extraktion och efterföljande rening. Det lämpligaste valet av metoder och de exakta villkoren som används är starkt beroende av särskilda kemiska egenskaper hos sammansatta av intresse, förutom tillgången på kompetens eller utrustning. Det är inte möjligt att inkludera i detta protokoll en fullt generaliserbart, steg för steg metod för efterföljande bearbetning av skördade blad växtmaterial till isolerade produkt som kunde följas blint för någon triterpene produkt av intresse, inte heller skulle det vara lämpligt att försöka göra så. Dock kommer detta protokoll ger en översikt över grundläggande arbetsflödet används i vårt laboratorium och några metoder för att tidigt i processen, vilket enligt vår erfarenhet har visat sig vara generaliserbara för mest syresatt aglycone triterpene produkter. Detta inkluderar två relativt ovanligt tekniker, nämligen trycksatt lösningsmedel utvinning (PSE), och en bekväm heterogen fas metod för klorofyll borttagning med hjälp av ett starkt grundläggande jonbytare.
PSE är en mycket effektiv teknik för utvinning av små organiska molekyler från fasta matriser. Extraktioner utförs under tryck (ca. 100-200 bar), den största fördelen är förmågan att använda lindras temperaturer som överstiger den kokande peka av extraktionslösning. Detta kan avsevärt minska den tid och mängden spädningsvätska som krävs för att uppnå en uttömmande utvinning, jämfört med andra heta lösningsmedel tekniker såsom enkla refluxing eller Soxhlet extraktioner16. Kommersiella bänk PSE instrument finns tillgängliga, som använder utbytbara utvinning celler och automatiserade lösningsmedel hantering, värme och övervakning. Detta gör denna teknik mycket bekvämt. Det är också utan tvekan mindre farligt, särskilt för operatörer med begränsade praktiska kemi erfarenhet.
Förtvålning av råa blad extrakt med återloppskylare följt av vätska/vätska partitionering är en vanlig teknik för bulk avlägsnande av klorofyller före efterföljande rening eller analys. Men kan detta ofta vara operativt krävande i större skala. Detektering av gränssnitt eller produktförlust på grund av bildandet av emulsioner kan dessutom vara problematiskt. Användning av starkt grundläggande jonbytarmassor att utföra heterogen fas hydrolys kan fungera som ett praktiskt alternativ. Den pigmenterade delen av hydrolyserat klorofyll förblir klibbade till harts och helt enkelt kan avlägsnas genom filtrering. Detta protokoll använder tredjeparts en preparativ skala anpassning av en tidigare rapporterade analytiska procedur17 som sysselsätter en kommersiellt tillgänglig grundläggande-jonbytare.
Nedan beskriver vi ett snabbt och detaljerade protokoll för preparativ skala produktion av triterpenes utnyttja denna växt-baserade plattform. Detta protokoll används rutinmässigt i vårt laboratorium att förbereda tiotals till hundratals milligram av isolerade triterpene produkt för program sådan en strukturell karaktärisering av kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, eller vidare studier i funktionella analyser.
Protocol
Obs: Innan du följer detta protokoll, bekanta dig med material safety data för alla ämnen som används, och vidta lämpliga försiktighetsåtgärder. Dessa inkluderar men begränsas inte till: Bär skyddsglasögon när du arbetar med glas under vakuum, och hantering av torr kiselgel i dragskåp. Det är också viktigt att lokal lagstiftning om arbetar med transgent material kontrolleras och observerade, inklusive följande lämpliga inneslutningsåtgärder förfaranden.
1. generera A. tumefaciens stammar för Infiltration
Obs: Vi erbjuder här en förenklad beskrivning av de steg som krävs för att generera lämplig A. tumefaciens stammar för övergående uttryck. Ytterligare detaljer om dessa steg beskrivs av Sainsbury o.a. 8.
- Förstärk med PCR eller syntetisera protein kodande regionen av genen sevärdheter flankerad av 5' 3' attB sekvenser lämplig för generering av en post-klon för användning med en platsspecifik rekombination kloning protokoll18,19.
- Använd framåt primer: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN, Reverse primer: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN (NNNN... = sekvens specifika sekvens).
- Användningsförhållanden (representativ) PCR: reaktion blandning (25 µL, totalt), buffert (5 x, 5 µL, se Tabell för material), dNTP (10 mM, 0,5 µL), Forward primer (10 µM, 1,25 µL), Reverse primer (10 µM, 1,25 µL), mall DNA (variabel koncentration, 50 – 250 ng, 0,5 µL ), DNA-polymeras (2000 U/mL, 0,25 µL, se Tabell för material), Nuclease-fritt vatten (till 25 µL). Kör termocyklern enligt följande: inledande denaturering (98 ° C, 30 s); Starta cykeln (98 ° C, 30 s; 45 – 72 ° C, 20 s; 72 ° C, 30 s/kb) avsluta cykeln; 35 cykler; slutliga förlängning (72 ° C, 10 min).
- Följ en standard platsspecifika rekombination kloning protokoll18,19 till generera en post-klon med någon icke-kanamycin-baserade posten vektor (vi använder pDONR207 som är kommersiellt tillgängliga).
Obs: Integriteten hos posten klonen ska bekräftas med sekvensering, innan du använder att generera pEAQ -HT-DEST1 uttryck konstruktion. PEAQ -HT-DEST1 finns tillgänglig på begäran från Lomonossoff laboratoriet vid John Innes Centre i Norwich, UK. - Isolera pEAQ -HT-DEST1 vector från uttryck klonen som genereras i steg 1.1.3 och förvaras vid-20 ° C före användning i steg 1.3.
Obs: Alla kommersiellt tillgängliga bekvämt spin kolumnbaserade plasmid rening kit utformad för att extrahera plasmider från kloning stammar av E. coli är lämplig. Följ instruktionerna valt plasmid rening kit (se Tabell för material).
- Förbereda kemiskt behöriga A. tumefaciens för omvandling.
- Inokulera en selektiv LB (Luria-Bertani medium: 10 g/L bacto-trypton, 10 g/L NaCl och 5 g/L jästextrakt, agar 10 g/L pH 7,0) agarplatta (50 μg/mL rifampicin, 100 μg/mL streptomycin), av strimmor A. tumefaciens LBA4404 från en glycerol lager kultur. Inkubera över natten vid 28 ° C i en stående inkubator.
- Inokulera 50 mL selektiva flytande LB-media (50 μg/mL rifampicin, 100 μg/mL streptomycin) med ett urval av A. tumefaciens LBA4404 celler från steg 1.2.1. Inkubera över natten vid 28 ° C i en skakande inkubator på 200 rpm.
- Cool kulturen från steg 1.2.2 på is i 10 min och sedan pellet A. tumefaciens cellerna genom centrifugering vid 4 ° C och 4500 x g för 5 min (Kassera supernatanten).
- Återsuspendera pelleten från steg 1.2.3 i 1 mL iskallt 20 mM vattenlösning CaCl2 och upprepa centrifugering steg från steg 1.2.3 (Kassera supernatanten).
- Återsuspendera pelleten från steg 1.2.4 i 1 mL iskallt 20 mM vattenlösning CaCl2 och alikvot resulterande suspensionen i till 50 µL partier. Blixt frysa alikvoter i vätska N2 och förvaras vid-80 ° C före användning.
- Omvandla det beredda A. tumefaciens LBA4404 med isolerade pEAQ -HT-DEST1 vector genereras i steg 1.2.
- Tina 50 µL av A. tumefaciens suspensionen genereras i steg 1.2 på is, och inkubera med 100 \u2012 200 ng av isolerade pEAQ -HT-DEST1 vektor, genererade i steg 1.1, vid 0 ° C i 5 min.
- Kalla chock ruvade fjädringen från steg 1.3.1 i vätska N2 för 30 s, låt värmas upp till rumstemperatur.
- Tillsätt 200 μl av SOC medium (SOC: 20 g/L bacto-trypton, 5 g/L jästextrakt, 0,58 g/L NaCl, 0,19 g/L KCl, 2.03 redov MgCl2, 2.46 HB magnesiumsulfat 7-hydrat, 3,6 g/L glukos) till kalla chockad upphängningen från steg 1.3.2 och inkubera i 4 h på 28 ° C i en skakande inkubator på 200 rpm.
- Inokulera en selektiv LB agar tallrik (50 μg/mL rifampicin, 50 μg/mL kanamycin, 100 μg/mL streptomycin) med SOC kulturen från steg 1.3.3. Spred sig grundligt, och Inkubera under 3 dagar vid 28 ° C i en stående inkubator.
- Inokulera 5 mL av selektiv LB media (50 μg/mL rifampicin, 50 μg/mL kanamycin, 100 μg/mL streptomycin) med en enda koloni från steg 1.3.4. Inkubera över natten vid 28 ° C i en skakande inkubator på 200 rpm.
- Tillsätt 200 μl glycerol till 1 mL av den flytande kulturen från steg 1.3.5, blanda väl och förvara vid-80 ° C.
Obs: Denna kultur kan återupplivas för framtida experiment av strimmor på LB agarplattor med lämplig antibiotika (beskrivs nedan).
2. Förbered Infiltration Suspension
- Inokulera en selektiv LB agarplatta med stråk av önskad A. tumefaciens stammar från glycerol lagerför kulturer som genereras i steg 1. Inkubera över natten vid 28 ° C i en stående inkubator.
Obs: En stam som transporterar tHMGR inom en pEAQ -HT-DEST1 vector kan också inkluderas.- Inokulera 50 mL av selektiv LB media med ett prov av varje A. tumefaciens stam odlas i steg 2.1 och inkubera över natten vid 28 ° C i en skakande inkubator på 200 rpm individuellt.
- Överför 50 mL kulturerna från steg 2.1.1 till 1000 mL selektiv LB media (rifampicin 50 μg/mL, kanamycin, 50 μg/mL streptomycin 100 μg/mL) och inkubera över natten vid 28 ° C i en skakande inkubator på 200 rpm individuellt.
- Pellet individuellt den A. tumefaciens genom centrifugering (4000 x g), från de flytande kulturer som genereras i steg 2.1.2 (Kassera supernatanten).
- Individuellt Omsuspendera pellets från steg 2.1.3 i 50 mL nyberedd MMA buffert (MMA buffert: 10 mM 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic syra, pH 5,6 (KOH), 10 mM MgCl2, 150 μM 3'5 '-dimetoxi-4'-acetofenon) och inkubera i rumstemperatur mörker för 1 h.
- Kombinera lämplig volym av varje A. tumefaciens MMA suspension (genererade i steg 2.1.4) att producera en sista OD600 av minst 0,2 för varje stam i en 10 L total slutlig volym.
- Lägga till ytterligare MMA buffert i de kombinerade suspensioner som genereras i steg 2.1.5 till en slutlig volym av 1 L (Använd omedelbart i steg 3).
Obs: Det är lämpligt att förbereda en ytterligare 2 L infiltration suspension för att bibehålla den flytande under processen infiltration. - Laga 1 L 10 x styrka MMA buffert.
3. utför vakuum Infiltration
Obs: Se figur 2 för en beskrivning av vakuum infiltration apparater konstruktion. Använd 5-vecka-gammal N. benthamiana växter i 9 x 9 cm krukor anvisningar om förfarandet. Plantorna bör sås i F1 kompost (t.ex. från Levington) och odlas för 2 veckor innan de överförs till individuella krukor som innehåller F2 kompost. Växter bör odlas i ett växthus vid 25 ° C, med 16 h per dag av ljus (använda kompletterande belysning när krävs), vatten dagligen, maximal densitet 100 växter/m2.
- Överföra 1 L infiltration suspension som genereras i steg 2 och 1 L 10 x styrka MMA buffert till infiltration bad, följt av en ytterligare 8 L vatten.
- Ta bort hållaren för skräddarsydd anläggning avtagbara vingar, sätt 4 växter (5 veckor gamla växter se föregående not) och sätt tillbaka vingarna. Invertera hållaren och placera ovanpå infiltration badet så att doppa bladen i infiltration avstängning.
Obs: Säkerställa suspension nivån når den övre ytan av innehavaren av anläggningen. Höja nivån med tillägg av extra infiltration fjädring vid behov. - Överföra infiltration badet med Undervattensväxter till infiltration kammare och Stäng luckan. Se till Luftinloppssventilen är stängd på infiltrator. Slå på vakuumpumpen och öppna inline ventilen till vakuum reservoaren följt av vakuum insugsventilen på infiltration kammare.
- När trycket i infiltration kammare har minskat med 880 mbar, stänga vakuum inloppsventilen och öppna Luftinloppssventilen. När infiltration kammare har återgått till atmosfärstryck, öppna dörren och ta bort infiltration badet.
- Höja växt innehavaren tills plantorna inte längre är nersänkta i infiltration avstängning, sedan skaka försiktigt innehavaren så att överflödig suspension att köra av bladen tillbaka in i infiltration badet.
- Tillbaka hållaren till upprätt läge, ta bort de löstagbara vingarna och ta bort växterna.
- Upprepa steg 3.1.1 till 3.1.5 tills önskat antal växter har infiltrerats.
- Autoklav används infiltration suspensionen före deponering.
- Autoklav infiltrationen bad före återanvändning i efterföljande experiment.
- Sterilisera interiören av infiltration kammare av rengöring med 70% etanol och låt luften torr före återanvändning i efterföljande experiment.
- Ta bort hållaren för skräddarsydd anläggning avtagbara vingar, sätt 4 växter (5 veckor gamla växter se föregående not) och sätt tillbaka vingarna. Invertera hållaren och placera ovanpå infiltration badet så att doppa bladen i infiltration avstängning.
4. växa infiltrerade växterna
- Ordna de infiltrerade växterna från steg 3 med en maximal täthet för 100 plantor/m2 i växthus.
- Växa i 5 dagar vid 25 ° C och 16 h per dag av ljus (Använd kompletterande belysning när det behövs), och vatten dagligen.
5. skörda infiltrerade bladen
- Efter 5 dagar av tillväxt, skörda bladen.
- Autoklav avfall växtmaterial, krukor och jord före deponering.
6. torka skördas bladen
Obs: Exakta frystorka den proceduren som beskrivs nedan beror på arten av de tillgängliga frystorka den apparaten tillgängliga.
- Lyophilize skördas bladen tills de är torra.
- Placera skördas bladen i en 2 mm tjock polypropylen påse. Frysa skördas bladen genom att lagra i frysen-80 ° C i 30 min.
- Perforate påsen med många små hål med en nål. Plats i säckar fryst bladen i den centrala kammaren av lyophilizer. Säkerställa alla kolv fastsättning kranar är stängda och slå sedan på lyophilizer. Säkerställa kondensorn når minst-50 ° C och trycket minskar minst 0,15 mbar och sedan lämna över natten.
- Stäng av lyophilizer och ventilera vakuum genom att öppna en kolv fastsättning kran. Ta bort de torkade bladen från den centrala kammaren och fortsätt till steg 7.
7. trycksatt vätskeextraktion
Obs: Förfarande stegen avser användning av ett kommersiellt tillgängliga PSE-instrument (se Tabell för material). Hänvisas till tillverkarens litteratur för mer detaljerad information om operationen. Instrumentet utför 4 extraktioner parallellt.
- Mala torkade blad till en kurs pulver via en bekväm metod (t.ex. för de flesta triterpene föreningar av intresse använda en inhemsk matberedare, eller manuellt krossa bladen medan som ingår i en påse).
Obs: Slipning med en mortelstöt och murbruk under flytande kväve behövs vanligtvis inte.- Blanda det blad pulvret med kvartssand (0.3 \u2012 0,9 mm, 20% volym) i en lämplig behållare; Detta fungerar som en dispergeringsmedel och förbättrar effektiviteten i utvinningsprocessen.
- Förbered 4 utvinning celler (120 mL) för fyllning. För detta, Invertera utvinning cellerna och infoga filtret glas-fiber, följt av metall fritta och hålla kontakten. Returnera utvinning celler till upprätt position och lägga till en 1 cm djupa lager av kvartssand (0.3 \u2012 0.9 mm).
- Fyll utvinning cellerna.
- Fyll utvinning cellerna med den förberedda bladpulver som genereras i steg 7,1 upp till maxstrecket. Om det behövs, försiktigt komprimera pulvret under denna process att underlätta tillägg av ett högre belopp i varje cell utvinning.
- Lägga till en liten lager av kvartssand (0.3 \u2012 0.9 mm) till toppen av den packade pulver och infoga topp cellulosa filtret.
- Infoga packade utvinning cellerna i PSE instrumentet och köra önskad metod. Använd följande inställningar och material; Spädningsvätska: 100% etylacetat; temperatur: 100 ° C, tryck: 130 bar. Kör 3 cykler enligt följande: cykel 1: 0 min spärrtiden, cykel 2 och 3: 5 min. Håll tid, avslutas med en 2 min lösningsmedel flush, och 12 minuters kväve gas spola.
Obs: Det är lämpligt att först optimera extraktionen metoden i liten skala. Följande metod är dock ofta tillräckligt för mest oxiderade triterpene agliconi. Sprit från varje utvinning cell kan kombineras i samma externa samling fartyg genom att ange raden avfall som utvinning destination, i stället för standard enskilda samling raderna. Vara medveten om mängden lösningsmedel som används är beroende av förpackning av utvinning cellerna och den inställda temperaturen och trycket. Ovanstående metod genererar vanligtvis cirka 800 mL av utvinning sprit för 4 parallella extraktioner. - Upprepa steg 7,2 till 7.3.3 tills allt bladpulver har bearbetats.
- Koncentrera sig kombinerade utvinning sprit till torrhet, via roterande avdunstning under vakuum. Kontrollera om förväntade utdata (dvs, mörk grön slurry).
Obs: Det exakta förfarandet kan variera beroende på uppsättningen upp av tillgängliga rotationsindunstaren. Alltid bär skyddsglasögon när du utför roterande avdunstning och kontrollera glasvaror för skador innan du utsätter för vakuum villkor.- Slå på den kylmaskin återvinnare, och tillåter värme överföring vätskan svalna till minst 5 ° C. Slå på vattenbad och Ställ in temperaturen till 35 ° C.
- Överföra utvinning sprit till en avdunstning kolv (Fyll inte mer än halva volymen av kolven). Koncentrera sig sprit batch-wise (i till samma kolven) om den totala volymen överstiger detta. Fäst fyllda avdunstning kolven vapor-kanalen av rotationsindunstaren (säkert med en gemensam klipp).
- Justera kolven hiss position och vinkel, så att doppa botten tredje av avdunstning kolven i vattenbadet på ett ungefär 45 ° vinkel. Starta kolven snurrar med en hastighet som börjar spridas utvinning sprit upp väggarna i kolven.
- Säkerställa vent kranen stängs och börja minska trycket (med registeransvarige av vakuumpump) tills en måttlig dropp observeras mellan kondensor och mottagaren kolven.
Obs: Låt inte den extraktion sprit att börja koka. Om detta inträffar minska styrkan i vakuum att föra destillation under kontroll. - Övervaka och justera med vakuum styrka och spin hastighet som lämpliga tills all vätska är avdunstat.
8. grundläggande jonbyte harts behandling för avlägsnande av klorofyller
Obs: De kvantiteter som anges i följande steg anta en ursprungliga arbetande skala 100 \u2012 150 plantor. Steg 8 lämpar sig inte för produkter som innehåller karboxylsyra grupper eller funktionella grupper som skulle vara hydrolyserat grundläggande villkor såsom estrar.
- Lös den råa extrakt som genereras i steg 7 i en minimal mängd etanol.
- Tillsätt 50 mL grundläggande jonbyte harts pärlor (se Tabell för material) till produktionen av steg 7.1.1 och skaka i rumstemperatur i 30 min.
Obs: Inte ersätta skakar för användning av omrörning apparater. Magnetiska eller mekaniska overhead omrörning kan äventyra integriteten av harts pärlor. Lämpliga agitation kan också bekvämt uppnås genom långsam rotation av reaktionskolven på en roterande indunstare med vakuum vid atmosfärstryck eller frånkopplad. - Lägga till ytterligare 50 mL av grundläggande jonbyte harts pärlor varje 30 min tills reaktionen har gått till fullbordan; grundläggande jonbyte harts pärlor kommer att ändras från rosa till grön i färgen, och den flytande fasen ändras från grönt till orange eller en skumma brun färg beroende på skalan.
- Om i tvivel om att reaktionen har gått till slutförande, prova 0,5 mL av vätskan. Filtrera provet genom en liten kolonn av kiselgur och observera färgen av filtratet; reaktionen är oftast klar inom 1,5 h.
- Filtrera reaktionsblandningen genom en kort kolonn av kiselgur.
- Utföra detta via dammsugarfilter, eller via en glaskolonn flash kromatografi med hand bälgen för att använda tryck. Om filtrering grästillväxten, störa toppen av kiselgur pad med en omrörningsanordning spö. Samla upp filtratet.
- Skölj insamlade harts pärlor med etanol, följt av 1:1 etanol: hexan, och slutligen hexan. Använd en skölj volym tillräckligt att resuspendera pärlor på toppen av kolumnen kiselgur.
- Kombinera filtratet från steg 8,4 och sköljningar från steg 8,5, och koncentrera till torrhet genom roterande avdunstning under vakuum.
9. första grov fraktionering
Obs: Följande metod är vanligen lämpligt för typiska oxiderat triterpene agliconi och sysselsätter ett automatiserat flash kromatografi instrument. Se tillverkarens litteratur för mer information om operationen.
- Adsorbera de rå produkt som genereras i steg 8 på flash grade kiselgel (porstorlek: 60 Å, partikelstorlek: 35 \u2012 75 μm) för ansökan till en flash kromatografi patron via torr lastning metodik.
- Lös den rå produkt som genereras i steg 8 i en minimal volym av lämplig organiskt lösningsmedel. Säkerställa fullständig upplösning.
Obs: Diklormetan med tillägg av några droppar metanol är vanligtvis ett lämpligt val av lösningsmedel. - Skruva av toppen av en 100 g förfylld flash kromatografi patron (se Tabell av material) och ta bort insatsen för att avslöja torrt huvud lastutrymmet. Använd huvudet utrymmet för att mäta lämplig volym av silica gel för torr lastning.
- Överför en uppmätt volym av silica gel för torr lastning till lösningen av rå produkt och ta sedan bort lösningsmedlet av roterande avdunstning under vakuum.
Obs: Kiselgel bör återvända till en lättrinnande pulver. Mot slutet av den avdunstning process skonsam skrapning kan åläggas att gratis kiselgel från sidan av avdunstning kolven. - Temperera den 100 g flash kromatografi patronen på 100 mL/min med minst 5 kolumn volymer 100% hexan, men helst tills patronen innehållet är fullständigt och enhetligt fuktade.
- Överföra den beredda torr lastning kiselgel som genereras i steg 9.1.3 till torrt huvud lastutrymmet på skakad 100 g flash kromatografi patronen, genom att hälla. Suspension i hexan och bred mun pipett kan användas för att underlätta överföring av eventuella återstående torr lastning kiselgel.
- Våta överförda torr lastning kiselgel säng med 100% hexan ta bort luft från den torra lastning headspace.
- Kör följande kromatografi metoden: lösningsmedel [A]: hexan, lösningsmedel [B]: etylacetat, flöde: 100 mL/min, lutning: 0% [B] till 100% [B] över 3000 mL, samling: samla alla, bråkdel storlek: 250 mL.
- Analysera fraktionerna av tunt lager kromatografi (TLC)8 eller gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS)8och koncentration till torrhet i fraction(s) som innehåller sammansatta av intresse via roterande avdunstning under vakuum.
- Lös den rå produkt som genereras i steg 8 i en minimal volym av lämplig organiskt lösningsmedel. Säkerställa fullständig upplösning.
- Utföra efterföljande fina rening tills önskad nivå av renhet uppnås.
Obs: Nedströms fina rening är helt sammansatta specifika och det är inte möjligt att tillhandahålla standardiserade steg (se diskussionsavsnittet).
Representative Results
Typiska isolerade avkastning är beroende av kombinationen enzym/enzym under utredning, mål föreningen kemiska stabilitet och hur utmanande reningsprocessen var. Vi har tidigare rapporterat isolerade avkastning av β-amyrin derivat från våra kombinatoriska biosyntes experiment sträcker sig från 0,12 till 3.87 mg per gram pulver N. benthamiana blad. Dessa föreningar mellan allmänt av oxidation, och inkluderade onaturliga kombinationer av enzymer (figur 3)8. Detta protokoll används rutinmässigt i vårt laboratorium för att producera tiotals eller hundratals milligram av renad produkt för strukturell karaktärisering av NMR spektroskopi och nedströms funktionella analyser. Vi har också visat preparativ nyttan av denna plattform genom att producera 0,8 g av de triterpen byggnadsställning β-amyrin på en renhet av mer än 98%. Detta experiment används 459 växter och representerar en isolerad avkastning 3,3 mg per gram torr N. benthamiana blad pulver8.
Figur 1: Schematisk Sammanfattning. Schematisk bild av processen utnyttjar övergående uttryck av biosyntetiska enzymer i N. benthamiana leaf att avleda endogena leveranser av 2,3-oxidosqualene mot förberedande produktion av nya värdefulla triterpene produkter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: vakuum infiltrator konstruktion och process. en) Bespoke växt hållare ena vingen lossnat. b) Bespoke växt hållare vingar bifogas. c) Inversion och nedsänkning av växter. ( d) införande av infiltration badet. e) Infiltration bad inom infiltration kammare. f) komplett vakuum infiltrator: (1) vakuum pump (2) anslutning från vakuumpumpen till vakuum reservoar (3) vakuum reservoar isolering valve (4) anslutning mellan vakuum reservoar och infiltration kammare (5) tryckmätare (6) Luftinloppssventilen (7) Infiltration kammare (8) vakuum reservoar. g) representant lämnar från en växt infiltrerade med en uttryck konstruktion för grönt fluorescerande protein (GFP) efter fem dagar efter infiltration tillväxt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: tidigare rapporterat representativa resultat för preparativ produktion av β-amyrin derivat med detta protokoll8. Den här tabellen beställs av isolerade avkastning. Kolumner är villkorligt formaterade med färgindikering av relativa värde. Rött = hög, grön = låg (men mellanliggande gul). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Kick-genom-satte vakuum infiltration tillåter detta protokoll att användas rutinmässigt i vårt laboratorium för preparativ produktion av triterpene föreningar av intresse för olika nedströms tillämpningar. Vakuum infiltration apparaten beskrivs här replikeras enkelt. Tillägg av vakuum reservoaren är tillrådligt att minska den tid som krävs för att dra nödvändiga dammsuga, men det är möjligt att helt enkelt återanvända en omodifierad vakuum ugn som infiltration kammare. Att skydda vakuumpumpen via tillägg av en lämplig kondensor är teoretiskt förnuftiga, men i vårt laboratorium har vi funnit att det är onödigt.
Infiltration täckning äventyras om bladen inte är helt nedsänkt i infiltration avstängning. Problemet minimeras genom att säkerställa att nivån av suspensionen når den övre ytan av innehavaren av växten, och att innehavaren av en växt är en tight passform för infiltration bad. Observera från figur 2 att den övre ytan av innehavaren av anläggningen är infälld i infiltration badet när på plats. Detta uppnås genom paneler på mellersta kanterna av innehavaren som bildar fästpunkten med toppen av infiltration badet. Infiltration suspensionen kräver periodiska tillägg att bibehålla suspension. Detta uppnås bäst genom tillsats av överskjutande infiltration suspension förhindra gradvis sänkning av OD600 under loppet av en stor batch-wise infiltration. Dock i våra händer verkar ersättning för vatten inte ha en märkbar effekt på förväntad avkastning i preparativ skala, även om detta har inte kvantitativt undersökt. Hur många växter kan infiltreras från en batch infiltration suspension är fortfarande en öppen fråga. Vi infiltrera rutinmässigt mellan 100 och 200 växter med ett parti av infiltration suspension. Dessutom är det normalt för vissa jord att läcka ut i infiltration suspensionen under loppet av infiltration processen. Detta har inte visat sig ha en märkbar effekt på infiltration effekt.
Under skörden är det tillrådligt (men inte kritiska) att skörda bara de blad som var infiltrerat (några blad kommer har vuxit efter infiltration). Selektiv skörd förhindrar utspädning med improduktiva vävnad, vilket annars skulle öka förhållandet mellan endogena orenheter i förhållande till sammansatta av intresse. Detta har en nominell effekt på användarvänlighet nedströms rening och ökar omfattningen av dessa processer. När du använder tHMGR för att öka föregångare leverans, är en necrosed fenotyp ofta observeras för att utveckla under tillväxtperioden efter infiltration. Detta är normalt och faktiskt stöd selektiv skörd och efterföljande torkningen. Det torkade blad pulvret kan vanligtvis lagras i en sluten behållare i en sval, torr, mörk plats, men helst i exsickator under vakuum. Detta beror på stabiliteten i sammansatta av intresserade. Var försiktig om du väljer att lagra i-80 ° C frys. Se till att de torkade bladen är i en vattentät behållare och vid utlagringen, tillåta denna behållare till rumstemperatur före öppning. Underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i rewetting av bladen, hindrar nedströms behandling.
Efter skörd stegen i detta protokoll tillhandahålls för illustrativa syften och stöd de forskare som kan ha begränsad praktisk kemi erfarenhet. De kan ersätta många andra naturprodukt utvinning/rening tekniker. Som beskrivs i inledningen, PSE har många fördelar, huvudstaden kostar emellertid av kommersiellt tillgängliga PSE apparater kan vara oöverkomliga och det är inte nödvändigt. Grundläggande jonbyte harts behandling är en mycket bekväm metod för att ersätta traditionella förtvålning följt av vätska/vätska partitionering. Det passar dock inte för produkter som innehåller karboxylsyra grupper eller funktionella grupper som skulle vara hydrolyseras under grundläggande villkor, såsom estrar. Dessa produkter skulle förväntas bibehållas på grundläggande jonbytaren. Dock finns det potential att utnyttja detta för en fånga och släpp förfarande (inte dokumenterats här). Där traditionella förtvålning vore lämpligt, fungerar grundläggande jonbyte harts behandling som ett bekvämt alternativ. Kromatografi metoden som beskrivs i steg 9, har befunnits vara generaliserbara för de föreningar som beskrivs i figur 3. Föreningar av ökad polaritet kan dock kräva en 100% etylacetat eluering längre. Med hänvisning till steg 9,2, nedströms fina rening är helt sammansatta specifika, och är också beroende på skala. Upprepade rundor av småskaliga flash kromatografi med optimerad lutningar, är oftast tillräcklig för att uppnå en renhet som är lämpliga för NMR analys. I större skala är kristallisering ofta ett praktiskt alternativ. I svåra fall, kan förberedande eller semi preparativ högpresterande vätskekromatografi (HPLC) användas beroende på önskad mängd isolerade förening. Exempel på nedströms reningsprocesser för ett antal representativa föreningar kan hittas någon annanstans8.
Det nuvarande protokollet, som presenteras här, används rutinmässigt i vårt laboratorium, och har visat nytta. Det finns dock fortfarande betydande utrymme för ytterligare optimering av uttryck-plattformen. Arbete pågår i vårt laboratorium för att undersöka hur ytterligare väg engineering och differentiell kontroll av protein uttryck nivåer kan förbättra triterpene produktionen ytterligare, medan medla toxicitet till värdceller. Det finns också potential att undersöka manipulation av intracellulära transport system20,21, och riktningen av enzymer till olika cellulära fack22,23, vägar som skulle kunna förbättra effektiviteten i flera oxidation händelser. Potentiella fördelar med att ändra underliggande morfologi av viktiga organeller kan också undersökas. Till exempel har överuttryck av domänen membran av Arabidopsis thaliana HMGR observerats för att inducera hypertrofi av endoplasmatiska retiklet i växter24; en viktig plats för CYP450-aktivitet. Detta protokoll är idealisk för produktion av milligram gram skala mängder triterpene produkter, och kan användas i forskning miljö åt föreningar för nedströms studie (t.ex. systematisk utforskandet av struktur-aktivitetssamband relationer och förundersökningar i farmakodynamiska och farmakokinetiska egenskaper blyföreningar av kliniska intresse). Men plattformen är linjärt och tillförlitligt skalbar helt enkelt genom att öka antalet plantor som används och praktiskhet i övergående uttryck via agroinfiltration har påvisats i industriell skala för framställning av farmaceutiska proteiner 14, finns det alltså potential för denna plattform för att förlängas för kommersiell produktion av högt värde triterpenes. Alternativt, det är också möjligt att föreställa sig produktion av stabila transformants transporterar den slutförda önskan multigene biosyntetiska väg, vilket gör att massa odling och fortsatt 'jordbruk' av transgena N. benthamiana stammar producerar olika föreningar kommersiellt värde.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av en Norwich forskning Park STUDENTTILLVARO (JR), beviljar den gemensamma Engineering och Physical Sciences Research rådet/Biotechnological och biologiska vetenskaper forskning rådet BBSRC-finansierade OpenPlant syntetisk biologi Research Centre (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.); en John Innes Centre kunskapsutbyte och kommersialisering bevilja (BB/KEC1740/1) (B.B.); BBSRC Institute strategiska programmet beviljande 'Molekyler från naturen' (BB/P012523/1) och stiftelsen John Innes (A.O.). Vi vill tacka George Lomonossoff för att tillhandahålla pEAQ vektorerna och Andrew Davis för fotografering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC-MS instrument | any | n/a | |
| Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
| Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
| Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
| Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
| Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Standing incubator | any | n/a | |
| Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
| Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
| 9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
| Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
| Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
| Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
| Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
| Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
| Balance (2 figures) | any | n/a | |
| Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
| A -80 freezer | any | n/a | |
| Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
| Safety glasses | any | n/a | |
| Lab coat | any | n/a | |
| Autoclave | any | n/a | |
| Consumables | |||
| Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
| Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
| Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
| Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
| Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
| Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
| Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
| Reagents | |||
| Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
| Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
| Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
| LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
| Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
| Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
| Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| Ethanol | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q water | any | n/a | |
| Levington F1 Compost | any | n/a | |
| Levington F2 Compost | any | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
| Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |
References
- Thimmappa, R., et al. Triterpene biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).
- Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins. Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).
- Roy, A., Saraf, S. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).
- Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).
- Liby, K. T., Sporn, M. B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease. Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).
- Yadav, V. R., et al. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer. Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).
- Christensen, L. P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).
- Reed, J., et al. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).
- Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).
- Peyret, H., Lomonossoff, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).
- Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
- Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).
- Voinnet, O., et al. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).
- Holtz, B. R., et al. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals. Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).
- Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).
- Kaufmann, B., Christen, P. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction. Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).
- Larsen, E., Christensen, L. P. Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables. Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).
- Sainsbury, F., et al. Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways. Methods Enzymology. , 185-202 (2012).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA Cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).
- Ting, H., et al. SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).
- Wang, B., et al. Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
- Nielsen, A. Z., et al. Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis. ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).
- Dong, L., et al. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209, 679-690 (2016).
- Ferrero, S., et al. Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells. Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).
