Summary
Чтобы проверить тормозящее действие фармакологических агентов на фосфолипаза C (PLC) в различных регионах мозга пчелы, мы представляем биохимического анализа для измерения активности PLC в этих регионах. Этот assay может быть полезным для сравнения PLC активность тканей, а также среди пчел, экспонирование различных поведений.
Abstract
Пчелы-организм модель для оценки сложного поведения и выше функции мозга, таких как обучение, память и разделение труда. Грибные тела (МБ) — выше мозга центр предложил быть нейронных субстрат поведения сложных пчелы. Хотя предыдущие исследования генов и белков, которые выражаются дифференцировано в MBs и других регионах мозга, деятельность белков в каждом регионе еще не понял полностью. Раскрыть функции этих белков в головном мозге, фармакологический анализ целесообразный подход, но сначала необходимо подтвердить, что Фармакологическое манипуляции действительно изменить активность белка в этих регионах мозга.
Мы ранее выявленные выше выражение генов, кодирующих фосфолипаза C (PLC) в MBs чем в других регионах мозга и фармакологически оценку участия PLC в поведении медоносных пчел. В этом исследовании мы биохимически проверили два фармакологических агентов и подтвердили, что они снижение активности PLC в MBs и других регионах мозга. Здесь мы представляем подробное описание о том, как обнаружить PLC деятельность в пчелы мозга огневки. В этой системе пробирного гомогенатах, полученных от различных мозга прореагировало с синтетическими fluorogenic субстрат, и флуоресценции, результатом деятельности PLC количественно и сравнении между областями мозга. Мы также обсудим наши оценки тормозящее действие некоторых лекарств на активность PLC, используя ту же систему. Хотя эта система, вероятно, пострадавших от других эндогенных флуоресценции соединений и/или абсорбция пробирного компонентов и тканей, измерения деятельности PLC, с помощью этой системы безопаснее и проще, чем, с помощью традиционных assay, который требует radiolabeled субстратов. Простые процедуры и манипуляции позволяют нам проанализировать деятельность PLC в мозги и других тканях медоносных пчел, участвующих в различных социальных задач.
Introduction
Европейская медоносной пчелы (Apis mellifera L.) является эусоциальных насекомых, и Женский пчел Показать каста зависимых воспроизводства и зависящих от возраста разделение труда. Например в стерильных касты пчел, упоминаемые как «рабочие», молодых людей кормить выводка, в то время как старые комбикорма нектара и пыльцы вне куст1. Обучение и память, что способность критически важную роль в жизни пчелы, потому что кормоуборочные комбайны должны постоянно идти вперед и назад между источниками продовольствия и их гнезда и затем общаться расположения источников хорошее питание для их nestmates через танец сообщение1. Предыдущие исследования показали, что MB, выше мозговой центр в насекомых, участвует в учить и память способности пчелы2,3,4. Дифференциально выраженной генов и белков были определены в различных регионах мозга пчелы5,6,,78,9,10 ,11, предполагая, что они связаны с уникальными функциями каждой области мозга. Хотя фармакологических ингибирования или активации белка интерес представляет собой хорошо использовать подход к раскрыть функцию белка в пчелы поведение12,13,14, это неизвестно ли все наркотики иметь функциональные последствия в различных регионах мозга медоносной пчелы. Проверка функций таких наркотиков будет укреплять выводы исследования поведенческой фармакологии.
Здесь мы сосредоточены на PLC, один из ферментов, причастных к мыши познания15,16,17,18. PLC кальция триггеры сигнализации от унижающего достоинство фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат (пункт2) в инозитол 1,4,5-trisphosphate (IP-3) и диацилглицерол (ГПДР)19,,2021. IP3 открывает IP3 рецепторов в эндоплазматический ретикулум (ER), приводит к высвобождению ионов кальция от ER. Выпущенные кальция активирует кальция/Кальмодулин зависимая протеинкиназа II (CaMKII) с Кальмодулин и протеинкиназы C (PKC) в присутствии группы доступности базы данных. Обе протеинкиназы участвуют в процессе обучения и памяти22,23, в соответствии с привлечением PLC в этот процесс. ПЛК делятся на подтипы, включая PLCβ, PLCγ и PLCε, на основе их структуры20. Каждый подтип PLC активируется в другом контексте20, и генов, кодирующих эти подтипы дифференциально выражаются в различных тканях. Ранее мы показали, что пчелы MBs выражать гены, кодирующие PLCβ и PLCε подтипы на более высоких уровнях, чем остальные регионы мозга24, и что две пан PLC ингибиторы (edelfosine и неомицина сульфат [неомицин]) снижение активности PLC в различных регионах мозга и, действительно, влияют на обучение и память способность пчел24.
Традиционно Ферментативная активность PLC была измерена с помощью radiolabeled PIP225, который требует надлежащей подготовки, оборудования и средств. Недавно синтетических fluorogenic субстрат PLC был установленным26, что делает его легко оценить деятельность PLC в стандартных лаборатории. Здесь мы представляем подробный протокол для обнаружения деятельности PLC в различных мозга пчелы с использованием fluorogenic субстрата и впоследствии проверить тормозящее действие edelfosine и неомицина на PLC в этих тканях. Потому что протокол требует только основные манипуляции, могут быть применимы к исследования PLC активность в других тканях или областей мозга в пчел, выделенных для различных социальных задач.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. захват нагула пчел
- Приобрести пчелы колонии от локального распространителя.
- Использование насекомых net, поймать добытчик пчел, которые возвращаются в улей с пыльцой Сумки на лапах. Передача пчел к стандартной 50 мл конические пластиковой трубки и крышка трубки (рис. 1). Положите трубку на льду чтобы анестезировать пчел.
Примечание: Носите назначенный куртки для пчеловодства во избежание пчелы. Медсестер пчел также могут быть собраны в зависимости от эксперимента. Чтобы поймать пчел, наблюдать за поведением пчел на гребень воска и поймать пчел, которые совать их головы в расплода ячейки кормить личинок, крыло или грудной клетки, с помощью пинцета. Затем, место пчел в 50-мл пластиковую трубку, крышка трубки и положил его на льду, как указано в шаге 1.2. - Случайно захватить 12 кормоуборочные комбайны.
Примечание: Этот протокол использует два пчел на лот, что приводит к шести лотов. Несколько пчел могут быть перехвачены в одной из труб, и количество пчел в одной трубке не важна, как пчелы в каждой партии объединяются позднее (см. шаг 3.1.1). Держите трубку прохладно летом, как высокая температура в трубе ранит пчел.
2. рассечение мозг пчелы
- В лаборатории место 50 мл на льду для по крайней мере 30 минут6 анестезировать пчел.
- Для подготовки этапа рассечение, складывать кусок зубоврачебный воск в половине (полученный размер составляет около 3,5 x 7,5 см) и вставьте его в пластиковый блюдо (60 x 15 мм).
Примечание: Складчатые воск уверенно удерживает насекомых булавки. - Под бинокулярный микроскоп отделить пчелы от его тела с помощью пинцета и закрепить его на зубоврачебный воск, вставив насекомых булавки на базе каждой антенны держать передней головы в вертикальном положении(рис. 2).
Примечание: Мыть пинцет перед использованием, использование этанола или стерилизации воды. - Налейте достаточно солевой раствор (0,13 моль/Л NaCl, 5 ммоль/Л хлористого калия и 1 ммоль/Л CaCl2-2 H2O) на голову, чтобы покрыть его. Пробить голову снова с контактами, если руководитель плавает в решении. При необходимости используйте ледяной физиологический раствор.
Примечание: Однако, этот протокол работает без холодной физиологический раствор. - Удаление антенн, используя пинцет (рис. 2B).
- Сделайте горизонтальный разрез возле основания антенны и продольно на границе Составные глаза, с помощью скальпеля. Затем сделайте горизонтальный разрез в верхней части головы. Удаление кутикулы, чтобы открыть окно над мозга (рис. 2C).
Примечание: При необходимости мыть скальпеля с этанолом или стерилизации воды перед использованием. - Удаление retinae от глазка и трахею на передней поверхности мозга, используя пинцет (Рисунок 2D).
- Разверните разрез на границе Составные глаза дорсально и вентрально, с помощью скальпеля (2 рисунокE). Далее удалите соединительной ткани между кутикулы Составные глаза и retinae, вставив пинцет непосредственно под глаз кутикулы (Рисунок 2F).
- Отказаться от кутикулы Составные глаза. Выберите спинной советы retinae Составные глаза с помощью пинцета и переместить пинцет в вентральной направлении тщательно слезает retinae (рис. 2G).
- Осторожно удалите оставшиеся трахею на передней поверхности мозга, используя пинцет (Рисунок 2H).
- Вырезать соединительной ткани между мозгом и вокруг ткани, с помощью пинцета и вскрыть мозг от головной капсулы (Рисунок 2H).
- Отделите трахею на задней поверхности мозга, используя пинцет(рисунок 2-я).
- С помощью скальпеля, вырежьте связь между MBs и других регионах мозга рядом с вертикальной лопастями, которые являются частью MBs (Рисунок 2J).
- Место расчлененных MBs и остальные ткани мозга в 1,5 мл пробирок и быстро заморозить их с сухой лед или жидкий азот (рис. 2K). Храните замороженные ткани-80 ° c до использования.
Примечание: Обработка жидкого азота с назначенным Перчатки и вентиляцию, чтобы избежать ожога холодной и удушья. Сухой лед следует также быть осторожно с перчатками. Протокол может быть приостановлена здесь. Рассечение и хранения мозга тканей должна быть выполнена одна пчела одновременно, чтобы избежать деградации белка.
3. Подготовка гомогенатах мозга
- 10 мкл гомогенизации буфера, состоящий из 50 ммоль/Л HEPES-Кох (рН 7,2), 70 ммоль/Л хлористого калия и 1,0 ммоль/Л CaCl2 для замороженных мозгов ткани и гомогенизации ткани в 1,5 мл, вручную применив давления с пестиком пластиковую. Инсульта ткани по меньшей мере 200 x.
Примечание: Выполнение манипуляций, описанных в разделе 3 на льду. Используйте пестик, установку прямо в трубе достаточно разбить тканей, которые легко плыть в буфере гомогенизации.- Гомогенизированные ткани решение передать следующий ткани в партии и гомогенизации ткани таким же образом.
Примечание: На данном этапе объединяются пчел в каждой партии. Этот протокол использует шесть много.
- Гомогенизированные ткани решение передать следующий ткани в партии и гомогенизации ткани таким же образом.
- 30 мкл буфера гомогенизации.
- Центрифуга для образца гомогенизированные ткани для 10 мин на примерно 900 x27 gи 4 ° C.
- Супернатант передать новый 1,5 мл и центрифуги его снова для 20 минут около 9500 x27 gи 4 ° C.
- Место супернатант в новом 1,5 мл. Храните огневки при-20 ° C до использования.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. - Определите концентрацию протеина, с помощью bicinchoninic кислоты (BCA) assay.
- Разбавить 2,5 мкл огневки с 17,5 мкл стерилизации воды (таким образом разбавляя огневки восемь раз) и использовать все разбавленным огневки.
Примечание: Огневки выборки с помощью микропипеткой должны тщательно выполняться из-за его высокой вязкости. - Выполните пробирного BCA, с помощью 0, 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 и 2,0 мг/мл бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 20 мкл в качестве стандартов.
Примечание: Изменить масштаб BCA assay при необходимости, на основе объема огневки и стандартных образцов. Протокол может быть приостановлена здесь.
- Разбавить 2,5 мкл огневки с 17,5 мкл стерилизации воды (таким образом разбавляя огневки восемь раз) и использовать все разбавленным огневки.
4. PLC реакция в гомогенатах мозга
- Подготовить раствор субстрата WH-15 fluorogenic26 , растворенных в воде стерилизовать в 50 мкмоль/Л и храните его при температуре-80 ° C.
Примечание: Обложка растворы, содержащие подложки с пленкой для предотвращения выцветания. - Подготовьте премикс реакции в необходимый объем для достижения следующий состав в 10 мкл реакционной смеси: 50 ммоль/Л HEPES-Кох (рН 7,2), 70 ммоль/Л хлористого калия, 1,0 ммоль/Л CaCl2, 2.0 Дитиотреитол ммоль/Л, 50 мг/Л BSA и 12,5 мкмоль/Л WH-15.
- Разбавьте огневки с гомогенизации буфера, если требуется.
- Mix реакции премикс и огневки, содержащие 1,3 мкг белка в трубу полимеразной цепной реакции (ПЦР) для достижения окончательный объем 10 мкл реакционной смеси.
- Подготовить два типа управления смесей для статистического анализа: Положите огневки, но не WH-15 в смесь (смесь 1 управления) и наоборот (смесь 2 управления).
Примечание: Подготовьте реакции смесей и смесей управления на льду для предотвращения деградации белка и реакция PLC. Управления смесей 1 и 2 используются для обнаружения флуоресценции от огневки и бесплатные субстрата, соответственно.
- Подготовить два типа управления смесей для статистического анализа: Положите огневки, но не WH-15 в смесь (смесь 1 управления) и наоборот (смесь 2 управления).
- Промойте трубку и инкубировать в тепловой cycler для 30 мин при температуре 25 ° C.
- Остановить реакции, добавив 2 мкл 25 бис этиленгликоля ммоль/Л (β-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic кислоты.
Примечание: Суммы соответствующего белка и время реакции варьируются среди экспериментов. Таким образом чтобы оптимизировать условия реакции, может быть необходимо повторить описанные в шагах 4.1-5.3 предварительные эксперименты, изменяя время сумма и инкубации белка, пока флюоресценция увеличивается линейно. Для справки когда используется огневки, полученных из других регионов мозга, реакции обычно работает линейно с 1,3 мкг или меньше белков в течение 30 мин, но линейность уменьшается с по крайней мере 2,7 мкг белка или инкубации время 90 мин или Ло пальцев.
5. Определение флюоресценции, результатом деятельности PLC
- Центрифуга реакционной смеси и управления смеси для 5 минут приблизительно 310 x28 gи передачи 10 мкл супернатант в различных скважин на 384-ну микроплиты, применимых для флуоресценции обнаружения.
Примечание: Для предотвращения выцветания и загрязнение пылью, крышка с фольгой. - Очистка с помощью центрифуги для микроплиты Гонав.
- Установите пластину в Считыватель микропланшетов и обнаружить флуоресценции с технической экземплярах.
Примечание: Волны возбуждения и выбросов находятся 344 Нм и 530 нм, соответственно. Если применимо (в зависимости от Считыватель микропланшетов), перемешивают образец смеси для 5 s перед каждой обнаружения. Протокол может быть остановлено здесь.
6. тест ингибирующее действие фармакологических агентов
- Подготовка запасов решения edelfosine и неомицин в соответствующих концентрациях и хранить их до использования: edelfosine 5,0 ммоль/Л и-20 ° C; Неомицин 550 ммоль/Л и 4 ° C.
- При подготовке премикс реакции, как описано в шаге 4.2., добавьте ингибиторы премикс для достижения соответствующей окончательной концентрации: edelfosine, 1,0 ммоль/Л; неомицин, 0.55 ммоль/л
- Добавьте огневки смеси premixture и надлежащего управления реакции как в шаге 4.4.
- Подготовить три типа управления смесей: Положите огневки и ингибитор, но не субстрата в смесь управления 1; Добавление подложки и АБС битор но не огневки в смесь управления 2; и ингибитора, но не Гомогенат трутневых или субстрат в смесь управления 3.
- Выполните PLC реакции и обнаружения флуоресценции, как описано в шагах 4.5-5.3.
7. Статистический анализ
- Для обнаружения PLC активности с использованием смесей, описанные в разделе 4 Вычислите флуоресценции, производный от реакции между PLC и подложке путем вычитания флуоресценции, излучаемый огневки или бесплатные субстрата следующим.
FL (PLC активность) = Fl (реакция mix) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)}
Примечание: Fl (PLC деятельность), Fl (реакция микс), Fl (ctrl 1) и Fl (ctrl 2) обозначают флуоресценции Бона ФИДЕ , полученных от деятельности PLC, флуоресценции обнаружен в реакционную смесь и управления смесей 1 и 2, соответственно.- После измерения флуоресценции в смеси, как описано в шагах 4.1-5.3 Вычислите Fl (PLC активность) согласно уравнение в шаге 7.1, а затем означает Fl (PLC активность) технического экземплярах для каждого огневки.
- С помощью средней Fl (PLC активность) технического экземплярах, полученного на шаге 7.1.1, снова вычислить среднее Fl (PLC активность) биологических реплицирует MBs и других регионов мозга и сравнивать значения между тканей мозга.
- Для изучения активности PLC в присутствии ингибиторов, с использованием смесей, описанные в разделе 6 Вычислите флуоресценции, производный от реакции среди огневки, субстрат и АБС битор следующим.
FL (PLC деятельность с ингибитором) = Fl (реакция mix) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3)
Примечание: Здесь, Fl (PLC деятельность с ингибитором) является bona fide флуоресценции результате PLC активности в присутствии ингибиторов. FL (реакция микс), Fl (ctrl 1), Fl (ctrl 2) и Fl (ctrl 3) являются флуоресценции сигналы обнаружены в реакционной смеси, смеси управления 1, контролировать смесь 2 и управления смесь 3, соответственно.- После измерения флуоресценции в смеси, как описано в шагах 6.1-6.4 вычислите по формуле в шаге 7.2 Fl (PLC деятельность с ингибитором). Затем получите среднее Fl (PLC деятельность с ингибитором) технического экземплярах для каждого огневки.
- Используя среднее значение, рассчитанное на шаге 7.2.1, вычислить среднее Fl (PLC деятельность с ингибитором) биологических реплицирует, производный от каждой ткани мозга. Сравните Fl (PLC деятельность с ингибитором) и Fl (PLC деятельность), полученные на шаге 7.1.2 в каждой ткани мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Концентрации белка в гомогенатах мозга:
Мы подготовили гомогенатах с помощью добытчик пчел. Вычисляемые белка концентрации в оригинальной гомогенатах показаны на рисунке 3. Приблизительные белка концентрации в оригинальной огневки были следующим образом: 1,5 мг/мл в MBs и 2,3 мг/мл в других регионах мозга. Мы использовали два пчел на лот, и были проанализированы шесть много.
Обнаружение PLC активности в гомогенатах мозга:
В эксперимент мы обнаружили выше флуоресценции в других регионах мозга чем в MBs. Таким образом мы повторил предварительные эксперименты, используя огневки в других регионах мозга и определили время реакции (то есть, 30 мин.) и количество белка (т.е., 1,3 мкг). В результате реакции в этих условиях показана на рисунке 4A. Реакция смеси, содержащие ткани огневки и fluorogenic субстрата выставлены > 4.2-fold выше флуоресценции чем управления смеси, содержащие огневки ткани или fluorogenic субстрата, предполагая, что PLC деятельность обнаружен в смесях реакции. Относительный флуоресценции был примерно 3,4 раза выше в других регионах мозга чем в MBs (Рисунок 4B).
Анализ тормозящее действие фармакологических агентов на активность PLC:
Для изучения эффектов ингибиторов edelfosine Пан PLC и неомицин PLC деятельности, мы провели реакция при наличии 1,0 ммоль/Л edelfosine или 0.55 ммоль/Л неомицин, используя же огневки как проанализированы выше. При наличии edelfosine флуоресценции уровень снизился до примерно 6,0% и 5,4% в MBs и других областях мозга, соответственно, по сравнению с элементами управления без edelfosine (рис. 4C). Лечение неомицина сокращен уровень флюоресценции до 44% и 20%, что неочищенные управляет в MBs и других областях мозга, соответственно (рис. 4D).
Рисунок 1 : Захват пчелы добытчик. Добытчик, возвращаясь к её ульях был захвачен в насекомое сети, и она была лишь в 50-мл конические пластиковую трубку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Схематическое представление процедуры диссекции. (A) осей пчелы мозга, упоминаемых в протоколе показываются. С латеральной стороны рассматривается пчел от головы к передней грудной клетки. (B - K) Фотографии и иллюстрации рассечение процедур указаны. Основной текст для подробной информации см. Представлен только голова пчелы. Иллюстрация трахею опущен. МБС = Грибовидные тела. Соответствуют шкале баров до 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Концентрации белка в гомогенатах мозга ткани. Концентрации белка в оригинальной гомогенатах были измеряется BCA пробирного и рассчитаны. Средние концентрации с стандартных отклонений отображаются. Для каждой партии были использованы два добытчик пчел, и были проанализированы шесть много. МБС = Грибовидные тела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Флуоресценции обнаружения в реакциях. (A) Эта группа показывает флуоресценции в каждой ткани, с или без fluorogenic субстрата. Реакция была исполнена на 30 мин, с использованием 1,3 мкг белка. Считыватель микропланшетов измерялась флуоресценции. Значения образца скважин были исправлены пустой скважинами и показано в произвольных единицах (AUs). (B) Эта группа показывает сравнение флюоресценция между тканей мозга. Данные в группы A были исправлены для управления смесей путем вычитания и нормализуется, рассчитанные флуоресценции в MBs. * P < 0,005, U-тест Манна-Уитни. Панели, C и D показывают относительную флуоресценции в присутствии edelfosine 1,0 ммоль/Л (C) и (D) неомицин 0.55 ммоль/Л. Же гомогенатах используется в панели A и B были проанализированы. Флуоресценции значения были нормализованы по результатам эксперимента управления без медикаментозного лечения для каждой ткани. Данные реакции управления панели C такие же, как группа B. В группе Dвсе гомогенатах были проанализированы снова в другой эксперимент. Приведены значения среднего флуоресценции с стандартных отклонений. Для каждой партии были использованы два пчел, и были проанализированы шесть много. P < 0,05, Вилкоксон подписали ряды тест. Не Hg = управления смесь, не содержащие огневки; МБС = Грибовидные тела. Группы B - D были изменены из Suenami и др. 24 с разрешения издателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Биохимические экспертиза деятельности белка крайне важно для понимания молекулярных сигналов в головном мозге, потому что активность фермента зависит от различных молекул, например субстратов и ингибиторов и может таким образом, изменить вместе с поведение животных (например, обучение и память)5. Пчелы исследований ферментов, таких как ЦАМФ зависимая протеинкиназа A, циклического GMP зависимая протеинкиназа, Петропавловск, фосфорилированных CaMKII и аденилатциклазы сообщается дифференциально выражаться в различных регионах мозга, основанные на иммуногистохимия5,10,,2930,31. Различия в ферментативной активности среди регионов мозга, однако, являются лишь частично сообщил6. Здесь мы описали подробный протокол обнаружения PLC деятельности и оценки тормозящее действие фармакологических агентов в MBs и других регионах мозга.
Есть некоторые возможные факторы вмешательства с флуоресцентным обнаружением. Во-первых это важно для защиты от деградации белка, при выполнении биохимических анализов. В протоколе, описанные здесь требуются быстро диссекции и замораживания мозга. Рекомендуется, что образцы тканей замораживаются и хранятся вскоре после каждого цикла рассечение. Минимизации цикла замораживания/оттаивания огневки также имеет решающее значение для предотвращения ухудшения белка.
В дополнение к деградации белка фон флуоресценции и поглощения в реакционной смеси могут повлиять на результаты в этой системе анализа, потому что PLC деятельность обнаруживается флуоресценции сигнал. К примеру неомицин, растворенных в воде имеет желтый цвет, который затрагивает флуоресценции обнаружения. Хотя мы использовали 0.55 ммоль/Л неомицин, микрокредитование разрежения Стоковый раствор, может потребоваться дальнейшая оптимизация концентрации. Кроме того загрязнение других тканей могут также влияют на результат. Сетчатки, которая определяет визуальные раздражители и содержит пигменты, включает в себя один тип ткани, что потенциально препятствует assay.
С настоящим Протоколом мы обнаружили выше PLC деятельность в других регионах мозга чем в MBs24. Это согласуется с результатами количественного анализа ПЦР обратной транскрипции, который показал, что MBs Экспресс более высокие уровни PLC генов, чем другие ткани мозга24. Это противоречие может быть вызвано WH-15, который свободно плавающего субстрата26и тот факт, что мы не выделяем мембраны и цитозольной фракции гомогенатах мозга. Учитывая, что PLCβ и PLCε ферменты, связанный мембранами перст-32 и может взаимодействовать с эндогенного субстрата2 PIP, количество мембраны дроби в огневки скорее всего влияет на реакции между PLC и WH-15. Еще одно возможное объяснение, что концентрация PLC может быть выше в других регионах мозга чем в MBs из-за различия в темпах производства и/или деградации белка. Следовательно, необходимо уточнить bona fide PLC активности в головном мозге далее дополнительные эксперименты, такие, как с помощью недавно сообщили новый субстрат включены в мембраны33, анализ деятельности связанный мембранами и цитозолевая ПЛК отдельно, или количественного содержания PLCs или Пип2 в каждой ткани мозга.
С учетом вышеперечисленных пунктов пробирного системы PLC, описанные здесь может быть расширена для измерения активности PLC в различных тканях, не оценивается здесь, например желудочно-кишечного тракта, мышцы и репродуктивных органов. Это также возможно для сравнения PLC деятельности между мозги добытчик и медсестра пчел для оценки участия PLC деятельности в различных социальных ролей.
В целом пробирного система, представленная здесь является практически осуществимым вариантом для обнаружения деятельности PLC в гомогенатах ткани, потому что она может быть выполнена с стандартным лабораторным оборудованием, в то время как традиционный подход с использованием radiolabeled пункта2 требует специализированных Услуги, обучение и оборудование для радиоизотопов. Воспользовавшись системой с дальнейшей модификации будет углубить наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе сложного поведения медоносных пчел.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Рисунок 4B - 4 D был изменен с Suenami и др. 24 с разрешения открытого биологии. Авторы выражают благодарность к издателю для разрешения. Эта работа была поддержана человека пограничной науки программы (RGY0077/2016) Шота Suenami и Ryo Миядзаки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), pii: bio028191 (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
