Summary
ここでは、脊髄損傷 (SCI) のマウスモデルで臨床的に関連する皮膚褥瘡 (膿) を誘導する単純な方法を説明します。このモデルは、SCI の患者の治癒の膿の異なる治療の画面に前臨床試験で使用できます。
Abstract
褥瘡 (膿) は一般的な外傷性脊髄損傷 (SCI) の合併症を衰弱させる、骨の出っぱりの周りの軟部組織に発生する傾向があります。しかし、ほとんど知られている SCI の動物モデルの制御の実験設定のコンテキストで創傷治癒への影響について。本研究では完全な科学のコンテキストで膿の単純な非侵襲的、再現性と臨床的に関連するマウス モデルに示します。成人男性マウス (Balb/c, 10 週齢) は、剃毛され、depilated。後脱毛 (24 h)、マウスは完全脊髄損傷 (T9 T10 椎) 続いて椎弓切除術を受けた。直後、マウスの背中の皮膚のひだは解除され次の日間、PU に開発した虚血領域を作成、次の 12 時間行われて 2 つの磁気ディスクの間に挟まれた。負傷者の領域は、3 日目後磁石アプリケーションによって組織の浮腫と表皮の消失を実証しました。膿は自発的に開発し、癒されます。癒し、ただし、SCI マウスより遅い比較傷が逆に科学のレベルの下に作成されたときは、非-SCI マウスを制御するため癒しの違い間みられなかった SCI とコントロールの非-SCI マウス理レベル上傷が作成されたときこのモデルは、皮膚 PU 開発と SCI もこのような傷を癒す治療法をテスト後の治癒過程のダイナミクスを検討する可能性がある便利なツールです。
Introduction
圧力潰瘍 (膿) は、外傷性の科学1の主要な合併症です。膿は、皮膚および/または患者が座っているまたは1を横になっているときに、体重が集結している骨の出っぱりに通常発生する基になる組織にローカライズされた傷害です。皮膚、脂肪、および筋肉は、ローカライズされた虚血、組織の炎症、機械的損傷、壊死2,3の開発につながるこの一定の圧力にさらされています。
膿の開発は、圧力・せん断、期間、皮膚の水分と温度、傷害長寿、一般的な皮膚の衛生状態の大きさを含むいくつかのローカル要因の影響を受けます。一般的な物理的な条件、骨と筋組織形態と強度4、患者の年齢、血液対策、性別、婚姻状況、教育なども社会経済的要因などの役割を果たす全身的要因もあります。所得4,5。
予防と膿の治療科学における重要な課題のままです。SCI 患者は、おそらく弱い瘢痕組織と保護の感覚1の不足のための 60-85% の再出現率を症例の 30 〜 40% で膿を開発します。したがって、膿は SCI の患者の再入院につながるし、全体的なヘルスケア ・ システム5,6,7,8,9 (80% 以上 SCI 対のみ) 重要な財務負担をもたらす,10。
我々 の知る限りになかった研究の適切な動物モデルの欠乏のための PU の治癒過程における科学の影響を調査する実験制御の設定。ここでは、皮膚の PU の再現性と臨床的に関連するマウスのモデルを説明します。PU 発症とその後の癒しのダイナミクスを研究するほか、PU を防止または癒しの科学のコンテキストで PU を改善する潜在的な治療アプローチをテストする、このモデルを使用することができます。
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Protocol
ラトガース大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールに従ったすべての動物取扱および外科プロシージャを行った。マウスは、標準的な食事とアドリブの水を供給しました。
1. 手術と非手術器械の準備
- オートクレーブの手術と非手術器械を滅菌します。
- 70% エタノールで外科手術台をきれいにし、37 ° C に加熱パッドをウォーム アップ
- オペレーティング テーブルの上に加熱パッドを配置し、滅菌外科用ドレープでそれをカバーします。
注:すべての生存の手順で「ノータッチ」手法は、無菌性を維持するためにここで使用します。
2. 動物の T9 T10 脊椎椎弓切除を行う準備
- アダルト (Balb/c) 10 週齢雄マウスを調達します。5% イソフルレン吸入器の先頭を使用してそれぞれの動物の麻酔し、手順の残りの部分のための鎮静を維持するために 2-3% に低下します。
- 尻尾か足ピンチによる侵害受容刺激への応答を引き出すことないが完全な麻酔を確認します。
- 残りの髪を削除する脱毛クリーム (3 分) を適用し、電気クリッパーと背 (頭/尾) に髪を剃る。最後に、水/濡れているスクラブを実行すると背を洗うし、自分のケージに動物を返します。
注:これは皮膚と皮膚が負傷した時の化学物質汚染に追加の刺激を避けるために必要です。 - 次の日は、手術中に乾燥から目を保護し、betadine スクラブと 70% のエタノールの 3 の代替製剤で皮膚をこすって角膜に眼軟膏を適用します。
- メス、T8 T12 椎体のレベルで背面の正中線に沿って皮膚切開 (~1.0-1.5 cm) を実行します。
注:椎体のレベルは、戻って T13 椎11,12に対応する浮動肋骨の位置 T13 から椎体をカウントすることによって識別されます。 - 傍脊柱筋群へのアクセスを取得し、ゆっくりと棘突起と双方のラミナを公開するそれらを解剖する皮下脂肪をオフにします。
注:過剰な出血、または脊髄への損傷は、この時点を避けるために非常に慎重にこの手順を行います。 - Microdissecting 鉗子を使用して脊髄をそっと剥がして脊髄 (T9 T10 椎) を公開する椎弓切除術を行います。
注:傷害の作成が容易に脊髄の過剰を露出するように、椎弓切除術を実行します。コントロール群では、椎弓切除術のみが実行されます。
3. T9 T10 完全脊髄損傷を実行します。
- 鉗子を使用して、脊柱の彎曲を誇張するを持ち上げ、T8 で脊柱を固定します。
- 良いはさみを使用して、完全断裂を確保するため、脊柱管の床に T9 と T10 の椎骨の間の脊髄のセクションします。
- 手術顕微鏡下で完全断裂を観察し、脊髄外科サイト閉鎖前に追加の保護を提供するために椎弓切除術のサイトに皮下脂肪の一部を適用します。
- 最後に、傷を閉じると傍脊柱筋、連続縫合糸を使用して、浅筋膜を縫合し、皮膚縫合クリップ12を使用してを閉じます。
- ポスト-SCI、次の日に腸の動きを観察ただし、避難マニュアル膀胱による膀胱を管理します。
注:通奏低音マウス スケール (BMS) はことを 2 日目で後肢の機能回復のポスト-SCI の進行状況を監視するために使用、その後、毎週、補足図 111,12,13を参照してください。
4. 完全な SCI 後皮膚褥瘡の誘導
- SCI 手術直後後 betadine と 70% アルコールで動物の背中をスクラブします。
- SCI のサイトの下の PU、仙骨、0.125% ブピバカイン ソリューション等距離の場所 ~0.5-1.0 cm 以外は、磁石アプリケーション サイトを楕円に 25 G 針を使用しての非常に小さい量 (10 μ L) 近くの背側皮膚に注入します。
注:SCI サイト上記 PU の頸部近く背の皮膚を注入します。 - 軽くマウスの背中の皮膚のひだを持ち上げて 2 磁気ディスク (5 × 12 mm の直径、2.4 g、3800 G の磁気力) で挟む (図 1)。11,12
- 磁石アプリケーション、1 つのケージに戻り動物が置いた後すぐに加熱パッドは、完全な意識までは (図 1) を取り戻した。
- 磁気応用の 12 h 後軽くイソフルランと動物を麻酔し、磁石を削除します。PU の初期の外観を記録する、傷のサイトの写真を撮る (日 0 時間ポイント)。乾燥や汚染を避けるために透明ドレッシング フィルム (3 M) で傷をカバーしてください。
5. 術後の動物の世話、安楽死、と組織学のティッシュのコレクション
- 手術後すぐに動物皮下水分補給のための 0.9% 生理食塩水 1 mL を注入します。
- 鎮痛のため、すぐにブプレノルフィン SR (1 mg/kg) を皮下注入します。
- 2 回毎日手動膀胱避難とセファゾリン (50 mg/kg の 3-7 日間)、皮下動物毎日メロキシカム (1 mg/kg) を挿入します。
- 1 つのケージに動物を配置し、アクセス可能な食糧を提供する水の自由。完全な sci マウスは、前肢を使用して歩くし、食料と水難しさなしにアプローチできます。
- SCI 術後後 7 日外科用クリップを削除します。
- SCI と皮膚が負傷した後必要な時点で安楽死14AVMA 要領に基づいて CO2吸入 (3-5 分) で動物を安楽死します。
- 傷ついた皮膚を採取、24 h の 10% ホルマリンで固定し、断面まで 4 ° C で 70% エタノールに保管します。
- 組織を処理、パラフィンに埋め込むし、ミクロトームで薄切片 (5 μ m) を生成します。ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 組織形態 (図 3) を視覚化するために染まります。免疫組織化学的研究 (図 4)、セクション キ67 適切な抗体を用いた染色 (増殖)、CD31 (血管新生) と α-平滑筋アクチン Kumar ら12に記載 (α SMA)
注:画像解析ソフトウェアは、イメージの機能12を定量化する使用できます。
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Representative Results
このプロトコルは、の完全な科学は簡単に設定で PU を作成します (図 1に示されている) として、すべてマウスに完全な SCI 容認磁石非常によく (図 1 c、1 d、1 階、1 hの 12 h の元の位置に残って).すべてのマウスは、正常の組織 (図 1e, 1 g, 1i) の橋で区切られた 2 つの円形傷を開発しました。負傷の初期応答はマウス SCI (図 1e) なしまたは sci SCI サイト (図 1 g) の科学サイト (図 1i) 上下に似ていた。
図 2は、SCI マウスにおける科学のレベルの下に作成の傷でかなり低速移行を伴いポスト マグネット取り外しとその再現性、7 日目で、3 日目に表皮の消失を示しています。
圧力傷以前に発行された基準12に従って等級別になった。図 3と図 4 SCI の癒しの機能を描写し、非 SCI マウスを制御します。SCI グループ展示遅い癒し、瘢痕領域が大きく、薄い表皮と真皮と増殖中の細胞密度が低い (キ67+細胞)、血管 (CD31+細胞) と皮の傷で α-平滑筋アクチン (α-SMA+)11,12。
皮の傷が作成されなかった図 5に示すように、SCI のレベル上治癒にかかる時間の変更表皮及び真皮非 SCI コントロールと比較した場合に、厚さまたは瘢痕領域が見られました。
図 1:非科学で傷を圧力を作成するための実験 (n = 3)、完了-SCI マウス (n = 3).研究室で 1 週間の慣れ後、マウスは剃毛されたし、(、) を depilated しました。磁気ディスク (M) 配置 (b, Stadler et al.15から変更) の模式図。磁気ディスク、通常のマウスとその活動 (d, c) 檻の中の麻酔からの回復後の肌背上の配置。SCI のマウス、ディスク (f) 下に配置することができます。 または SCI (h) 上記サイトします。非-SCI (e) および SCI マウス (g、 i) の無傷の皮膚橋で区切られた 2 傷を示しています M アプリケーションの 12 h 後すぐに磁石による皮膚傷害の領域が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 皮膚創傷 (H & E 染色) 組織と表皮の傷幅。M 塗布後 7 日目の 3 日目、非科学 (コントロール + M) で初期効果 M 誘発虚血、再灌流を研究するグループを完了-SCI (科学 + M) マウスのセットをはらいました。矢印は、上皮層が淡く消えるをある表皮の傷のエッジを示しています。スケール バー = 1 mm. 各グループで測定される表皮の傷幅 (n = 各時点で 3) より低いパネルの図で表されます。統計的有意性は、スチューデント t 検定によって決まります。* p < 0.05 と * * p < 0.01。データは、平均 ± SEM (平均値の標準誤差) に掲載されています。この図は、神経、35, 6, 815 824 (2018 年)、新しいロッシェル、ニューヨーク12メアリー アン リーバート社刊の雑誌から許可を変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: M 誘起 PU 開発と癒しの完全な SCI の影響。非科学 (コントロール + M) および 21 日間の期間にわたって PU 誘導後完了-SCI (科学 + M) マウスの皮膚の傷の画像は (、) 代表。スケール バー = 1 cm。 (b) 限定傷画像時間の関数として傷の閉鎖の割合を示します。(c、 d)非科学と科学マウス瘢痕領域を示す癒された傷の代表的なイメージ。(e) 限定瘢痕領域 SCI マウス対非科学。(f, g)表皮 (E、二重矢印) を示す (H & E 染色) 治癒創傷皮膚の代表的な組織 (D、大規模な二重矢印)、真皮、脂肪層 (F)。スケールバー = 100 μ m。 時に癒された傷の表皮および真皮の厚さの定量化 (h) 傷の閉鎖 (非-SCI、21 日、35 日 SCI マウス) の。データは、統計的有意性続いて事後フィッシャーの LSD テストとスチューデントの t 検定分散分析によって決定 mean±SEM として掲載されています。* p < 0.05 * * p < 0.01 と * * * p < 0.001。この図は、神経、35, 6, 815 824 (2018 年)、新しいロッシェル、ニューヨーク12メアリー アン リーバート社刊の雑誌から許可を得て転載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: キ67、CD31、および非科学と科学のマウスの皮膚潰瘍では SMA の表現。日 21 (コントロール + M) 35 (SCI + M) ポスト PU 誘導のすなわち、傷口の閉鎖後創部の組織が収穫されました。5 μ m 厚いセクションの代表的な画像アンチ キ67、アンチ CD31、抗 α SMA とステンド グラスし、40 x 目的を視覚化しました。非科学を d( g) および SCI (b, e, h) マウスの代表的なイメージはキ67 の分布を示す+、CD31+と α SMA+ (いくつかの染色領域に茶色の汚れ、赤矢印ポイント).グループ (c、 f、私) 画像解析によって得られる表現の % の肯定的な領域を比較しています。3 つの 40 から地域の平均 x のセクション (2/マウス、各グループのマウス 3) ごとのフィールド (傷のエッジから 2 つ) と創傷センターから 1 つ。データは、平均 ± SEM. 統計の意義は、スチューデントの t 検定によって決定されたように表示されます。この図は、神経、35, 6, 815 824 (2018 年)、新しいロッシェル、ニューヨーク12メアリー アン リーバート社刊の雑誌から許可を得て転載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:SCI 影響開発と科学サイト上の潰瘍の治癒にします。非科学 (コントロール + M) と (、) の観察期間にわたって SCI (科学 + M) マウスの潰瘍の代表的なイメージ。スケール バー = 1 cm。21 日に瘢痕領域は円で表される (a) と非科学と科学マウス (b) の値の平均をとる。(C) の時間の関数として傷の閉鎖の割合を示す定量化の傷画像。(E, 小型の二重矢印) 表皮と真皮 (D、大規模な二重矢印) を示す治癒皮膚潰瘍の代表的な組織は。スケールバー = 100 μ m (d)。創傷閉鎖時 (21 日) に癒される皮膚潰瘍の表皮および真皮の厚さの定量化。データは、posthoc ・ フィッシャーの LSD テストまたはスチューデント t 検定によって SEM. 統計意義分散分析によって決定後平均 ± として表されます。NS 統計的に有意ではないです。この数字を変更して神経、35, 6, 815 824 (2018 年)、新しいロッシェル、ニューヨーク12メアリー アン リーバート社刊の雑誌から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: SCI マウスの運動機能は、受傷後日 2、それから毎週に BMS のスコアを使用して評価された。2 日目、5 週目で BMS スコアが 0.058 ±0.058 (中央値 0 なし動き、n = 17) と 0.35±0.12 (n = 17、中央値 0)。データは、mean±SEM として表されます。この数字を変更して神経、35, 6, 815 824 (2018 年)、新しいロッシェル、ニューヨーク12メアリー アン リーバート社刊の雑誌から許可を得て転載。この図をダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
本研究ではプロトコルでは、膿は SCI の創傷治癒への影響を評価するための新しい実験モデルについて説明します。皮膚の膿は、背側皮膚のひだは、上または SCI のサイトの設定の 2 つの 12 mm 径ディスク磁石の 12 h アプリケーション経由で誘導された.データは、SCI をマウスの皮膚創傷治癒を遅らせることを示します。重要なは、専用に SCI レベル上で作った傷として、SCI の神経レベルの下の皮の傷で作られたこれらの観察とこうして残った神経、非科学マウスと比較して、治癒パターンに大きく影響を受けませんでした。
記載 PU プロトコルは、マグネット15なし 12 h で区切られた 12 h 磁気応用の 3 つのサイクルで弱い磁石 (1000 ガウス) をつけたマウスで使用される以前に公開された方法に基づいています。当初は、磁気応用の 2 つ、および 3 つの 12 h サイクルを使用して、1 つを比較しました。繰り返されるアプリケーションを使用しての欠点では、特別な注意皮膚のひだから磁石をデタッチし、正確に同じ場所で再適用する必要がありますたびに。単一のアプリケーションは、はるかに簡単ですマウス背部皮膚のひだに PU を作成するのに十分だった。それ以外の場合、この方法は、複雑な装置を必要としないおよび動物の動きを損なうことはありません非常に再現できます。研究異なる磁石のサイズ、形状とや強みを使用または別の解剖学的場所で膿を作成しようは、プロトコルを再び最適化する必要があります。すべての皮膚創傷治癒研究を適切に適用し、乾燥と創傷床の汚染を避けるために覆っている透明フィルムを定期的に変更することが重要です。
このモデルにおける PU の機構は皮膚の毛細血管と静脈灌流圧を大幅に超えると予想される病変を誘発する以前、よく記載されている 2 つの磁石の間圧縮力に依存しているより大きい動物16。単一の 12 h サイクルを使用して、基準15によると I および II の段階に対応する真皮に深く拡張する怪我をした皮膚潰瘍が作成されます。この技法の制限の 1 つは、我々 はステージ III IV PU を取得することができなかったことです。したがって、1 つは筋肉と骨 PU 開発と私たちの現在のモデルの大幅な変更のない癒しの関与を勉強できませんでした。さらに、生成する膿は自然に治るし、したがって、忠実に表さない慢性 PU として人間の患者で見られるかもしれない。興味深いことに、しかし、メソッドは同様ダイナミクスとして一般的に使用される 1 × 1 cm の全層切除皮膚傷を閉じて最初の同じようなサイズの PU につながった。PU 誘導法の基になる組織層 carnosus スペア切除モデルでは完全に排除されている間。したがって、それは組織層 carnosus がマウスおよび他の齧歯動物の主に線維芽細胞と真皮内に実行可能な傷のサイトを囲む芽を介する収縮を介して発生する創傷閉鎖過程で大きな役割を担わない表示されます。小さな瘢痕形成17。
PU 誘導、SCI、上下のサイトが科学のサイトにアクセスするために使用する皮膚切開と干渉しません。したがって、全身の創傷治癒に及ぼす科学対ローカルを区別できる研究を可能にする科学のレベルの上または下、メソッドが容易に適用します。非科学動物は PU 誘導後体重を増加し続け、SCI 動物の成長をわい小であります。この深遠な全身の変化にもかかわらず創傷治癒受けませんでした PU が SCI レベル上作成されたとき。このモデルは、創傷治癒のローカル支配の役割を理解するため、使用できます。SCI を含むすべての研究では、特別なケアと膀胱の手動排水を必要とする、ポスト-SCI マウスに監視することが重要だと腸の状態と予防的抗生物質治療11,12 の監視.
SCI 患者が実質的に最高の病院でのケアと教育があっても挑戦し、皮膚膿が米国の医療システムに多額のコストを伝えます。このモデルにより、皮膚 PU 発達におよぼす SCI のサイド ・ バイ ・ サイドの評価と PU SCI の患者の治癒過程を助けるかもしれない様々 な治療上の作戦をテストするためのプラットフォームを提供する癒し。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、ニュージャージー脊髄研究 (CSCR15IRG010)、米国国防総省 (SC160029)、イェール大学部の外科大瀬研究助成プログラム委員会によって部分的に支持されました。倉庫ケック共同神経科学センター、ラトガース大学のテクニカル サポートからショーン o ' Leary に感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Magnets | Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO | CD14C | 3800 G Magnetic force |
| Mice standard diet | PMI Nutrition International, Brentwood, MO | Standard Food Pellet | |
| Isoflurane | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 029405 | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | Image Analysis Software | |
| BETADINE Surgical Scrub | HENRY SCHEIN Animal Health | ||
| Ophthalmic Ointment | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 008897 | |
| NAIR-Hair Remover Lotion | Church & Dwight Co., Inc. Princeton, NJ | ||
| ELOXIJECT (meloxicam) Injection | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 049755 | 5 mg/mL, 10 mL |
| Cefazolin Sodium | HENRY SCHEIN Animal Health | SKU 054846 | 1 g, 10 mL bottle |
| Buprenorphine-SR | ZooPharm, Windsor, CO | - | - |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | BRAUN, Irvine, CA | S8004-5384 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR, Radnor, PA | 16004-130 | |
| BALB/C Male Mouse | Charles River Lab., Wilmington, MA | 28 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicator | Puritan, Guilford, ME | SKU#: 25-806 | |
| Michel Suture Clips | Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA | 12040-01 | |
| Surgical Suture, U.S.P. | Henry Schein Animal Health | 101-2636 |
References
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