Summary
Фотодинамическая терапия (PDT) является медицинская процедура, которая предполагает инкубации экзогенно прикладной фотосенсибилизатора (PS) следуют видимый свет photoactivation чтобы индуцировать апоптоз. Мы представляем в vitro PDT протокол, разработанный для имитации PDT, которые могут быть использованы для изучения различий в PS инкубации и светолечение параметров.
Abstract
Фотодинамическая терапия (PDT) является медицинская процедура, которая предполагает инкубации экзогенно прикладной фотосенсибилизатора (PS) следуют видимый свет photoactivation чтобы индуцировать апоптоз клеток. Федеральной лекарствами утвердило PDT для лечения Актинический кератоз, и клинические руководства рекомендуют PDT для лечения некоторых кожи немеланомного рака и угрей. PDT является выгодным терапевтические модальности как это низкая стоимость, неинвазивный и связанные с минимальными побочных реакций и пугать. На первом шаге PDT PS применяется и позволили накопить внутриклеточно. Последующие света облучение вызывает реактивнооксигенных видов образования, которое может в конечном итоге привести к апоптоз клеток, мембраны нарушения, повреждение митохондрий, иммунной модуляции, кератиноцитов распространения и коллаген оборот. Здесь мы представляем в vitro метод для изучения PDT адэрентных клеток линии. Этот протокол лечения предназначен для имитации PDT и может быть скорректирована для изучения использования PDT с различных клеточных линий, фотосенсибилизаторов, температуры инкубации или photoactivation длин волн. Плоскоклеточный рак клетки инкубировали с 0, 0,5, 1,0 и 2 мм 5-аминолевулиновой кислоты (5-ALA) за 30 мин и photoactivated с 417 Нм синий свет для 1000 s. Основной результат измерения был апоптоз и некроз, как измеряется annexin V и 7-aminoactinomycin Д проточной цитометрии. Там был дозозависимое увеличение апоптоз клеток после инкубации тридцать минут 5-ALA. Для достижения высокой Интер теста действия, важно поддерживать последовательной инкубации и свет параметры при выполнении экспериментов в vitro PDT. PDT — что может позволить полезные клинические процедуры и в пробирке исследования для разработки новых PSs, оптимизация протоколов и новых указаний для ФДТ.
Introduction
Фотодинамическая терапия (PDT) является медицинская процедура, которая предполагает инкубации экзогенно прикладной фотосенсибилизатора (PS) следуют видимый свет photoactivation чтобы индуцировать апоптоз клеток. Федеральная администрация снадобья (FDA) одобрило PDT для лечения Актинический кератоз (АК) и клинические руководства рекомендуют PDT для лечения некоторых рака кожи и акне vulgaris1,2. Новые номера дерматологические PDT используются для лечения желудочно-кишечного тракта, простаты и гинекологических раков3. PDT это выгодно терапевтические модальности как это низкая стоимость, неинвазивная и связанные с минимальными побочных реакций и рубцов2.
На первом шаге PDT PS применяется и позволили накопить внутриклеточно2. В Соединенных Штатах актуальные 5-аминолевулиновой кислоты (5-ALA) обычно используется для лечения АКС. Во время инкубации фазы, 5-ALA преобразуется в протопорфирин IX (PP-IX) по дорожке биосинтез гема в Объединенные ячейки3. Рак и предраковые клетки снижение активности ferrochelatase, который преобразует протопорфирин IX (PP-IX), в конечный продукт, гема. В результате клетки рака накапливать PP-IX, по сравнению с нормальной клетки в4,5. Это накопление PP-IX в рак и предраковые клетки относительно окружающих тканей позволяет для ФДТ быть целенаправленный подход с минимальными побочных эффектов. Легкие облучение приводит к реактивнооксигенных видов (ров) поколения, когда кислорода принимает возбужденные электроны от PP-IX. PP-IX имеет пик поглощения ультрафиолетового спектра с меньше пики в спектре видимого света, в том числе синий и красный свет2. ROS формирование может в конечном итоге привести к апоптоз клеток, мембраны нарушения, повреждение митохондрий, иммунной модуляции, кератиноцитов распространения и коллаген оборот6,,78,9 , 10.
PDT был разработан в 1970-х и является развивающейся терапевтические модальности3. FDA одобрило Протокол для лечения AKs рекомендует инкубации 5-ALA кожи для 14 – 18 ч, но 1-2 h инкубаций широко используются в клинической практике2. В пробирке, мы показали, что более короткие 15 минут 5-ALA инкубаций может увеличить апоптоз клеток фибробластов, по сравнению с необработанными фибробластов11,12. Кроме того для повышения эффективности PDT3изучаются Роман хлорин, фталоцианиновый и на основе наночастиц PSs. Здесь мы представляем в vitro метод для исследования PDT адэрентных плоскоклеточный рак ячейки. В этом протоколе, SCC-13 клетки инкубируют с 0, 0,5, 1,0 и 2 мм 5-ALA 30 мин и photoactivated с 417 Нм синий свет для 1000 s. Мера основного исхода — апоптоз и некроз, как измеряется annexin V и 7-aminoactinomycin D (7-AAD) проточной цитометрии. Этот протокол лечения предназначен для имитации PDT и может быть скорректирована для изучения использования PDT с других клеточных линий, фотосенсибилизаторов, температуры инкубации или photoactivation длин волн. Подготовка дополнительных контрольных групп могут оказаться необходимыми, включая безупречная, один Флюорофор пятнами, негативные и позитивные элементы управления для проточной цитометрии. Всеобъемлющий обзор теории, протоколы, экспериментальный дизайн и строб для apoptosis/некроз проточной цитометрии можно найти в других13.
Protocol
1. Подготовка клеток
- Тарелка 20 000 клеток в 2 мл питательной среды в каждой скважине 6-ну пластину, используя стерильную методику в биобезопасности кабинета.
- Место 6-ну пластины в увлажненные инкубатора (37 ° C, 5% CO2) за 24 ч до позволяют клеткам придерживаться пластины.
2. Подготовка фотосенсибилизатора лечение клеток
- Подготовка решения 5-ALA 0,5, 1 и 2 мм в среде культуры. Если плода бычьим сывороточным (ФБС) является компонентом культуры среднего, подготовить и обработать клетки с 5-ALA в растворе питательной среды с 0.1% FBS для инкубации. 11 , 12 в этом случае клетки SCC-13 не требуют FBS, поэтому 5-ALA был добавлен непосредственно в кератиноцитов сыворотки бесплатно средних дополнена говядину гипофиза экстракт и эпидермального фактора роста.
- Аспирационная питательной среды и вымыть клетки с по крайней мере 2 мл-фосфатный буфер (PBS).
- Аспирационная PBS и добавить 2 мл 0, 0,5, 1 или 2 мм 5-ALA решений в отдельных пластин или скважин.
- Инкубировать клетки с 0, 0,5, 1 или 2 мм 5-ALA на 36-37 ° C, Отопление блока для 30 min. защищают клетки от воздействия света во время инкубации с помощью алюминиевой фольги.
- Аспирационная решения 5-ALA 0, 0,5, 1 и 2 мм и вымыть клетки с 2 мл ФСБ.
- Аспирационная PBS и добавить 2 мл питательной среды для синего света облучения.
3. синий свет фототерапии
- Перед облучающих клетки, включите синий свет устройства (например, светодиод, люминесцентные или галогенное освещение) и запустить за один цикл (1000 s) для разогрева устройства. Синий свет устройство должно иметь выходную длину волны 417 + /-5 Нм. Позволяет устройству для запуска на один цикл до лечения гарантирует, что голубые волны света и освещенности последовательно на протяжении всего этапа photoactivation.
- Используйте фотометр для измерения излучения на поверхности клеток. Синий свет излучения на поверхности клеток должно быть 10 МВт/см2. Расстояние между светом и клетки может потребоваться скорректировать для достижения излучения 10 МВт/см2 в зависимости от интенсивности источника света.
- Место 0, 0,5, 1 и 2 мм ALA лечение групп на черной поверхности под синий источник света. Облучить клетки с голубой свет для 1000 s (16 мин и 40 s) для всего Флюенс 10 Дж/см2. После синий свет photoactivation клетки готовы для анализа.
4. сбор и окрашивания
- Подготовка буфера потока согласно рекомендациям производителя (см. Таблицу материалы).
- Аспирационная питательной среды и вымыть клетки с 2 мл ФСБ.
- Добавить 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и позволяют клеткам для отсоединения для примерно 3-5 мин. Клетки могут рассматриваться под микроскопом, чтобы подтвердить мобильный отряд.
- Добавьте 1 мл питательной среды (или PBS) с 10% плода бычьим сывороточным для деактивации трипсина.
- Соберите суспензию клеток в обозначенные 5 мл расходомерных трубок.
- Спиновые 5 мл потока в центрифуге на 201 x g 5 мин аспирата решение без удаления клеток Пелле.
- Добавьте 200 мкл буфера потока с конъюгированных антител annexin V (1 мкл annexin v за 39 мкл буфера потока) для каждого образца.
- Ресуспензируйте клетки и место в инкубатор (37 ° C, 5% CO2) для 20 минут позволить annexin V привязки.
- 3 мкл 7-AAD, для каждого образца. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
5. поток гранулярных анализ
- Руководящим принципам потока цитометр производителя для установки (см. Таблицу материалы).
- Собирать и анализировать пробы с проточной цитометрии. 13
- Статистические сравнения лечения и управления группами с помощью дисперсионный анализ (ANOVA)14. Сравните средства лечения групп означают элемента управления с Дуннетт тест на пост Специального анализа.
Representative Results
После SCC-13 клетки были инкубировали 30 мин с 0, 0,5, 1 и 2 мм 5-ALA и облученном с 1000 s синего света, дозозависимое увеличение апоптоза клеток. Общая апоптоз (среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего) был 3.94 ± 0.34, 7,90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52 и 38.33 ± 1,81 после 30 минут инкубации с 0, 0,5, 1 и 2 мм 5-ALA, соответственно и 1000 секунд синего света (рис. 1). Мы сравнили средний процент apoptotic клетки среди 0, 0,5, 1 и 2 мм 5-ALA инкубирован групп с использованием дисперсионного анализа. Клетках, обработанных с 1 и 2 мм 5-ALA имел значительное увеличение в апоптоз клеток, по сравнению с 0 мм 5-ALA лечение клеток. Рисунок 2A показывает, представитель потока гранулярных стробирования вперед разброса (FSC) против точечной (SSC) стороне для SCC-13 клетки инкубировали с 0, 0,5, 1 и 2 мм 5-ALA. Стробирования круг замыкает популяции клеток SCC-13. Для этого эксперимента 7500 события были собраны и SCC-13 клеток населения ворота захватили по меньшей мере 90% событий. Рисунок 2B показывает представительный участок 7-AAD на оси x и annexin V на оси y. Популяции клеток являются воротами в четырех квадрантах (Q1 в Q4) подвергать apoptotic клеток. Q1 (высокая annexin v, низкий 7-AAD) представляет клетки проходят ранней апоптоз. Q2 (высокая annexin v, высокая 7-AAD) представляют собой клетки проходят конце apoptosis или некроз. Q3 (низкая annexin v, высокая 7-AAD) представляет клетки проходят некроз. Q4 (низкая annexin v, низкий 7-AAD) представляет ячейки не проходят apoptosis или некроз. Чтобы вычислить процент клеток, проходят apoptosis, мы добавили процент клеток в Q1 и Q2. Непоследовательность в длину 5-ALA инкубационного периода, температуры инкубации или photoactivation доза облучения может изменить эффективность PDT. Рис. 3 демонстрирует представитель annexin V и 7-AAD потока гранулярных сюжет когда температуры инкубации разнообразны (т.е., 27, 36 или 42 ° C). Там был зависит от повышения температуры в апоптоз.
Рисунок 1: дозозависимое увеличение апоптоз после инкубации тридцать минут 5-Ала 5-ALA инкубировали на 36 ° C в течение тридцати минут, а затем 1000 s синего света в клетках SCC-13. Бары представляют средний процент annexin V позитивные клетки в каждом лечения и контрольной группе. Эксперименты были проведены в трех технических экземплярах. Статистическая значимость определяется ANOVA, с p < 0,05, отмечены звездочкой (*). Планки погрешностей представляют собой среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель проточной цитометрии участков. (A) представитель вперед разброс против стороны точечной цитометрии участков в произвольных единицах (АС) для осей x и y - 0, 0,5, 1 и 2 мм 5-ALA инкубирован клеток. Для этого эксперимента 7500 события были собраны и SCC-13 клеток населения ворота захватил 90% событий. (B) представитель annexin V против 7-AAD проточной цитометрии участков в AU для осей x и y - 0, 0,5, 1 и 2 мм 5-ALA инкубирован клеток. Q1: ранние apoptotic клеток, Q2: поздно apoptotic/отмершие клетки, Q3: отмершие клетки и Q4: жизнеспособных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: инкубации 5-ALA при разных температурах может изменить эффективность PDT. Представитель annexin V против 7-AAD проточной цитометрии участков в AU для осей x и y - для SCC-13 клетки инкубировали с 0,5 мм 5-ALA в 27, 36 и 42 ° C. Q1: ранние apoptotic клеток, Q2: поздно apoptotic/отмершие клетки, Q3: отмершие клетки и Q4: жизнеспособных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Там было значительное увеличение SCC-13 апоптоза, после 30 мин инкубаций 0,5, 1 и 2 мм 5-ALA следуют 1000 s синий свет. Эти результаты согласуются с нашими ранее опубликованных исследований, показывающих, что 5-ALA инкубаций 30 мин, затем синий свет активации приводит к дозозависимое увеличение доли клеток фибробластов, проходят apoptosis12, 14.
Этот экспериментальный подход к изучению PDT имеет преимущества и ограничения. Описаны методы соответствуют клинической практике как коммерчески доступных PS и источник света были использованы. Исследователи могут настроить методы с различных типов клеток, PSs, источники света и параметрами облучения. Однако существуют ограничения такого подхода, как этот протокол разработан для адэрентных клеток, культивируемых в монослое. В клинической практике, различия в ткани архитектуры или заболевания патология (то есть, гиперкератоз или фиброз) может уменьшить поглощение PS или свет проникновения15. В результате лечения доз и экспериментальных результатов может не соответствовать непосредственно клинической практики. Как методы более тесно реплицировать опухоли микросреды16,17,18изучены сфероида опухоли модели и microfluidic чип. Сфероидов имеют внутренние и внешние сотовой ниши, которые дифференцировано может включать фотосенсибилизаторов и представляют архитектуру неоднородной опухоли. Другие исследователи использовали microfluidic чипы для условий лечения в экране и сосудистой доставки фотосенсибилизаторов. Однако microfluidic фишек может быть дорогостоящим или трудно осуществить для исследователей, незнакомых с техникой. Кроме того сфероидов и microfluidic чипы могут не отражать клинического лечения рака кожи, в которых фотосенсибилизаторов применяются непосредственно к поверхности опухоли без сосудистых распространения. Исследователи может потребоваться оценить плюсы и минусы монослойном культивировании, сфероиде опухоли моделей и microfluidic чипов для изучения ФДТ в системах различных заболеваний. Как не существует иммунных клеток или внеклеточного матрикса, это не невозможно определить, как PDT влияет на взаимодействие сложных ячеек. Исследователи может потребоваться подтвердить в vitro результаты экспериментов с использованием модели на животных и клинические испытания. Для достижения высокой Интер теста действия, важно поддерживать последовательной инкубации и свет параметры при выполнении экспериментов в vitro PDT.
Известно, что температура изменить эффективность PDT19. Одно исследование показало, что смерть клетки, поглощения 5-ALA, формирования PP-IX и cytokine выпуске могут быть расширены путем инкубации клеток с 5-ALA при температурах до 44 ° C19. Инкубация температура выше 44 ° C может привести к тепловой индуцированных клеточной смерти, и инкубации температурах ниже 20 ° C может не привести к значительным 5-ALA поглощение и накопление19. Мы рекомендуем, исследователи выполнить PS инкубаций на температуру регулируемое отопление блока при постоянной температуре в элемент управления для потенциально смешанным тепловые эффекты. Кроме того важно инкубировать фотосенсибилизатора достаточное количество времени для преобразования 5-ALA в PP-IX. В этом протоколе SCC-13 клетки инкубировали с 5-ALA 30 мин, который успешно индуцированного апоптоза клеток. Ранее мы показали, что 10 минут инкубации 5-ALA не значительно увеличить апоптоз в фибробластов, по сравнению с необработанными управления фибробластов11,14. PP-IX начинает накапливаться в мыши кожи после 5-ALA инкубации шести минут при 37 ° C. Таким образом после десяти минут 5-ALA инкубации, могут не существовать достаточно накопление PP-IX навести apoptosis клетки20. Мы рекомендуем минимум инкубационный период от 20 до 30 мин 5-ALA, основанные на наших предыдущих исследований11,14. Исследователи может потребоваться оптимизировать инкубационный период на базе лаборатории, установка, фотосенсибилизатора интерес, типа клеток и клинические индикации. Для достижения наилучших результатов, используя рекомендации производителей может выполняться антитела титрования и оптимизации эксперименты. Другие анализы интерес может быть выполнено после синий свет photoactivation, включая dihydroethidium потока гранулярных количественная оценка рос. 14
Различия в размере свет доставлен на единицу площади поверхности (т.е., освещенности) и общее облучение дозой (то есть, Флюенс) на этапе photoactivation могут повлиять на формирование рос и апоптоз клеток21. Отношения между Флюенс, освещенность и время могут быть описаны следующим уравнением:
Флюенс (Дж/см2) = освещенность (W/cm2) x время (ов)
Как Флюенс зависит от времени, удлинения или сокращения продолжительности этапа photoactivation может изменить эффективность лечения. Освещённость пропорциональна расстоянию между источником света и ткани-мишени в квадрате. В результате, если свет слишком далеко, там может оказаться достаточной энергии света, доставлены в целевой ткани для возбуждения PS. Альтернативно, освещённость может быть увеличена на свет, отраженный от окружающих поверхностей. Поэтому мы рекомендуем выполнять легкие облучения с пластинами культуры клеток, на черной поверхности для предотвращения отражения света. Исследователи могут приобрести коммерчески доступных или FDA утвержденных синий светодиоды и флуоресцентных устройств для использования в экспериментах PDT, но эти устройства могут иметь различные мощности и единообразия светового поля. Волны специфические фотометр должны использоваться для измерения излучения на поверхности клетки и единообразия светового поля перед каждый эксперимент для устойчивых результатов. Коммерчески доступных диффузор может использоваться для расширения области однородности, при необходимости.
В целом мы описали в vitro подход к расследованию PDT, детализируя теории, экспериментальные методы, ограничения, потенциальные проблемы и рекомендации по оптимизации. PDT — что может позволить полезные клинические процедуры и в пробирке исследования для разработки новых PSs, оптимизация протоколов и новых указаний для ФДТ.
Disclosures
Фармацевтические переводы/Sun предоставляет 5-ALA и легкие устройства BLU-U. Эта рукопись была поддержана доктор Джагдео остаточной финансирования. Содержимое не представляют взгляды Департамента США по делам ветеранов или правительства Соединенных Штатов.
Acknowledgments
Авторы имеют без подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte serum free medium | Thermofisher | 17005042 | Culture medium for SSC-13 cells |
| DMEM low glucose glutamax | Thermofisher | 10567022 | Possible culture medium for other cell types |
| 6-well culture plates | Thermofisher | 720083 | |
| PBS | Thermofisher | 14190250 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25200056 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | For cell counting and plating |
| BLU-U light | DUSA | Request from manufacturer | Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used |
| 5-ALA | DUSA | Request from manufacturer | |
| FBS | Atlanta Biologicals | C17032 | |
| FlowCellect Annexin Red Kit | Millipore Sigma | FCCH100108 | Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer |
| FACSCanto II | BD | Request from manufacturer | Any flow cytometer may be used |
| Counting Chamber | Hausser | 3120 | For cell counting and plating |
| FlowJo | FlowJo | Request from manufacturer | Flow cytometry analysis software |
References
- Morton, C., et al. European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy. European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).
- Ozog, D. M., et al. Photodynamic therapy: A clinical consensus guide. Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).
- Abrahamse, H., Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers. Metal-Based Drugs. 2008, 276109 (2008).
- Ohgari, Y., et al. Mechanisms involved in δ-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin. Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).
- Kessel, D., Luo, Y. Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 42 (2), 89-95 (1998).
- Goldberg, D. J. Photodynamic therapy in skin rejuvenation. Clinics in Dermatology. 26 (6), 608-613 (2008).
- Sakamoto, F. H., Lopes, J. D., Anderson, R. R. Photodynamic therapy for acne vulgaris: A critical review from basics to clinical practice: Part I. Acne vulgaris: When and why consider photodynamic therapy. Journal of the American Academy of Dermatology. 63 (2), 183-193 (2010).
- Boen, M., Brownell, J., Patel, P., Tsoukas, M. M. The role of photodynamic therapy in acne: An evidence-based review. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (3), 311-321 (2017).
- Allison, R. R., Moghissi, K. Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 10 (4), 331-341 (2013).
- Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death. Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).
- Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro. Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).
- JoVE Science Education Database. Cell Biology. Annexin V and Propidium Iodide Labeling. JoVE. , Cambridge, MA. (2018).
- Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts. British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).
- Gilaberte, Y., et al. Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy. Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).
- Yoon, H. K., et al. Nanophotosensitizers engineered to generate a tunable mix of reactive oxygen species, for optimizing photodynamic therapy, using a microfluidic device. Chemistry of Materials. 26 (4), 1592-1600 (2014).
- Chen, Y. -C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures. Scientific Reports. 5, 12175 (2015).
- Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. Low-dose PDT on breast cancer spheroids. Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).
- Yang, J., et al. The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).
- Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).
- Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).
