Summary
Photodynamic थेरेपी (pst) एक चिकित्सा प्रक्रिया है कि एक exogenously एप्लाइड photosensitizer (पुनश्च) दिखाई प्रकाश photoactivation के बाद apoptosis प्रेरित की मशीन शामिल है । हम एक इन विट्रो में वर्तमान में pst प्रोटोकॉल के लिए है कि पी एस गर्मी और प्रकाश उपचार के मापदंडों में मतभेदों का अध्ययन किया जा सकता है अनुकरण करने के लिए डिज़ाइन ।
Abstract
Photodynamic थेरेपी (pst) एक चिकित्सा प्रक्रिया है कि एक exogenously एप्लाइड photosensitizer (पी एस) के दृश्य प्रकाश photoactivation के बाद सेल apoptosis प्रेरित करने की मशीन शामिल है । संघीय औषधि प्रशासन actinic keratosis के उपचार के लिए pst अनुमोदित है, और नैदानिक दिशानिर्देश कुछ गैर-मेलेनोमा त्वचा कैंसर और मुँहासे के लिए एक इलाज के रूप में pst सलाह देते हैं । pst एक लाभप्रद चिकित्सकीय रूपरेखा के रूप में यह कम लागत, गैर इनवेसिव है, और कम प्रतिकूल घटनाओं और डरा के साथ जुड़े । pst के पहले चरण में, एक PS लागू किया जाता है और intracellularly संचय करने की अनुमति है । बाद में प्रकाश विकिरण, जो अंततः सेल apoptosis, झिल्ली व्यवधान, mitochondrial क्षति, प्रतिरक्षा मॉडुलन, keratinocyte प्रसार, और कोलेजन कारोबार करने के लिए नेतृत्व कर सकते है प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के गठन, लाती है । इस के साथ साथ, हम वर्तमान में एक इन विट्रो विधि एक अनुयाई सेल लाइन में pst अध्ययन करने के लिए । यह उपचार प्रोटोकॉल pst अनुकरण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और विभिन्न सेल लाइनों, photosensitizers, मशीन तापमान, या photoactivation तरंग दैर्ध्य के साथ pst के उपयोग का अध्ययन करने के लिए समायोजित हो सकता है । स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं 0, ०.५, १.०, और 2 मिमी 5-aminolevulinic एसिड (5-ाला) के लिए 30 मिनट और photoactivated ४१७ एनएम नीले प्रकाश के साथ १,००० एस के लिए के साथ मशीन थे । प्राथमिक परिणाम उपाय apoptosis और परिगलन था, के रूप में annexin-V और 7-aminoactinomycin डी प्रवाह cytometry द्वारा मापा । वहां एक खुराक सेल apoptosis में निर्भर वृद्धि तीस के बाद 5-अला की मिनट की मशीन था । उच्च अंतर परीक्षण वैधता प्राप्त करने के लिए, यह लगातार गर्मी और प्रकाश मानकों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है जब में प्रदर्शन इन विट्रो pst प्रयोगों । pst एक उपयोगी नैदानिक प्रक्रिया है और इन विट्रो अनुसंधान में उपंयास PSs के विकास के लिए अनुमति दे सकता है, प्रोटोकॉल का अनुकूलन, और pst के लिए नए संकेत ।
Introduction
Photodynamic थेरेपी (pst) एक चिकित्सा प्रक्रिया है कि एक exogenously एप्लाइड photosensitizer (पी एस) के दृश्य प्रकाश photoactivation के बाद सेल apoptosis प्रेरित करने की मशीन शामिल है । फेडरल ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (एफडीए) actinic keratosis (एके) के उपचार के लिए pst अनुमोदित है, और नैदानिक दिशानिर्देश कुछ गैर मेलेनोमा त्वचा कैंसर और मुँहासे1,2के लिए एक इलाज के रूप में pst सिफारिश । pst के लिए उभरते गैर-dermatological उपयोग जठरांत्र, प्रोस्टेट, और स्त्री संबंधी कैंसर3के उपचार में शामिल हैं । pst एक लाभप्रद चिकित्सकीय रूपरेखा के रूप में यह कम लागत, गैर इनवेसिव है, और कम प्रतिकूल घटनाओं और scarring2के साथ जुड़े ।
pst के पहले चरण में, एक PS लागू किया जाता है और intracellularly2संचित करने की अनुमति है । संयुक्त राज्य अमेरिका में, सामयिक 5-aminolevulinic एसिड (5 ाला) आमतौर पर अक्स के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है । इस मशीन चरण के दौरान, 5-ाला protoporphyrin ix में परिवर्तित किया गया है (पीपी-ix) षयवस्तु के माध्यम से शामिल किया गया कोशिकाओं में गैर संश्लेषण मार्ग3. कैंसर और पूर्व कैंसर कोशिकाओं ferrochelatase गतिविधि में कमी आई है, जो protoporphyrin ix (पीपी-ix) धर्मांतरित, अंत उत्पाद, षयवस्तु में । नतीजतन, कैंसर कोशिकाओं पीपी सामान्य कोशिकाओं4,5की तुलना में IX जमा । पीपी के इस संचय कैंसर में नौवीं और पूर्व कैंसर आसपास के ऊतकों के सापेक्ष कोशिकाओं pst के लिए अनुमति देता है के लिए ंयूनतम प्रतिकूल घटनाओं के साथ एक लक्षित दृष्टिकोण है । प्रकाश विकिरण प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) पीढ़ी की ओर जाता है जब ऑक्सीजन पीपी से उत्साहित इलेक्ट्रॉनों-IX स्वीकार करता है । पीपी-नौवीं नीले और लाल बत्ती2सहित दृश्य प्रकाश स्पेक्ट्रम, भर में छोटे चोटियों के साथ पराबैंगनी स्पेक्ट्रम में एक चोटी अवशोषण है । ROS गठन अंततः सेल apoptosis करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, झिल्ली व्यवधान, mitochondrial क्षति, प्रतिरक्षा मॉडुलन, keratinocyte प्रसार, और कोलेजन कारोबार6,7,8,9 , 10.
pst 1970 के दशक में विकसित किया गया था और एक विकसित चिकित्सीय मोडल3है । एफडीए को मंजूरी दी अक्स के उपचार के लिए प्रोटोकॉल की सिफारिश की 14 के लिए 5-ाला त्वचा की मशीन-18 एच, लेकिन 1 से 2 एच की मशीन सामांयतः नैदानिक अभ्यास2में प्रयोग किया जाता है । इन विट्रो में , हमें पता चला है कि कम 15 मिनट 5-ाला की गर्मी अनुपचारित fibroblasts11,12की तुलना में fibroblast सेल apoptosis बढ़ सकता है । साथ ही, उपंयास chlorin, phthalocyanine, और nanoparticle आधारित PSs pst प्रभावकारिता3में सुधार करने के लिए अध्ययन किया जा रहा है । इस के साथ साथ, हम वर्तमान में एक इन विट्रो विधि एक अनुयाई स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं में pst अध्ययन करने के लिए । इस प्रोटोकॉल में, SCC-13 कोशिकाओं 0, ०.५, १.०, और 2 मिमी 5-अला के लिए 30 मिनट और photoactivated ४१७ एनएम ब्लू लाइट के लिए १,००० एस के लिए के साथ मशीन हैं । प्राथमिक परिणाम उपाय apoptosis और परिगलन, annexin-V और 7-aminoactinomycin डी (7-AAD) प्रवाह cytometry द्वारा मापा जाता है । यह उपचार प्रोटोकॉल pst अनुकरण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और अंय कक्ष रेखाओं, photosensitizers, मशीन तापमान, या photoactivation तरंग दैर्ध्य के साथ pst के उपयोग का अध्ययन करने के लिए समायोजित किए जा सकते हैं । अतिरिक्त नियंत्रण समूहों की तैयारी, दाग, एक fluorophore दाग, नकारात्मक, और प्रवाह cytometry के लिए सकारात्मक नियंत्रण सहित आवश्यक हो सकता है । सिद्धांत, प्रोटोकॉल, प्रायोगिक डिजाइन, और apoptosis/परिगलन प्रवाह cytometry के लिए गेटिंग की एक व्यापक समीक्षा कहीं और पाया जा सकता है13।
Protocol
1. कोशिकाओं की तैयारी
- प्लेट २०,००० संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर में एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुआं में एक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ तकनीक का उपयोग कर कोशिकाओं ।
- प्लेस 6-अच्छी तरह से एक humidified मशीन में प्लेटें (३७ ° c, 5% सह2) के लिए 24 घंटे कोशिकाओं को पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए ।
2. कोशिकाओं के उपचार के लिए Photosensitizer की तैयारी
- संस्कृति माध्यम में ०.५, 1, और 2 मिमी 5-अला समाधान तैयार करें । यदि भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) संस्कृति माध्यम का एक घटक है, तैयार और 5 के साथ कोशिकाओं का इलाज-०.१% FBS के साथ संस्कृति मध्यम समाधान में ाला । 11 , 12 इस मामले में, SCC-13 कोशिकाओं FBS की आवश्यकता नहीं है, तो 5-ाला सीधे keratinocyte सीरम मुक्त माध्यम से जोड़ा गया था गोजातीय पिट्यूटरी निकालने और एपिडर्मल वृद्धि कारक के साथ पूरक.
- महाप्राण संस्कृति मध्यम और फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के कम से 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
- महाप्राण पंजाबियों और अलग प्लेटों या कुओं में 0, ०.५, 1, या 2 मिमी 5-अला समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
- 0, ०.५, 1, या 2 मिमी 5-ाला के साथ कोशिकाओं को एक ३६ करने के लिए ३७ ° c हीटिंग ब्लॉक के लिए 30 मिनट के लिए गर्मी की रक्षा एल्यूमीनियम पंनी का उपयोग कर मशीन के दौरान प्रकाश जोखिम से कोशिकाओं ।
- महाप्राण 0, ०.५, 1, और 2 मिमी 5-अला समाधान और पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
- महाप्राण पंजाब और ब्लू लाइट विकिरण के लिए संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
3. ब्लू लाइट Phototherapy
- कोशिकाओं irradiating से पहले, नीले प्रकाश डिवाइस पर बारी (जैसे, प्रकाश उत्सर्जक डायोड, फ्लोरोसेंट, या हैलोजन प्रकाश) और एक चक्र के लिए चलाने के लिए (१,००० s) डिवाइस को गर्म करने के लिए. नीले प्रकाश डिवाइस ४१७ के एक आउटपुट तरंग दैर्ध्य होना चाहिए +/-5 एनएम । डिवाइस एक चक्र के लिए उपचार से पहले चलाने के लिए अनुमति देता है कि नीले प्रकाश तरंग दैर्ध्य और विकिरण photoactivation चरण भर में संगत कर रहे हैं सुनिश्चित करता है ।
- कक्ष की सतह पर विकिरण को मापने के लिए एक फोटोमीटर का उपयोग करें । सेल की सतह पर नीली बत्ती विकिरण को 10 मेगावाट/ प्रकाश और कोशिकाओं के बीच की दूरी के लिए 10 मेगावाट की एक विकिरण प्राप्त करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है/
- 0, ०.५, 1 प्लेस, और 2 मिमी नीले प्रकाश स्रोत के तहत एक काली सतह पर उपचार समूहों अला । १,००० s (16 min and ४० s) के लिए नीले प्रकाश के साथ कोशिकाओं को विकीर्ण 10 J/cm2के कुल प्रवाह के लिए । ब्लू लाइट photoactivation के बाद, कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए तैयार हैं ।
4. संग्रह और धुंधला
- निर्माता दिशानिर्देश ( सामग्री की तालिकादेखें) के अनुसार प्रवाह बफ़र तैयार करें ।
- महाप्राण संस्कृति मध्यम और पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ धो कोशिकाओं ।
- ०.२५% trypsin-EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं लगभग 3 से 5 मिनट के लिए अलग करने के लिए अनुमति देते हैं । कोशिका टुकड़ी की पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच की जा सकती है ।
- trypsin को निष्क्रिय करने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ संस्कृति मध्यम (या पंजाब) के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
- लेबल 5 मिलीलीटर प्रवाह ट्यूबों में सेल निलंबन ले लीजिए ।
- 5 min. महाप्राण समाधान के लिए सेल गोली हटाने के बिना 5 मिलीलीटर प्रवाह ट्यूब में एक केंद्रापसारक २०१ x g पर स्पिन ।
- प्रवाह बफ़र के २०० µ l जोड़ें संयुग्मित annexin-v एंटीबॉडी के साथ (1 µ l के annexin-v प्रति ३९ µ l प्रवाह बफ़र के) प्रत्येक नमूने के लिए ।
- annexin-V बाइंडिंग की अनुमति देने के लिए 20 मिनट के लिए (३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2) मशीन में कोशिकाओं और जगह resuspend ।
- प्रत्येक नमूने के लिए 7-AAD के 3 µ l जोड़ें । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
5. फ्लो Cytometric एनालिसिस
- सेट अप के लिए फ्लो cytometer निर्माता दिशानिर्देश का पालन करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- इकट्ठा और प्रवाह cytometry के साथ नमूनों का विश्लेषण । 13
- प्रसरण (ANOVA)14के विश्लेषण का उपयोग करके उपचार और नियंत्रण समूहों की सांख्यिकीय तुलना निष्पादित करें । उपचार समूहों के मतलब के लिए पोस्ट हॉक विश्लेषण के लिए एक Dunnett परीक्षण के साथ नियंत्रण के मतलब की तुलना करें ।
Representative Results
SCC के बाद-13 कोशिकाओं 0, ०.५, 1 के साथ 30 मिनट के लिए मशीन, और 2 मिमी 5-अला और नीले प्रकाश के १,००० एस के साथ विकिरणित थे, वहां एक खुराक सेल apoptosis में वृद्धि पर निर्भर था । कुल apoptosis (मतलब की ± मानक त्रुटि मतलब है) ३.९४ ± ०.३४, ७.९० ± ०.५२, २३.८६ ± ०.५२, और ३८.३३ ± १.८१ था 0, ०.५, 1, और 2 मिमी 5-ाला, क्रमशः, और नीले रंग की लाइट के १००० सेकंड के साथ मशीन के 30 मिनट के बाद (चित्रा 1) । हम 0, ०.५, 1 के बीच अपोप्तोटिक सेल का मतलब प्रतिशत की तुलना में, और 2 मिमी 5-ाला ANOVA का उपयोग कर समूह । 1 और 2 मिमी 5-ाला के साथ इलाज कोशिकाओं को सेल apoptosis में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी 0 मिमी 5-अला इलाज कोशिकाओं की तुलना में. चित्रा 2a से पता चलता है प्रतिनिधि प्रवाह cytometric गेटिंग फॉरवर्ड तितर बितर (FSC) बनाम साइड स्कैटर (एसएससी) के लिए SCC-13 कोशिकाओं 0, ०.५, 1, और 2 मिमी 5-ाला के साथ मशीन । सर्कल गेटिंग SCC-13 सेल आबादी पडते. इस प्रयोग के लिए, ७५०० घटनाओं एकत्र किया गया और SCC-13 सेल जनसंख्या गेट घटनाओं का कम से ९०% पर कब्जा कर लिया । चित्रा 2 बी x-अक्ष पर 7-AAD के एक प्रतिनिधि भूखंड और y-अक्ष पर annexin-V दिखाता है । कोशिका आबादी चार चक्रों में gated है (Q1 करने के लिए Q4) भेदभाव अपोप्तोटिक कोशिकाओं के लिए । Q1 (उच्च annexin-v, कम 7-AAD) जल्दी apoptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है । Q2 (उच्च annexin-v, उच्च 7-AAD) देर apoptosis या परिगलन के दौर से गुजरने वाले कक्षों का प्रतिनिधित्व करते हैं । Q3 (कम annexin-v, उच्च 7-AAD) परिगलन के दौर से गुजरने वाली कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है । Q4 (कम annexin-v, कम 7-AAD) कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है apoptosis या परिगलन के दौर से गुजर नहीं । apoptosis से गुजरने वाले कक्षों का प्रतिशत परिकलित करने के लिए, हमने Q1 और Q2 में कक्षों का प्रतिशत जोड़ा है. 5-ाला मशीन अवधि की लंबाई, मशीन तापमान, या photoactivation विकिरण खुराक में विसंगति pst प्रभावकारिता को बदल सकते हैं । चित्रा 3 एक प्रतिनिधि annexin-V और 7-AAD प्रवाह cytometric भूखंड जब मशीन तापमान (यानी, 27, ३६, या ४२ डिग्री सेल्सियस) विविध है दर्शाता है । वहीं apoptosis में तापमान आश्रित वृद्धि हुई ।
चित्रा 1:5-अला की तीस मिनट की मशीन के बाद apoptosis में खुराक-निर्भर वृद्धि. 5-SCC-13 कोशिकाओं में नीले रंग की रोशनी के १,००० एस के बाद तीस मिनट के लिए ३६ ° c पर मशीन का ाला । पट्टियां प्रत्येक उपचार और नियंत्रण समूह में औसत प्रतिशत annexin-V धनात्मक कक्षों का प्रतिनिधित्व करती हैं । प्रयोगों का प्रदर्शन तकनीकी तपसिल में किया गया. सांख्यिकीय महत्व ANOVA द्वारा p < 0.05 चिह्नित द्वारा तारांकन (*) द्वारा निर्धारित किया गया था । त्रुटि पट्टियां माध्य का माध्य ± मानक त्रुटि दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: प्रतिनिधि प्रवाह Cytometry भूखंडों । (क) प्रतिनिधि आगे तितर बितर बनाम साइड कैटर cytometry भूखंडों में मनमानी इकाइयों (AU) के लिए x-और y-अक्ष के लिए 0, ०.५, 1, और 2 मिमी 5-ाला मशीन कोशिकाओं । इस प्रयोग के लिए, ७५०० घटनाओं एकत्र किया गया और SCC-13 सेल जनसंख्या गेट घटनाओं के ९०% पर कब्जा कर लिया । (ख) प्रतिनिधि annexin-V बनाम 7-AAD AU में cytometry भूखंडों के लिए एक्स-और y-अक्ष के लिए 0, ०.५, 1, और 2 मिमी 5-ाला मशीन कोशिकाओं । Q1: अर्ली अपोप्तोटिक कोशिकाओं, Q2: देर अपोप्तोटिक/गल कोशिकाओं, Q3: गल कोशिकाओं, और Q4: व्यवहार्य कोशिकाओं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3:5-अलग तापमान पर अला की मशीनिंग pst प्रभावकारिता बदल सकते हैं । प्रतिनिधि annexin-वी बनाम 7-AAD में प्रवाह cytometry भूखंडों एक्स के लिए AU-और y-SCC-13 कोशिकाओं ०.५ mM 5-ाला 27, ३६, और ४२ डिग्री सेल्सियस के साथ मशीन के लिए । Q1: अर्ली अपोप्तोटिक कोशिकाओं, Q2: देर अपोप्तोटिक/गल कोशिकाओं, Q3: गल कोशिकाओं, और Q4: व्यवहार्य कोशिकाओं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
वहां SCC में एक महत्वपूर्ण वृद्धि-13 ०.५, 1, और 2 मिमी 5 की 30 मिनट की मशीन के बाद apoptosis-१,००० नीले प्रकाश के एस के बाद ाला । ये परिणाम हमारे पहले प्रकाशित अनुसंधान के साथ संगत कर रहे है कि 5-30 नीले प्रकाश सक्रियण द्वारा पीछा किया मिन के ाला की गर्मी की ओर जाता है fibroblast कोशिकाओं के प्रतिशत में एक खुराक पर निर्भर वृद्धि apoptosis12के दौर से गुजर, 14.
pst अध्ययन करने के लिए इस प्रायोगिक दृष्टिकोण के फायदे और सीमाएं हैं । वर्णित तरीके नैदानिक अभ्यास के अनुरूप एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनश्च और प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया । शोधकर्ताओं ने विभिन्न प्रकार के कक्ष, PSs, प्रकाश स्रोत और विकिरण पैरामीटर के साथ विधियों को अनुकूलित कर सकते हैं । हालांकि, इस approach करने के लिए सीमाएं है के रूप में इस प्रोटोकॉल अनुयाई एक monolayer में cultureed कक्षों के लिए डिज़ाइन किया गया है । नैदानिक अभ्यास में, ऊतक वास्तुकला या रोग विकृति (यानी, hyperkeratosis या फाइब्रोसिस) में अंतर पुनश्च अवशोषण या प्रकाश प्रवेश15कम हो सकती है । नतीजतन, उपचार खुराक और प्रयोगात्मक निष्कर्षों सीधे नैदानिक अभ्यास के अनुरूप नहीं हो सकता है । अंडाकार आकृति ट्यूमर मॉडल और microfluidic चिप तरीकों के रूप में अध्ययन किया गया है और अधिक बारीकी से दोहराने ट्यूमर microenvironments16,17,18। Spheroids भीतरी और बाहरी सेलुलर niches है कि अंतर photosensitizers को शामिल कर सकते है और विषम ट्यूमर वास्तुकला का प्रतिनिधित्व करते हैं । अंय शोधकर्ताओं microfluidic चिप्स का इस्तेमाल किया है के लिए उपचार की स्थिति और photosensitizers के संवहनी वितरण स्क्रीन । हालांकि, microfluidic चिप्स विकसित करने के लिए या तकनीक के साथ अपरिचित शोधकर्ताओं के लिए लागू करने के लिए मुश्किल महंगा हो सकता है । इसके अलावा, spheroids और microfluidic चिप्स त्वचा कैंसर के नैदानिक उपचार है जिसमें photosensitizers सीधे संवहनी प्रसार के बिना ट्यूमर की सतह के लिए लागू कर रहे है को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं । शोधकर्ताओं को विभिंन रोग प्रणालियों में pst अध्ययन के लिए monolayer संस्कृति, अंडाकार आकृति ट्यूमर मॉडल, और microfluidic चिप्स के पेशेवरों और विपक्ष का मूल्यांकन करने की आवश्यकता हो सकती है । के रूप में कोई प्रतिरक्षा कोशिकाओं या extracellular मैट्रिक्स हैं, यह कैसे pst जटिल सेल सेल बातचीत को प्रभावित करता है यह निर्धारित करने के लिए संभव नहीं है । शोधकर्ताओं ने इन विट्रो प्रयोगात्मक पशु मॉडल और नैदानिक परीक्षणों का उपयोग परिणामों में पुष्टि करने की आवश्यकता हो सकती है । उच्च अंतर परीक्षण वैधता प्राप्त करने के लिए, यह लगातार गर्मी और प्रकाश मानकों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है जब में प्रदर्शन इन विट्रो pst प्रयोगों ।
तापमान pst19की प्रभावकारिता में परिवर्तन करने के लिए जाना जाता है । एक अध्ययन है कि कोशिका मृत्यु, 5-अला, पीपी-ग्यारहवीं गठन, और cytokine रिलीज 5-४४ डिग्री सेल्सियस तक तापमान पर ाला-अला के साथ कोशिकाओं को बढ़ाया जा सकता है का प्रदर्शन किया19। ४४ डिग्री सेल्सियस से ऊपर की मशीन तापमान थर्मल प्रेरित कोशिका मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और 20 डिग्री सेल्सियस से नीचे की मशीन तापमान महत्वपूर्ण 5-अला के लिए नेतृत्व नहीं कर सकते है और19संचय । हम अनुशंसा करते हैं कि शोधकर्ताओं ने एक तापमान पर पी एस मशीन प्रदर्शन-समायोज्य हीटिंग ब्लॉक एक निरंतर तापमान पर संभावित थर्मल प्रभाव को प्राप्त करने के लिए नियंत्रित करने के लिए. इसके अतिरिक्त, यह समय की एक पर्याप्त राशि के लिए photosensitizer मशीन के लिए 5 के रूपांतरण के लिए अनुमति देना महत्वपूर्ण है-पीपी-IX में ाला । इस प्रोटोकॉल में, SCC-13 कोशिकाओं 5-30 मिनट है, जो सफलतापूर्वक सेल apoptosis प्रेरित के लिए अला के साथ मशीन थे । हम पहले से दिखा दिया है कि 5 के एक 10 मिनट की मशीन-ाला काफी अनुपचारित नियंत्रण fibroblasts11,14की तुलना में fibroblast में apoptosis वृद्धि नहीं हुई । पीपी-नौवीं 5 के बाद माउस त्वचा में जमा शुरू होता है-ाला ३७ डिग्री सेल्सियस पर छह मिनट के लिए मशीन है । इसलिए, 5 के दस मिनट के बाद-ाला की मशीन, वहां पीपी-IX के पर्याप्त संचय सेल apoptosis20प्रेरित नहीं हो सकता है । हम 5 के लिए 20 से 30 मिनट की एक ंयूनतम मशीन की अवधि की सिफारिश-अला हमारे पिछले अध्ययन के आधार पर11,14। शोधकर्ताओं को प्रयोगशाला की स्थापना, ब्याज की photosensitizer, सेल प्रकार, और नैदानिक संकेत के आधार पर गर्मी की अवधि का अनुकूलन करने की आवश्यकता हो सकती है । एंटीबॉडी अनुमापन और ऑप्टिमाइज़ेशन प्रयोगों को निर्माताओं के दिशानिर्देशों का उपयोग करके सर्वोत्तम परिणामों के लिए किया जा सकता है. ब्याज की अंय परख ROS के dihydroethidium प्रवाह cytometric ठहराव सहित नीले प्रकाश photoactivation निंनलिखित प्रदर्शन किया जा सकता है । 14
सतह क्षेत्र (यानी, विकिरण) और कुल विकिरण खुराक (यानी, photoactivation चरण के दौरान प्रवाह) के प्रति इकाई दिया प्रकाश की राशि में भिंनता ROS गठन और सेल apoptosis21को प्रभावित कर सकते हैं । प्रवाह, विकिरण, और समय के बीच संबंध निंन समीकरण द्वारा वर्णित किया जा सकता है:
(J/cm2) = विकिरण (W/cm2) x समय (ओं) का प्रवाह
के रूप में प्रवाह समय पर निर्भर है, लंबी या photoactivation चरणों छोटा उपचार प्रभावकारिता बदल सकते हैं । विकिरण प्रकाश स्रोत और लक्ष्य ऊतक के बीच चुकता दूरी के लिए आनुपातिक है । एक परिणाम के रूप में, यदि प्रकाश बहुत दूर है, वहां पर्याप्त प्रकाश ऊर्जा लक्षित ऊतक को वितरित करने के लिए पुनश्च उत्तेजित नहीं हो सकता है । वैकल्पिक रूप से, विकिरण आसपास के सतहों को प्रतिबिंबित प्रकाश द्वारा बढ़ाया जा सकता है । इसलिए, हम कक्ष संस्कृति प्रकाश प्रतिबिंब को रोकने के लिए एक काली सतह पर रखा प्लेटों के साथ प्रकाश विकिरण प्रदर्शन की सलाह देते हैं । शोधकर्ताओं ने वाणिज्यिक उपलब्ध या एफडीए अनुमोदित नीले प्रकाश उत्सर्जक डायोड और फ्लोरोसेंट उपकरणों को pst प्रयोगों में उपयोग करने के लिए प्राप्त कर सकते हैं, लेकिन इन उपकरणों के विभिन्न शक्ति outputs और प्रकाश क्षेत्र एकरूपता हो सकता है. एक तरंग दैर्ध्य-विशिष्ट फोटोमीटर के लिए सेल सतह और प्रकाश क्षेत्र की एकरूपता पर विकिरण को मापने के लिए हर प्रयोग से पहले लगातार परिणाम के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विसारक क्षेत्र एकरूपता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो ।
संक्षेप में, हम इन विट्रो में वर्णित है सिद्धांत का ब्यौरा द्वारा pst जांच करने के लिए दृष्टिकोण, प्रयोगात्मक तरीकों, सीमाएं, संभावित नुकसान, और अनुकूलन के लिए सिफारिशें । pst एक उपयोगी नैदानिक प्रक्रिया है और इन विट्रो अनुसंधान में उपंयास PSs के विकास के लिए अनुमति दे सकता है, प्रोटोकॉल का अनुकूलन, और pst के लिए नए संकेत ।
Disclosures
दुसा/सन फार्मास्युटिकल 5-ाला और BLU-U प्रकाश युक्ति प्रदान की है । इस पांडुलिपि को डॉ Jagdeo के अवशिष्ट धन का समर्थन प्राप्त था । सामग्री के दिग्गजों मामलों या संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार के अमेरिकी विभाग के विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते ।
Acknowledgments
लेखकों को कोई पावती नहीं है ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Keratinocyte serum free medium | Thermofisher | 17005042 | Culture medium for SSC-13 cells |
DMEM low glucose glutamax | Thermofisher | 10567022 | Possible culture medium for other cell types |
6-well culture plates | Thermofisher | 720083 | |
PBS | Thermofisher | 14190250 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25200056 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | For cell counting and plating |
BLU-U light | DUSA | Request from manufacturer | Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used |
5-ALA | DUSA | Request from manufacturer | |
FBS | Atlanta Biologicals | C17032 | |
FlowCellect Annexin Red Kit | Millipore Sigma | FCCH100108 | Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer |
FACSCanto II | BD | Request from manufacturer | Any flow cytometer may be used |
Counting Chamber | Hausser | 3120 | For cell counting and plating |
FlowJo | FlowJo | Request from manufacturer | Flow cytometry analysis software |
References
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