Summary
Fotodynamisk terapi (PDT) är en medicinsk procedur som innebär inkubering av ett exogent tillämpad photosensitizer (PS) följt av synligt ljus ljusaktivering att inducera apoptos. Vi presenterar en in vitro- PDT-protokoll utformat för att simulera PDT som kan användas för att studera skillnader i PS inkubation och ljus behandling parametrar.
Abstract
Fotodynamisk terapi (PDT) är en medicinsk procedur som innebär inkubering av ett exogent tillämpad photosensitizer (PS) följt av synligt ljus ljusaktivering inducera cell apoptos. Federal Drug Administration har godkänt PDT för behandling av aktinisk keratos och kliniska riktlinjer rekommenderar PDT som en behandling för vissa icke-melanom hudcancer och acne vulgaris. PDT är en fördelaktig terapeutiska modalitet som låg kostnad, icke-invasiv, och associerade med minimala biverkningar och skrämma. I det första steget av PDT, en PS appliceras och anhopas intracellulärt. Efterföljande ljus bestrålning inducerar reaktivt syre arter-formationen, vilken kan i slutändan leda till cell apoptos, membran avbrott, mitokondriell skada, immun modulering, keratinocyter spridning och kollagen omsättning. Häri, presenterar vi en in vitro- Metod för att studera PDT i en vidhäftande cellinje. Denna behandling-protokollet är avsett att simulera PDT och kan justeras för att studera användning av PDT med olika cellinjer, photosensitizers, inkubation temperaturer eller ljusaktivering våglängder. Skivepitelcancer celler inkuberades med 0, 0.5, 1.0 och 2 mM 5-aminolevulinsyra (5-ALA) för 30 min och photoactivated med 417 nm blå ljus för 1000 s. Det primära effektmåttet var apoptos och nekros, mätt som annexin-V och 7-aminoactinomycin D flödescytometri. Det var en dosberoende ökning av cell apoptos efter trettio minuters inkubering av 5-ALA För att uppnå hög Inter test validitet, är det viktigt att upprätthålla konsekvent inkubation och ljus parametrar när du utför in vitro- PDT experiment. PDT är en användbar kliniska förfarande och in vitro- forskning kan tillåta för utveckling av romanen PSs, optimering av protokoll och nya indikationer för PDT.
Introduction
Fotodynamisk terapi (PDT) är en medicinsk procedur som innebär inkubering av ett exogent tillämpad photosensitizer (PS) följt av synligt ljus ljusaktivering inducera cell apoptos. Federal Drug Administration (FDA) har godkänt PDT för behandling av aktiniska keratoser (AK) och kliniska riktlinjer rekommenderar PDT som en behandling för vissa icke-melanom hudcancer och acne vulgaris1,2. Framväxande icke-dermatologiska användningsområden för PDT är behandling av gastrointestinala, prostata och gynekologisk cancer3. PDT är en fördelaktig terapeutiska modalitet som låg kostnad, icke-invasiv och associerade med minimala biverkningar och ärrbildning2.
I det första steget av PDT, en PS appliceras och anhopas intracellulärt2. I USA används ofta lokalt 5-aminolevulinsyra (5-ALA) att behandla AKs. Under inkubationstiden omvandlas fas, 5-ALA till protoporfyrin IX (PP-IX) via heme biosyntes vägen i bolagiserade celler3. Cancer och före cancer celler har minskad ferrokelatas aktivitet, som omvandlar protoporfyrin IX (PP-IX), till slutprodukten, heme. Som ett resultat, ansamlas cancer celler PP-IX jämfört med normala celler4,5. Denna ansamling av PP-IX i cancer och före cancerceller i förhållande till omgivande vävnad möjliggör PDT vara en målinriktad strategi med minimala biverkningar. Ljus bestrålning leder till reaktivt syre arter (ROS) generation när syre accepterar glada elektroner från PP-IX. PP-IX har en peak absorptionen i den ultravioletta spectrumen med mindre toppar i hela det synliga spektrat, inklusive blått och rött ljus2. ROS bildandet kan i slutändan leda till cell apoptos, membran avbrott, mitokondriell skada, immun modulering, keratinocyter spridning och kollagen omsättning6,7,8,9 , 10.
PDT utvecklades på 1970-talet och en framväxande terapeutiska modalitet3. FDA-godkända protokollet för behandling av AKs rekommenderar 5-ALA hud inkubation i 14 – 18 h, men 1 till 2 h inkubationer används ofta i klinisk praxis2. In vitro, vi har visat att kortare 15 min 5-ALA inkubationer kan öka fibroblast cell apoptos jämfört med obehandlade fibroblaster11,12. Dessutom studeras roman chlorin, phthalocyanine och nanopartiklar-baserade PSs för att förbättra PDT effekt3. Häri, presenterar vi en in vitro- Metod för att studera PDT i en vidhäftande Skivepitelcancer celler. I detta protokoll, SCC-13 cellerna inkuberas med 0, 0.5, 1.0 och 2 mM 5-ALA för 30 min och photoactivated med 417 nm blå ljus för 1000 s. Det primära effektmåttet är apoptos och nekros, mätt som annexin-V och 7-aminoactinomycin D (7-AAD) flödescytometri. Denna behandling-protokollet är avsett att simulera PDT och kan justeras för att studera användning av PDT med andra cellinjer, photosensitizers, inkubation temperaturer eller ljusaktivering våglängder. Beredning av ytterligare kontrollgrupper kan vara nödvändigt, inklusive ofärgade, enda fluorophore målat, negativa och positiva kontroller för flödescytometri. En omfattande översyn av teori, protokoll, experimentell design och gating för apoptos/nekros flödescytometri kan hittas någon annanstans13.
Protocol
1. beredning av celler
- Tallrik 20 000 celler i 2 mL odlingsmedium i varje brunn 6-well platta med steril teknik i en biosäkerhet skåp.
- Placera 6 brunnar i en fuktad inkubator (37 ° C, 5% CO2) för 24 h så att cellerna att följa plattor.
2. beredning av Photosensitizer för behandling av celler
- Förbereda 0,5, 1 och 2 mM 5-ALA lösningar i odlingsmedium. Om fostrets bovint serum (FBS) är en ingrediens som odlingssubstrat, förbereda och behandla celler med 5-ALA i odlingsmedium lösning med 0,1% FBS för inkubationer. 11 , 12 i det här fallet SCC-13 celler kräver inte FBS, så 5-ALA lades direkt till keratinocyter serumfritt medium kompletteras med nötkreatur hypofysen extrakt och epidermal tillväxtfaktor.
- Sug ut odlingsmediet och tvätta cellerna med minst 2 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Aspirera PBS och tillsätt 2 mL 0, 0,5, 1 eller 2 mM 5-ALA lösningar i separata plattor eller brunnar.
- Inkubera cellerna med 0, 0,5, 1 eller 2 mM 5-ALA på en 36-37 ° C värme block för 30 min. skydda celler från ljus exponering under inkubation med aluminiumfolie.
- Sug ut 0, 0,5, 1 och 2 mM 5-ALA lösningarna och tvätta cellerna med 2 mL PBS.
- Aspirera PBS och tillsätt 2 mL odlingsmedium för blå ljus bestrålning.
3. blått ljus fototerapi
- Innan bestråla cellerna, aktivera blå ljus enheten (t.ex., lysdioder, lysrör eller halogenlampa) och kör för en cykel (1000 s) att värma upp enheten. Blå ljus enheten bör ha en utgång våglängd av 417 +/-5 nm. Att låta enheten för att köra för en cykel innan behandlingar säkerställer att blå ljus våglängd och irradians är konsekvent under hela fasen ljusaktivering.
- Använd en fotometer för att mäta irradians på cellytan. Blå ljus irradiansen på cellens yta bör vara 10 mW/cm2. Avståndet mellan ljuset och cellerna kan behöva justeras för att uppnå en irradians av 10 mW/cm2 beroende på intensiteten av ljuskällan.
- Placera 0, 0,5, 1 och 2 mM ALA behandlingsgrupperna på en svart yta under den blå ljuskällan. Bestråla cellerna med blått ljus för 1.000 s (16 min och 40 s) för en total fluence 10 J/cm2. Efter blå ljus ljusaktivering är cellerna redo för analys.
4. insamling och färgning
- Förbereda flöde buffert enligt tillverkarens riktlinjer (se Tabell för material).
- Aspirera odlingsmedium och tvätta cellerna med 2 mL PBS.
- Tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin-EDTA och celler lossna för cirka 3 till 5 min. Cellerna kan undersökas i Mikroskop till bekräfta cell avlossning.
- Tillsätt 1 mL odlingsmedium (eller PBS) med 10% fetalt bovint serum att avaktivera trypsin.
- Samla in cellsuspension i märkt 5 mL flöde rör.
- Snurra 5 mL flöde tube i en centrifug på 201 x g för 5 min. Aspirera lösning utan att ta bort cellpelleten.
- Tillsätt 200 µL flöde buffert med konjugerad annexin-V antikropp (1 µL av annexin-v per 39 µL av flöde buffert) i varje prov.
- Att resuspendera cellerna och placera i inkubatorn (37 ° C, 5% CO2) för 20 min att tillåta annexin-V bindning.
- Lägga till 3 µL av 7-AAD varje prov. Inkubera i 5 min i rumstemperatur.
5. flöde flödescytometrisk analys
- Följ flödet cytometer tillverkare riktlinjer för struktur (se Tabell för material).
- Samla in och analysera prover med flödescytometri. 13
- Utföra statistiska jämförelse av behandling och kontrollgrupper med variansanalys (ANOVA)14. Jämföra hjälpmedlet av behandlingsgrupperna att medelvärdet av kontrollen med en Dunnetts test för post hoc analys.
Representative Results
Efter SCC-13 var cellerna inkuberas i 30 min med 0, 0,5, 1 och 2 mM 5-ALA och bestrålade med 1000 s av blått ljus, det var en dosberoende ökning av cell apoptos. Totala apoptos (medelvärde ± medelfel av medelvärde) var 3,94 ± 0,34, 7,90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52, och 38.33 ± 1,81 efter 30 min av inkubation med 0, 0,5, 1 och 2 mM 5-ALA, respektive, och 1000 sekunder av blått ljus (figur 1). Vi jämförde genomsnittlig andelen apoptotiska celler bland 0, 0,5, 1 och 2 mM 5-ALA ruvade grupper med ANOVA. Celler behandlas med 1 och 2 mM 5-ALA hade en betydande ökning i cell apoptos jämfört med 0 mM 5-ALA behandlade cellerna. Figur 2A visar representativa flöde flödescytometrisk gating av framåt scatter (FSC) kontra side scatter (SSC) för SCC-13 cellerna inkuberas med 0, 0,5, 1 och 2 mM 5-ALA. Den cirkel gating omsluter SCC-13 cell befolkningen. För detta experiment, 7500 händelser insamlades och stadsporten SCC-13 cell befolkningen fångade minst 90% av händelser. Figur 2B visar en representativ tomt på den 7-AAD på x-axeln och annexin-V för x-axeln. Cellpopulationer är gated i fyra kvadranter (Q1 till Q4) att diskriminera apoptotiska celler. Q1 (hög annexin-v, låg 7-AAD) representerar celler som genomgår tidiga apoptos. Q2 (hög annexin-v, hög 7-AAD) representerar celler som genomgår sena apoptos eller nekros. Q3 (låg annexin-v, hög 7-AAD) representerar celler som genomgår nekros. Q4 (låg annexin-v, låg 7-AAD) representerar celler inte genomgår apoptos eller nekros. För att beräkna procentandelen av celler som genomgår apoptos, vi lagt till andelen celler i Q1 och Q2. Inkonsekvens i 5-ALA inkubation periodens längd, inkubation temperatur eller ljusaktivering bestrålning dos kan förändra PDT effekt. Figur 3 visar en representativ annexin-V och 7-AAD flöde flödescytometrisk tomt när inkubation temperaturen är varierad (dvs, 27, 36 eller 42 ° C). Det fanns en temperatur beroende ökning av apoptos.
Figur 1: dosberoende ökning av apoptos efter trettio minuters inkubation av 5-ALA 5-ALA inkuberas vid 36 ° C under trettio minuter följt av 1000 s av blått ljus i SCC-13 celler. Staplarna representerar genomsnittlig procent annexin-V positiva celler i varje behandling och kontrollgruppen. Experimenten utfördes i tekniska tre exemplar. Statistisk signifikans bestämdes av ANOVA, med p < 0,05 betecknas med en asterisk (*). Felstaplar representera medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representant Flow Cytometry tomter. (A) representativa framåt vs. side scatter flödescytometri spridningsdiagram i godtyckliga enheter (AU) för x - och y - axeln för 0, 0,5, 1 och 2 mM 5-ALA ruvade celler. För detta experiment, 7500 händelser insamlades och stadsporten SCC-13 cell befolkningen fångade 90% av händelser. (B) representativa annexin-V vs 7-AAD flödescytometri tomter i AU för x - och y - axeln för 0, 0,5, 1 och 2 mM 5-ALA ruvade celler. Q1: tidig apoptotiska celler, Q2: sena apoptotiska/nekrotiska celler, Q3: nekrotiska celler och Q4: viabla celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ruvning 5-ALA vid olika temperaturer kan förändra PDT effekt. Representativa annexin-V vs 7-AAD flödescytometri tomter i AU för x - och y - axeln för SCC-13 cellerna inkuberas med 0,5 mM 5-ALA på 27, 36 och 42 ° C. Q1: tidig apoptotiska celler, Q2: sena apoptotiska/nekrotiska celler, Q3: nekrotiska celler och Q4: viabla celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Det fanns en betydande ökning av SCC-13 apoptos efter 30 min inkubationer 0,5, 1 och 2 mM 5-ALA följt av 1000 s av blått ljus. Dessa resultat är förenliga med vår tidigare publicerade forskning visar att 5-ALA inkubationer 30 min följt av blue light aktivering leder till en dosberoende ökning av andelen fibroblast celler som genomgår apoptos12, 14.
Detta experimentella tillvägagångssätt för att studera PDT har fördelar och begränsningar. De beskrivna metoderna överensstämma med klinisk praxis som en kommersiellt tillgänglig PS och ljuskälla användes. Forskare kan anpassa metoderna med olika celltyper, PSs, ljuskällor och bestrålning parametrar. Dock finns det begränsningar i detta tillvägagångssätt som detta protokoll är konstruerad för vidhäftande celler odlade i en enskiktslager. I klinisk praxis, skillnader i vävnad arkitektur eller sjukdom patologi (dvs, hyperkeratos eller fibros) kan minska PS absorption eller ljus penetration15. Som ett resultat, kanske den behandling doser och experimentella resultaten inte direkt motsvarar klinisk praxis. Sfäroid tumör modeller och mikroflödessystem chip har studerats som metoder att närmare replikera tumör mikromiljö16,17,18. Spheroids har inre och yttre cellulära nischer som differentially kan införliva photosensitizers och representerar heterogena tumör arkitekturen. Andra forskare har använt mikroflödessystem marker till skärmen behandling villkor och vaskulära leverans av photosensitizers. Mikroflödessystem chip kan dock kostsamt att utveckla eller svårt att genomföra för forskare som är obekant med tekniken. Spheroids och mikroflödessystem chip kan dessutom inte avspegla klinisk behandling av hudcancer där photosensitizers tillämpas direkt på tumör ytan utan vaskulär spridning. Forskare kan behöva utvärdera för- och nackdelar av enskiktslager kultur, sfäroid tumör modeller och mikroflödessystem chip för att studera PDT i olika sjukdomen system. Det finns inga immuna celler eller extracellulära matrix, är det inte möjligt att avgöra hur PDT påverkar komplexa cell-cell interaktioner. Forskare kan behöva bekräfta in vitro- experimentella resultat med hjälp av djurmodeller och kliniska prövningar. För att uppnå hög Inter test validitet, är det viktigt att upprätthålla konsekvent inkubation och ljus parametrar när du utför in vitro- PDT experiment.
Temperatur är kända för att påverka effekten av PDT19. En studie visade att celldöd, 5-ALA-upptag, PP-IX bildandet och cytokinfrisättning kan förbättras genom ruvning celler med 5-ALA vid temperaturer upp till 44 ° C19. Inkubation temperaturer över 44 ° C kan leda till termisk inducerad celldöd och inkubation temperaturer under 20 ° C får inte leda till betydande 5-ALA-upptag och ackumulering19. Vi rekommenderar att forskare utför PS inkubationer på en temperatur-justerbar värmeblock vid en konstant temperatur kontroll för potentiellt störande termiska effekter. Det är dessutom viktigt att ruva photosensitizer för en tillräckligt lång tid för omvandlingen av 5-ALA till PP-IX. I detta protokoll inkuberades SCC-13 celler med 5-ALA för 30 min, som framgångsrikt inducerad cell apoptos. Vi har tidigare visat att en 10 minuters inkubation av 5-ALA betydligt inte ökade apoptos i fibroblast jämfört med obehandlad kontroll fibroblaster11,14. PP-IX börjar ansamlas på mus hud efter 5-ALA inkubation för sex minuter vid 37 ° C. Därför, efter tio minuter av 5-ALA inkubation, det kan inte finnas tillräcklig ackumulation av PP-IX att inducera cell apoptos20. Vi rekommenderar en minsta inkubationstid på 20-30 min för 5-ALA baserat på våra tidigare studier11,14. Forskare kan behöva optimera inkubationstiden baserat på laboratoriet inställning, photosensitizer intresse, celltyp och klinisk indikation. Antikropp titrering och optimering experiment kan utföras för bästa resultat använder tillverkare riktlinjer. Andra analyser av intresse kan utföras efter blå ljus ljusaktivering inklusive dihydroethidium flöde flödescytometrisk kvantifiering av ROS. 14
Variation av mängden ljus levereras per enhet av yta (dvs irradians) och total bestrålning dos (dvs fluence) under fasen ljusaktivering kan påverka ROS bildandet och cell apoptos21. Förhållandet mellan fluence, irradians och tid kan beskrivas av följande ekvation:
Fluence (J/cm2) = irradians (W/cm2) x tid (s)
Fluence är beroende av tid, kan förlänga eller förkorta ljusaktivering faserna ändra behandlingseffektivitet. Irradiansen är proportionell mot avståndet fyrkant mellan ljuskällan och målvävnaden. Som ett resultat, om ljuset är för långt bort, det kanske inte finns tillräckligt ljus energi som levereras till riktade vävnaden att excitera det PS. Alternativt irradiansen kan ökas genom ljus som reflekteras från de omgivande ytorna. Därför rekommenderar vi utför ljus irradiations med cell kultur plattorna placeras på en svart yta för att förhindra ljusreflektion. Forskare får förvärva kommersiellt tillgängliga eller FDA-godkända blå lysdioder och fluorescerande enheter att använda i PDT experiment, men dessa enheter kan ha olika makt utgångar och ljust sätta enhetlighet. En våglängd-specifika fotometer bör användas för att mäta irradiansen på cellytan och enhetlighet i fältet ljus innan varje experiment för konsekventa resultat. En kommersiellt tillgänglig diffusor kan användas att förbättra fältet enhetlighet, om det behövs.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en in vitro -metod att undersöka PDT genom teori, experimentella metoder, begränsningar, potentiella fallgropar och rekommendationer för optimering. PDT är en användbar kliniska förfarande och in vitro- forskning kan tillåta för utveckling av romanen PSs, optimering av protokoll och nya indikationer för PDT.
Disclosures
DUSA/Sun Pharmaceutical lämnat 5-ALA och BLU-U ljus enheten. Detta manuskript stöddes av Dr. Jagdeo resterande finansiering. Innehållet representerar inte åsikter US Department of Veterans Affairs eller Förenta staternas regering.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte serum free medium | Thermofisher | 17005042 | Culture medium for SSC-13 cells |
| DMEM low glucose glutamax | Thermofisher | 10567022 | Possible culture medium for other cell types |
| 6-well culture plates | Thermofisher | 720083 | |
| PBS | Thermofisher | 14190250 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25200056 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | For cell counting and plating |
| BLU-U light | DUSA | Request from manufacturer | Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used |
| 5-ALA | DUSA | Request from manufacturer | |
| FBS | Atlanta Biologicals | C17032 | |
| FlowCellect Annexin Red Kit | Millipore Sigma | FCCH100108 | Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer |
| FACSCanto II | BD | Request from manufacturer | Any flow cytometer may be used |
| Counting Chamber | Hausser | 3120 | For cell counting and plating |
| FlowJo | FlowJo | Request from manufacturer | Flow cytometry analysis software |
References
- Morton, C., et al. European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy. European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).
- Ozog, D. M., et al. Photodynamic therapy: A clinical consensus guide. Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).
- Abrahamse, H., Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers. Metal-Based Drugs. 2008, 276109 (2008).
- Ohgari, Y., et al. Mechanisms involved in δ-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin. Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).
- Kessel, D., Luo, Y. Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 42 (2), 89-95 (1998).
- Goldberg, D. J. Photodynamic therapy in skin rejuvenation. Clinics in Dermatology. 26 (6), 608-613 (2008).
- Sakamoto, F. H., Lopes, J. D., Anderson, R. R. Photodynamic therapy for acne vulgaris: A critical review from basics to clinical practice: Part I. Acne vulgaris: When and why consider photodynamic therapy. Journal of the American Academy of Dermatology. 63 (2), 183-193 (2010).
- Boen, M., Brownell, J., Patel, P., Tsoukas, M. M. The role of photodynamic therapy in acne: An evidence-based review. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (3), 311-321 (2017).
- Allison, R. R., Moghissi, K. Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 10 (4), 331-341 (2013).
- Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death. Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).
- Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro. Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).
- JoVE Science Education Database. Cell Biology. Annexin V and Propidium Iodide Labeling. JoVE. , Cambridge, MA. (2018).
- Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts. British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).
- Gilaberte, Y., et al. Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy. Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).
- Yoon, H. K., et al. Nanophotosensitizers engineered to generate a tunable mix of reactive oxygen species, for optimizing photodynamic therapy, using a microfluidic device. Chemistry of Materials. 26 (4), 1592-1600 (2014).
- Chen, Y. -C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures. Scientific Reports. 5, 12175 (2015).
- Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. Low-dose PDT on breast cancer spheroids. Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).
- Yang, J., et al. The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).
- Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).
- Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).
