Summary
중간 대뇌 동맥의 Intraluminal 필 라 멘 트 폐색 설치류 실험 뇌졸중의 가장 자주 사용 된 vivo에서 모델입니다. 일반적인 경 동맥 복구를 허용 하는 다른 수술 접근 여기, 일반적인 경 동맥의 reperfusion 및 중간 대뇌 동맥 영역 전체 reperfusion 수 있습니다 수행 됩니다.
Abstract
허 혈 성 뇌졸중 성인 장기 장애 및 죽음은 전세계의 주요 원인입니다. 현재 치료 가능한만 조직 플라스 미노 겐 활성 제 (tPA) 허 혈 성 뇌졸중을 대상으로 승인 된 약물 치료와 함께 제한 됩니다. 허 혈 성 뇌졸중의 분야에서 현재 연구 개발 하 고 새로운 제약 대상 조사 선의 이상 더 나은 이해에 집중 한다. 신뢰할 수 있는 실험 선 모델은 잠재적인 치료의 진행에 대 한 중요 한. 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO) 모델 임상 관련 이며 가장 자주 설치류에서의 뇌경색 수술 모델을 사용 합니다. 그러나, 병 변 볼륨 등이 모델의 결과 다양성, 특히 쥐의 상부와 연결 됩니다. 여기에 설명 된 대체 MCAO 모델에서는 일반적인 경 동맥 (CCA)의 reperfusion와 배, 그리고는 향상 된 복구 fibrinogen 기반 실 란 트와 조직 패드를 사용 하 여 중간 대뇌 동맥 (MCA) 영토의 증가 관류 외부 경 동맥 (ECA) 결 찰을 피 함으로써 쥐의 복지. 이 마우스에 변수 해부학 높은 것으로 알려져 있다 윌리스의 원형에 대 한 의존도 줄일 수 있습니다. 대표적인 데이터는 전통적인 MCAO 접근 및 여기에 설명 된 대체 접근 사이 병 변 양에 있는 변화를 감소이 대체 수술 방법을 사용 하 여 보여줍니다.
Introduction
대뇌 치기의 주요 원인은 중간 대뇌 동맥의 영토에 초점 국 소 빈 혈 이다. 조직 플라스 미노 겐 활성 제 (tPA)는 수많은 임상 약물 실험 대상으로 뇌경색1,2하에 불구 하 고 입증 된 효능 함께 사용할 수만 약리학 처리 이다. 그러나, 안전 관심사 및 좁은 치료 창 (< 4.5 h)의 모든 뇌졸중 환자 ~ 15%만 tPA, 받을 수 있습니다 하 고 recanalization 요금 < 503,4수 있습니다 키를 누릅니다.
스트로크의 재현할 수 및 임상 관련 동물 모델 알려 새로운와 잠재적인 뇌졸중 치료 치료의 개발에 필수적인 간주 됩니다. 그러나, 일관성 및 동물 모델 결과에 변화에 대 한 우려로 인해 병원에 전 임상 연구에서 번역을 개선 하기 위해 기존 vivo에서 모델을 수정 하는 것이 중요 남아 있습니다. 임상 사용의 잠재적인 치료 전 임상 실험 효능에서 번역의 부족은 뇌졸중 연구5에 대 한 지속적인 관심사 이다. 번역의 오류에 대 한 이유는 여러 될 것 하 고 관련이 있을 수 있습니다, 예를 들어 시험 설계, 치료 지연, 임상 획이 고 동물 모델의 한계 사용6. 뇌졸중 연구를 위한 핵심 과제 안전 하 고 효과적인 치료의 개발에 남아 있다.
Intraluminal 필 라 멘 트 삽입에 의해 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)는 가장 자주 사용 된 vivo에서 설치류 모델 실험 선의. 이 모델에는 허 혈 유도, 인간의 선7에서 발생 하는 이벤트를 흉내 낸 후 혈액 흐름의 복원을 수 있습니다. 그러나, 특히 쥐, 다양 한 표준 편차와 다른 유형의 병 변 볼륨 발생 정의 하더라도 수술 프로토콜 적용된8,,910합니다. 그것은 전형적인 작은 striatal 및 큰 striato 외피 병 변의 볼륨11의 모달 분포를 볼 수입니다. 허 혈을 유도 하는 필 라 멘 트 일반적으로 CCA 또는 다음 영구적으로 합자12남아 있는 ECA의 절 개를 통해 삽입 됩니다. CCA의 영구 결 찰 내부 경 동맥 (ICA)와, 그 후, MCA 영역에 혈액 흐름의 재건 립을 방지합니다. 윌리스의 원형 (소) 내에서 부수적인 공급에 의존 하는 reperfusion을 발생 합니다. 암소 구조는 C57BL/6 마우스는 스트레인 뇌졸중 연구13 vivo에서 일반적으로 사용에 특히 개별 동물 사이의 해부학 적 변화. ECA를 통해 필 라 멘 트 삽입의 다른 방법, CCA, 하지만이 방법은 타협을 통해 지속적인된 관류에서는에 표시 되었습니다, 쥐, 동물의에 해로운 효과가 ECA 지역 동맥 공급 웰빙14.
부수적인 공급 및 설립된 MCAO 모델에서 reperfusion 암소에 대 한 의존도, 부분적으로, 다음 폐색 병 변 볼륨 변화에 대 한 계정. 따라서 허용 CCA, 암소의 독립을 통해 reperfusion ECA 결 찰은 피할 수 및 CCA 절 개, 수리는 다른 murine 외과 절차를 설명 합니다. CCA 절 개 수리 이전 보였다 쥐에 CCA15통해 성공적인 reperfusion 귀착되 기 위하여. 우리 마우스11 에서 성공적으로이 방법을 적용 하 고 여기 프로토콜 병 변, 실험 선 연구에 사용 되는 주요 결과 측정에에서 감소 된 가변성에 어떤 결과 보고 합니다.
이 프로토콜 MCAO reperfusion를 허용 하는 조직 패드 및 실 란 트 응용 프로그램을 포함 하는 CCA 선박 수리 뒤 CCA 배 필 라 멘 트 삽입을 통해 수행 하는 방법을 보여 줍니다.
Protocol
이 프로토콜 및 데이터 보고 및 기관 윤리 승인에 따라 영국 동물 (과학적인 절차) 행위 1986 (프로젝트 라이센스 60/4315)에 따라 실시 했다. 모든 실험 동물 연구에 따라 보고 됩니다: Vivo에서 실험 (도착) 지침16의 보고.
1입니다. 준비
- 성인 남성 C57BL/6 쥐 수술 치료 (예, 환경, 침구, 복구 식품)을 숙지 수술 전에 적어도 48 h.
참고: 게시물 MCAO 동물은 자주 먹고 수술 후 음주와 어려움이 있다.- 수술 후 과도 한 체중 손실을 방지 하려면 순응, 어떤 게시물 MCAO 다이어트에 동물 예를 들어 새 장 바닥에 직접 재 젤, 젤, 음식과 흠뻑 젖은 정상적인 다이어트 알 약을 배치.
- 흰 종이 칩 등 수술 침구 케이지 침구를 변경 합니다.
- 수술 설정 또는 절차를 시작 하기 전에 모든 수술 도구를 소독.
- 이렇게 하려면 압력가 마로 소독 (121 ° C, 15 분 15 psi의 최소)와 도구 또는 에틸렌 산화물 (8-10 h에 대 한 올바른 제조업체의 지침에 따라) 사용.
- 프로시저를 설정 하기 전에 모든 표면 소독. 무 균 수술 커튼 또는 압력가 호 일 수술 하는 동안 처리 해야 하는 항목에 대 한 모든 표면 커버. 절차의 기간에 대 한 무 균 기술을 사용 합니다.
참고: 압력가 호 악기 또는 수술 하는 동안 개최 하는 장비를 사용할 수 있습니다. 멸 균 장갑과 기술을 사용 하 여, 호 일 수 적용 되 고, 메 마른 필드에 항목을 배치 하는 다음. 이 따라, 메 마른 장갑 변경 하셔야 합니다.
2. 중간 대뇌 동맥 폐색 수술
- 성인 남성 C57BL/6 마우스의 수술의 때에 24-31 g를 무게를 사용 합니다. O2, 빨간 플라스틱 마 취 실에서 2 L/분에 5 %isoflurane 사용 하 여 마 취를 유도.
- 얼굴 마스크 외과 의사의 낮은 폐품 시스템에 의해 제공 (예를 들어, 70% N2O230% O2에서 1.5-2%), 수술에 대 한 적절 한 마 취 깊이 유지 하기 위해 isoflurane 감소 유도, 다음 isoflurane에 노출입니다.
참고: 질소 산화물 (N2O2) 사용할 수 있습니다 산소 (O2)와 함께에서 적절 한 마 취 깊이 isoflurane의 필요한 금액을 줄이기 위해. - 조직의 무 통 수술 전 관리 [carprofen, 10 mg/kg 피하 (사우스)] 요정-operatively 절 개를 취 사이트 (bupivacaine, 2 mg/kg 사우스, 0.9% 식 염 수에 희석된 1시 10분).
- 수술 전 복 (ip.) 살 균 prewarmed 0.9 %NaCl 용액의 200 µ L의 주사에 의해 체액 관리 합니다.
- 오른쪽의 모피를 면도 일시적인 지역 및 작은 발기를 사용 하 여 피부를 노출 하는 복 부 목 지역. 치료는 수술 동안 건조에서 그들을 방지 하기 위해 3 분 두 눈에 적용 눈 윤 활 유에 대 한 5% 액체 솔루션을 사용 하 여 피부 영역.
참고: 모니터 혈액 산소 포화, 심장 박동, 호흡 속도 펄스 프로브가 판독에 필요한 경우 머리의 뒷 다리를 제 모 크림을 사용 합니다. 깨끗 한 면을 사용 하 여 크림을 적용 새싹 그리고, 제 모 후 희석 액체 솔루션 지역을 씻어. 무 균 수술 필드를 오염 하는 느슨한 모피의 위험을 최소화 하기 위해 수술 영역에서이 단계를 수행 합니다. 연구원은 현지 연습에 따라 다른 수술 사이트 준비를 사용 하 여 싶을 수 있다. - 외과 영역에 마우스를 이동 하 고 무 균 드 레이프에 의해 포함 하는 homeothermic 열 매트에 수 그린 위치에 두십시오. 마 취를 통해 코 콘 유지 합니다. 마우스의 온도 모니터링 하 고 37.0 ±에 그것을 유지 하는 직장 프로브 삽입 0.6 ° c.
- 어떤 외과 절 개 전에 뒷 발 철수 반사를 확인 하 고 마 취 깊이 확인 하는 반사를 깜박.
- MCA 영역에 혈액 흐름을 기록 하는 레이저 도플러 flowmetry (LDF) 프로브를 연결 합니다.
- 해 부 stereoscope 사용 하 여, 오른쪽 눈과 귀를 15 번 메스를 사용 하 여 노출된 시간 피부에의 중간에 < 1 ㎝의 절 개를 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 두개골을 덮고, 부드럽게 뼈에서 이것을 근 근이 고 멸 균 면봉으로 표면 건조 내부 조직 해 부.
참고: 합니다 주의 하지 temporalis 근육 손상에. - 0.7 m m, 편평한 가장자리, 도넛 모양의 프로브 홀더,이 겨 내 고 섬유의 끝에 광학 일치 하 젤의 작은 금액을 놓고 하는 날카로운 메스를 사용 하 여 그것의 끝을 잘라 LDF 모니터에 연결 하는 유연한 단일 광섬유 프로브 잡고 가져가 라.
- 프로브 홀더;의 아래쪽 가장자리 주위 방수 슈퍼 접착제 접착제의 작은 금액을 놓으십시오 이 부분적으로 건조 하 고 볼품 없는 될 수 있습니다.
- 측 뼈 위에 두개골을 건조 하 고 뼈, 하 원에서 국 소 조직 접착제의 작은 금액을 장소 충분히 프로브 홀더.
- 이 지역 (6 m m 옆 2mm는 bregma에서 원심)에 장소에 이미 섬유 광섬유 프로브 프로브 홀더를 배치 합니다.
- 접착제 건조;에 대 한 시간 허용 일단 건조 하 고 연결 된 LDF 데이터 기록을 시작 합니다.
- 해 부 stereoscope 사용 하 여, 오른쪽 눈과 귀를 15 번 메스를 사용 하 여 노출된 시간 피부에의 중간에 < 1 ㎝의 절 개를 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 두개골을 덮고, 부드럽게 뼈에서 이것을 근 근이 고 멸 균 면봉으로 표면 건조 내부 조직 해 부.
- 부드럽게 넘겨 동물 부정사 위치, 레이저 도플러 프로브를 지원 하 고 그것의 초연을 방지 하도록 배려. 부드럽게 미소 한 구멍이 있는 의료 테이프, 한 켤레 면 싹 (또는 이와 유사한, 닫힌된 집게 등) 아래 지역 고 긴장을 만들 슬라이딩으로 내려 두 forepaws를 테이프. 무 균 보험을 유지 하기 위해 무 균 드 레이프와 마우스를 커버.
- 해 부와 노출 CCA의 시작.
- 15 번 메스 블레이드를 사용 하 여 노출 된 복 부 목에 1.5 c m 중간 절 개를 확인 합니다.
- 부드러운 둔 기 절 개 기술을 사용 하 여, 부드럽게 기도 노출 양쪽에 침 샘을 철회.
- 무뚝뚝한 절 개를 사용 하 여, 주변 조직과 vagal 신경에서 CCA 해 부.
참고: vagal 신경에 손상을 이동성, 먹이, 그리고 호흡 저하 될 수 있습니다로 직접 vagal 신경을 만지지 마십시오.
- CCA, 선박 그리고 vagal 신경에 복 부를 등 쪽 아래 6-0 봉합 비 분해할의 섹션과 작은 (2 cm)를 전달 합니다. 외과 의사를 가까이 한 실크 넥타이 그리고 CCA (근 위 타이) 주위 단단히 묶어. 느슨하게 묶어 ICA/ECA의 분기점 방향으로 두 번째 실크 넥타이 (원심 타이).
- CCA의 섹션을 시작 하려면 바로 위에 원심 넥타이 하지만 분기를 방해 하지 microvascular 클립을 적용 됩니다. 마이크로 욕실이 위를 사용 하 여 CCA에 작은 구멍을 확인 합니다.
참고:는 ECA 있어야 합니다 특허 항상. CCA 절 개 선박 및 쉽게 접근할 수 있는 복 부 위치; 폭의 더 이상 40% 이어야 합니다. 이 선박 수리 단계 게시물 MCAO에 중요 한 역할을 재생 됩니다. - CCA, microvascular 클립 쪽으로 전진에 7-0 실리콘 코팅 monofilament를 삽입 합니다.
참고: 필 라 멘 트 크기 설정 해야 합니다; 수술 전에 마우스의 무게에 따라 제조업체의 지침을 참조 하십시오.- 그것 손상 없이 자리에는 필 라 멘 트를 고정 하는 원심 넥타이, 충분히 조입니다. Microvascular 클립 클립 홀더를 사용 하 여 제거 합니다.
참고: 혈액 손실 없이 보여야 한다이 시점에서. 혈액의 역류 경우 넥타이 필 라 멘 트를 들고 꽉 충분히 않습니다.
- 그것 손상 없이 자리에는 필 라 멘 트를 고정 하는 원심 넥타이, 충분히 조입니다. Microvascular 클립 클립 홀더를 사용 하 여 제거 합니다.
- ICA에는 필 라 멘 트를 사전.
- 필 라 멘은 ICA 내 남아 pterygopalatine 동맥 (PPA)에 전달 하지 않습니다 확인 합니다. 이렇게 약간 해제 하 고 동물의 시체의 외부 측면에 실크 넥타이, 중 하나를 사용 하 여 CCA를 당기 그리고 PPA의 내부적으로 직면 오프닝 과거 휘게 하 필 라 멘 트를 조종.
참고: 한 번 MCA 지점 원점에 고급, 제공 된 영토에 상대 혈에 한 방울 LDF 값;에 표시 됩니다. 이 필 라 멘 트 배치를 확인합니다.
- 필 라 멘은 ICA 내 남아 pterygopalatine 동맥 (PPA)에 전달 하지 않습니다 확인 합니다. 이렇게 약간 해제 하 고 동물의 시체의 외부 측면에 실크 넥타이, 중 하나를 사용 하 여 CCA를 당기 그리고 PPA의 내부적으로 직면 오프닝 과거 휘게 하 필 라 멘 트를 조종.
- 필 라 멘 트를 안전한 장소에서 원심 실크 넥타이,이 매와 엄격한. 폐색 기간 동안 자리에 두고.
참고: 종속 개별 프로토콜에 동물 복구 케이지로 이동할 수 있습니다, 다음 복구, 봉합 상처 또는 폐색 기간 동안 마 취 하에서 남아 있다. 후자의 경우, 상처를 살 균 prewarmed 0.9 %NaCl 식 염 수를 사용 하 여 밖으로 건조에서 삭제할 확인 하십시오.
3입니다. 후 폐색
- MCAO 기간의 끝에, 백색 필 라 멘 트 머리 명확 하 게 표시 될 때까지 즉시는 필 라 멘 트를 철회.
- 그런 다음 느슨하게 원심 CCA 충분히 제거는 필 라 멘 트 머리 대부분 선박 탈출구의 넥타이.
참고: 필 라 멘 제거할 수 있습니다 완전히이 시점에서 의사는 혈액 손실을 방지 하기 위해 원심 넥타이 넥타이 속도와 확신 하는 경우. - CCA 분기 원심 넥타이 옆으로 수평 위치에 한 microvascular 클립을 배치 합니다. 원심 넥타이 느슨하게 하 고는 필 라 멘 트를 완전히 제거. 외과 의사를 향해 근 CCA 넥타이 아래 다른 microvascular 클립을 추가 합니다.
참고: 선박 어떤 미끄럼을 방지 하기 위해 클램프의 고정으로 충분히 멀리 확인 하십시오. 클립의 배치 클립 removers 쉬운 접근을 지키는 나중 단계 동안 필수적 이다. 클립은 더 나은 정리 및 조직 패치, 주변 근육에서 클립을 가로로 배치의 배치 수 있도록 선박을 리프트 수 있도록 사용할 수 있습니다. - 조심 스럽게 뒤 몽 #5 포 셉 또는 마이크로 욕실이 위를 사용 하 여 두 실크 넥타이 제거 하 고 건조 멸 균 면봉을 사용 하 여 영역.
참고: 배려 하지 잘라 통해/그릇을가지고 한다. - 멸 균 페 트리 접시에 fibrinogen 및 트 롬 빈 실 란 트 솔루션 1과 2 ( 재료의 표참조), 2 개의 물질을 보장 유지, 별도 준비 나중 혼합 추가 합니다.
참고: 에이전트의 단지 아주 작은 볼륨은 필수 (< 0.25 mL 각). 두 성분 사이 조기 반응을 방지 솔루션을 별도 유지 합니다. 반응 하 고 주사기 내 설정 에이전트를 발생할 것 이라고 두 개의 주사기의 교차 오염을 방지 하기 위해 제거 되었습니다 대로 뚜껑 같은 방식으로 대체 됩니다 있는지 확인 합니다. 이전에 사용,-20 ° c.에 솔루션 저장 첫 번째 수술에 대 한 필요한 경우 실내 온도에 실 란 트를 해 동. 실 란 트; refreeze 하지 마십시오 그것은 실내 온도에 있어야 하 고이 방식으로 저장할 수 있습니다. 그건 비용; 여러 수술에서 주사기를 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리가 오염을 방지 하기 위해 같은 유리병 1 주 이상 사용 하지 않는 것이 좋습니다. - 조각과 더 이상 1 m m 두꺼운 근육의 최고의 섬유 따라 보장 조직 패드에 사용할 sternocleidomastoid 근육의 얇은 복 부 슬라이스를 Dumont 아니 5 집게와가 위 욕실이 마이크로 근육 따라 무딘 해 부를 사용 합니다.
참고:로이 크게 기능 저하 됩니다 통해/전체 근육, 자르지 않는다. 조직은 CCA 절 개를 편안 하 게 커버 하기에 충분 해야 합니다. - Dumont #5 집게를 사용 하 여 조직 패드 고 직물을 혼합 때 균등 하 게 두 fibrinogen 및 트 롬 빈 두 약 사이 채널을 형성 하는 실 란 트 솔루션. 응고가 빨리; 발생 합니다. 최대한 빨리 응고 시작, CCA 절 개를 조직 패드를 제거 합니다. 매체 회사 압력 및 오픈 겸 평면 아래로 조직 패드를 놓습니다.
- 신속 하 게 원심 microvascular 클립 부드럽게 장소에 조직 패드를 들고 아직도 하는 동안 제거.
참고: 일부 역류를 혈액 더 활성화 fibrinogen 및 트 롬 빈 실 란 트 시 약의 수 있습니다. 그냥 충분 한 압력은 고정 패드를 완벽 하 게 선박을 차단 하지 않도록 필요. - 천천히 혈액 절 개 영역에서 흐름 수 있도록 조직 패드에서 압력을 완화. 자, 천천히 그리고 부드럽게 해제 인접 microvascular 클립에서 압력을 완전히 제거 합니다.
- 참고: 그릇은 완전히 특허 된다 있도록 조직 패드의 배치 및 microvascular 클립 제거 발생 합니다 신속 하 게 조직 패드는 CCA의 내부 밀봉 되지 않도록. 그러나, 적은 양의 혈액 누설이 있는 경우에, 다시 응고 형성 및 씰링 발생을 위한 시간을 추가 허용 조직 패드에 가벼운 압력을 놓습니다. 혈액 누설은 실질적인 또는 조직 패드 씰링 수 나타나지 않습니다, 경우 혈액 손실을 방지 하 여 절 개 분리 하 여 추가 혈액 손실을 방지 모두 CCA microvascular 클립 교체 압력을 유지 합니다.
- 신속 하 게 원심 microvascular 클립 부드럽게 장소에 조직 패드를 들고 아직도 하는 동안 제거.
- 조직 패드 선박 봉인 하지 않습니다, 경우 두 번째 시도 할 수 있다, 단계 3.3-3.7.3 다음.
- 일단 배는 봉인 분해할 수 있는 6-0 봉합을 사용 하 여 상처를 봉합. LDF 녹음 수술 내내 계속 되었다, 두개골에서 LDF를 제거 하 고 봉합 상처 분해할 수를 사용 하 여 6-0 봉합.
4. 수술 치료
- Prewarmed 복구 케이지 (온수 선반/매트 35 ° C에서 또는 열된 챔버 내에 위치한)에 동물을 놓습니다.
참고: 연구원은 다른 온도 현지 연습에 기간을 사용 하 여 싶을 수 있다. - 제공 모든 동물 prewarmed 0.9 %NaCl 염 분 사우스 4 h 후 작업, 그리고 2 x에서 즉시 후 작업의 200 µ L 매일 72 h에 대 한.
참고: prewarmed 0.9%의 NaCl는 동물 지도. 더 필요한 경우 더 많은 체액 좋은 복구를 보장 하기 위해 시행 수 있습니다. - 복구 장에 동물 무제한 액세스 젖은 다이어트 알 약, 건조 다이어트 알 약, 재 젤, 그리고 물에 대 한 광고 libitum 액세스 함께 젤 음식을 제공.
- 24 시간 후 작업에 캐롤라이나 carprofen 주입을 반복 (단계 2.3 참조).
참고: 모든 동물 받은 carprofen;의 동일한 복용량 어떤 신경 보호 효과 무시할 수 있을 것입니다. - 48 h에 대 한 정기적으로 진통 더 관리 결정을 돕기 위해 통증 수준을 평가 하기 위해17 득점 수술 마우스 얼굴을 찡 그리기를 수행 합니다.
- 수술과 절차에 따라 다음 매일 직전 동물 무게. 매일 관찰 및 완전 한 복지 시트 그들의 음식 및 물 섭취 량과 임상 증상을 모니터링을 수행 합니다.
- 24 시간 및 48 h 후 운영에 기능 관측을 수행. 초점 적자 규모에 마우스를 평가 합니다. 그들의 몸 대칭, 의무적으로 돌고, 걸음 걸이, 45 ° 그리드 등반, 행동, 앞 다리 비대칭, 그리고 수염 터치 응답18,,1920도 평가 합니다.
5. 자기 공명 영상 및 이미지 처리
- 구조 자기 공명 영상 (MRI)를 사용 하 여 병 변 볼륨 (LV)를 측정 합니다.
참고: 조직학 얼룩 triphenyltetrazolium 염화 (TTC)와 같은 대체 방법, 이전 사용 및 구조 MRI 데이터 연결. 그러나,이 방법만 연구 하 고 경도 하지 끝점에서 사용할 수 있습니다. 경도 MRI 스캔을 사용 하 여 연구에 필요한 동물의 수를 줄일 것입니다.- 48 h, 다음, MCAO의 유도 후 (5 %isoflurane 유도 대 한 O2 의 1 L/분), 유지 보수에 대 한 1.5-2% isoflurane isoflurane와 마우스 anesthetize.
- MRI 요람에 마우스를 전송 하 고 그것의 호흡 속도 모니터링 하기 위한 호흡 센서에 스캔 하는 동안 그것의 온도 모니터링 하기 위한 직장 온도 프로브를 이식. 장소 2 채널 마우스 뇌 RF 신호에 대 한 두뇌에 코일 및 장소 9.4 T 수평에 요람 구멍 스캐너 합니다.
참고: 여기, 72 m m 내부 직경을 가진 볼륨 코일은 RF 전송을 위해 사용 되었다. - 빠른 스핀-에코 시퀀스를 사용 하 여 t 2가 중 검사 취득. Mm 시야 (FOV)로 반복 시간 (TR) 3000 ms 및 40 양 사용 18 18 x 에코 시간 (TE)를 설정 하 고 조각 18 m m x 0.8 m m와 약 10 분에 3 개의 신호 평균 256 x 256 수집 행렬을 얻을.
- 확산 텐서 영상 (DTI) 빠른 스핀-에코 시퀀스를 사용 하 여 획득. 1,730 ms에 TR, 35 ms에 테, 20 m m x 20 m m, FOV를 설정 하 고 신호 평균 16 m m x 1 m m, 2, 14 확산 인코딩 방향, 그리고 최대 b의 조각과 128 x 128 인수 매트릭스를 얻을-1024 s/m m2의 값.
- T 2가 중 이미지는 이미지 디스플레이 사용 하 여 소프트웨어 패키지를 측정에 LV를 측정 합니다. 함께 (MRI 스캔 하는 동안 설정) MRI 슬라이스 두께 고려 하는 동안 총 병 변 볼륨을 계산 하는 값을 정렬할 lesioned 영역을 측정 합니다.
- 고려 모든 붓기와 지역 병 변 볼륨의 백분율 전체 contralateral 및 동측 반구를 측정 하는 동안. 모든 뇌 병 변의 볼륨을 측정 하는 간접 메서드를 사용 하는 부 종으로 인해 붓기에 대 한 올바른 설명 이전21,22. 피 질 조직 및 전 두 엽 또는 overcorrection 피하기 위해 표준 마우스 뇌 아틀라스에 따르면 소 뇌 조직을 포함 하는 조각을 포함.
- 병 변 확산 매개 변수를 측정 하 고 관심의 핵심 penumbra 지역.
- 적절 한 MRI 분석 소프트웨어를 사용 하 여 확산 텐서 이미지에서 명백한 확산 계수 (ADC) 및 분수 이방성 (FA) 지도 생성 합니다.
- 이미지의 선형 등록을 수행할 수 있는 적절 한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 t 2가 중 이미지와 DTI 이미지를 맞춥니다. 등록, 다음 보급 중 병 변 마스크를 (허 혈 성 코어) (허 혈 성 코어와 penumbra) penumbra 지역 추정 병 변 t 2가 중 마스크에서 뺍니다. 코어 및 penumbra 확산 매개 변수 척도를 ADC 및 FA 지도 결과 마스크 (코어 및 penumbra) 적용 됩니다.
- 비교 contralateral ADC 및 FA 값을 얻기 위해 동측 코어와 뇌 중간에 대해 penumbra 마스크를 번역 합니다.
Representative Results
총 24 성인 남성 C57BL/6 마우스, 수술의 때에 24-31 g 사이 무게의 연구에 사용 되었다. 한 동물 중간 대뇌 동맥 폐색 (MCAO)을 따라 죽 었 고 하나 수술 합병증으로 인해 제외 됐다. 여기에 제시 된 데이터는 저자에 의해 이전에 게시 작업에서 가져옵니다. 이러한 MCAO 결과11에 선박 수리의 효과 설명 하기 위해 사용 되었다. 모든 데이터는 thr 평균 ± 표준 편차로 표현 됩니다. 데이터는 다 봉 agostino 피어슨 다 수 정상 테스트를 사용 하 여 정상에 대 한 통계적으로 평가 됐다. 파라메트릭 데이터 학생의 t를 사용 하 여 비교 했다-(두 의미)에 대 한 테스트 및 일방통행 ANOVA Sidak 테스트 (여러 의미)와 함께. 비-파라미터 데이터는 맨-휘트니 U 테스트를 사용 하 여 비교 되었다. 파라메트릭 데이터의 변화는 F를 사용 하 여 평가 했다-테스트, 비 파라미터 데이터 변화 Levene의 테스트를 사용 하 여 평가 했다 그리고.
일반적으로, MCAO 절차, occluding 필 라 멘 트 삽입 되는 CCA는 ECA는 ICA 보다는 ECA에 통과에서이 필 라 멘이 트를 방지 하기 위해 출혈 및. ECA 결 찰의 회피와 진통의 감소 된 체중 감소 추세에서 보였다 MCAO-48 h 포스트, 반면 같은 MCAO 시간 없이 무 통으로 ECA 결 찰을 사용 하 여 같은 외과 의사에 의해 착수 하는 이전 연구에서 데이터에 비해 LV 영향을 받지 않는 등장, 그림 1을 참조 하십시오.
마우스는 60 분 MCAO 유발 허 혈을 reperfusion CCA 선박 수리 또는 CCA 접근의 전형적인 결 찰을 이어서 받았다. 합자 및 unligated 수리 CCA의 회로도 그림 2에 표시 됩니다.
레이저 도플러 flowmetry는 혈액 흐름 관류 영토에서 MCAO에 MCA의 CCA 선박 수리 전후 확인 하 사용 되었다. 그림 3 에서는 그 5 분 필 라 멘 트 제거, MCA의 두뇌 지역에서 크게 증가 하 여 지역 대뇌 혈 류 (rCBF)를 다음을 보여 줍니다. 관류 CCA 선박 수리, CCA 수리에 대 한 의존도에 비해 허 혈 성 영역을 증가 혈액 관류 허용 제안 다음 표시 MCA 영토를 관류의 증가와 선박 수리까지 유지 되었다 원의 윌리스 혼자입니다.
그리고 MRI T2가 중 전체 LV를 결정 하기 위해 사용 DTI 검사 핵심 라스베가스, MCAO는 후 48 h를 결정 하는 데 사용 했다. 그림 4A 수리 및 합자 프로시저 그룹 사이 총 또는 코어 LV에 큰 차이 보여줍니다. 그러나, 둘 다에 대 한 데이터 변화 총 및 평가 대 한 Lavene의 테스트를 사용 하 여 라스베가스, 코어 비패라메트릭 또는 F-파라미터 데이터에 대 한 테스트, CCA 수리 그룹 내에서 크게 감소 했다. 총 라스베가스 했다로 분해 외피와 subcortical 라스베가스, 그림 4B와 같이. 대뇌 피 질의 부분 하위 외피 부분의 병 변은 두 절차 그룹 사이 영향을 받는 반면 CCA 복구 그룹에 훨씬 적은 변수를 했다.
전력 분석 치료 그룹 당 적은 동물 MCAO CCA 수리 대 전형적인 CCA 출혈 절차를 사용 하 여 다음 LV 30% 감소 입증, 표 1을 참조 하는 데 필요한 될 것 이라고 지적 했다. 전원 1-β의 가정 = 0.8 및 의미 수준 α = 0.05와 예측 가상 제어 및 테스트 간의 LV 30% 감소의 그룹은 전력 분석을 위해 사용 되었다. 또한, 동일한 분산 그룹 사이 간주 되었다. 표 1 테스트에 필요한 동물의 수를 표시 하 고 컨트롤 그룹 중 전형적인 CCA 출혈 메서드를 사용 하는 경우 또는 업데이트 CCA 복구 방법, 여기에 설명 된 대로 사용 됩니다. 테스트 그룹 가상 치료 동물의 그룹과 컨트롤 그룹을 나타내는 참조 하기 가상 제어 그룹; 두 그룹 MCAO 받을 것 이다.
그림 1: 결합 된 무 통 치료 및 결과 MCAO 다음에 결 찰 ECA의 생략. (A) 사전 MCAO 무게의 백분율로 표시 된 체중 감소 MCAO 두 그룹에 대 한 다음 첫 번째 2 d. ECA unligated 그룹 (진통-MCAO에서 아무 ECA 결 찰으로 치료)는 MCAO 다음 두 번째 날에 감소 된 체중 감소 추세를 보였다. (B)이이 패널 표준 triphenyltetrazolium 염화 (TTC)는 MCAO 후 48 h 얼룩에 의해 측정 병 변 볼륨 (m m3)을 보여 줍니다. 표시 된 데이터는 평균 ± 표준 편차. ECA 출혈: n = 17, ECA unligated: n = 10. 이 그림 trotman의 루카스 외 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 표준 CCA 방법과 대체 CCA를 보여주는 회로도 복구 방법 MCAO 다음. (A)이이 도식 묘사 오른쪽 CCA의 영구 결 찰에 결과로 영구적으로 합자 CCA CCA 절 개의 양쪽에 적용 하는 비 분해할 수 있는 봉합을 사용 하 여. (B)이이 회로도 대체 CCA repair 메서드를 보여 줍니다. 작은 조직 패드 fibrinogen 코팅 하 고 트 롬 빈 실 란 트 오른쪽 CCA의 전체 관류 있도록 봉인 CCA 절 개를 커버 하는 데 사용 됩니다. 이 그림 trotman의 루카스 외 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 지역 대뇌 혈액 흐름 (rCBF) 매개 변수 MCAO 다음. rCBF 그룹에 대 한 두 CCA 출혈 및 CCA 수리 (게시물-MCAO)는 rCBF에 상대적인 MCAO 필 라 멘 트 제거 MCAO 동안 측정 후 5 분을 변경. 이 패널은 CCA 선박 수리 (사전 수리) 직전 및 CCA 수리 (수리 후)를 따라 5 분 rCBF 데이터를 보여줍니다. 상당한 증가 rCBF에서 두 그룹에 필 라 멘 트 제거 (게시물-MCAO) 후 5 분을 표시 됩니다. rCBF에서 추가 증가 CCA 복구 그룹에 CCA 수리 (수리 후)을 따라 표시 됩니다. rCBF에 차이가 5 분 포스트-MCAO 및 사전 복구 사이 표시 됩니다. 표시 된 데이터는 분석된 시간 코스 데이터 보고 키 시간 포인트, 평균 ± 표준 편차로 여기에서에서 집 광. CCA 출혈: n = 10, CCA 수리: n = 10; P < 0.01, * * *P < 0.001, ns: 비-중요 한. 이 그림 trotman의 루카스 외 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: MRI 기술에 의해 얻은 병 변 볼륨 분석. (A)이이 패널 MCAO, t 2가 중 MRI 이미지 (전체 LV)에서 가져온 총 LV 및 DTI 검사 및 분석 (코어 LV)에서 가져온 핵심 LV 48 h에 병 변 볼륨 (LV; m m3)을 보여줍니다. 대표 이미지 적용 DTI 코어 병 변 볼륨 마스크 T2 스캔 슬라이스 이미지에서 총 병 변 볼륨을 표시 합니다. 그룹 내의 다양성 모두 총 LV에 크게 감소 했다 (P = 0.015, CCA 수리: n = 10, CCA 출혈: n = 10, F-테스트)와 코어 LV (P = 0.043, CCA 수리: n = 9, CCA 출혈: n = 6, Lavene의 시험), F를 사용 하 여 평가-파라미터 데이터 또는 비-파라미터 데이터에 대 한 Levene의 테스트를 위해 테스트. (B)이이 패널에서 48 h MCAO, t 2가 중 MRI 이미지에서 촬영 하 고 외피와 subcortical 병 변 영역으로 나누어 다음 LV를 보여줍니다. CCA 복구 데이터 다양성 감소 (P = 0.03, F-테스트) 병 변, 하지만 데이터에 영향을 주지 않습니다의 대뇌 피 질 부분에 바꾸어 부분의 병 변에서 다양성을 표시 했다. CCA 수리: n = 10, CCA 출혈: n = 10. 표시 된 데이터는 평균 ± 표준 편차. # P < 0.05 (F-테스트), xP < 0.05 (Lavene의 시험). 이 그림 trotman의 루카스 외 에서 수정 되었습니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
접근 | 병 변 볼륨 (LV; m m3평균 ± 사 우 스 다코타) |
전원 | 의미 수준 | Anticiapted 차이 | 필요한 그룹 크기 |
CCA 출혈 (전통적인 방법) | 94.08 ± 53.79 | 0.8 | 0.05 | 30% | n = 58 |
CCA 수리 (새로운 방법) | 51.73 ± 22.78 | 0.8 | 0.05 | 30% | n = 35 |
표 1: 대표적인 전력 분석 비교는 대안 전통적인 CCA 결 찰 CCA 복구 방법은 여기에 설명 했다. 이 표에서 컨트롤 그룹, 전통적인 또는 대체 (새로운) 접근, 그리고 테스트 그룹 (예측) 사이의 LV에 큰 차이 감지 하는 데 필요한 예상된 그룹 크기를 계산 하기 위해 실시 하는 전력 분석을 보여 줍니다. 그룹으로 크기 표에서 필요한 0.8의 힘은 가정, 0.05의 의미 수준 적용 되 고 라스베가스에 비해 예측된 테스트 그룹에 30% 차이 보여줍니다 하는 경우 제어 그룹. 표 (CCA 출혈 및 CCA 수리)는 라스베가스에 30% 차이 얻을 하는 데 필요한 동물의 수에 차이 확인 하기 위해 두 MCAO 접근에 대 한 결과 두 방법에 대 한 동등한 차이 테스트 및 제어 그룹 사이 간주 됩니다. 이 그림 trotman의 루카스 외 에서 수정 되었습니다. 11.
Discussion
설치류에 과도 MCAO의 필 라 멘 트 유도 가장 자주 사용 되는 실험적인 뇌졸중 모델 reperfusion 임상 뇌경색7다음 이벤트의 발생을 흉내 낸, 영향을 받는 영역에 있습니다. 여기에서 보고 된 쥐에 있는 필 라 멘 트 유도 과도 MCAO의 전통적인 방법에 다른 외과 접근 방법이 이다. 무 통 치료, ECA 결 찰 회피, 그리고 CCA 절 개 수리, 관련 된 다른 접근 감소 LV 가변성 MRI 및 조직학 얼룩 방법11를 사용 하 여 평가 하는 경우에 발생 합니다.
크게 MCAO를 유도 하는 기존의 방법과 transection, 또는 의존을 보여줘 왔다, 쥐, 음주 행동과 MCAO14다음 몸 체중 증가 영향을 미칠 ECA의 적어도 결 찰. 여기, ECA 결 찰 및 진통 또한, 회피와 쥐에서 정의 된 프로토콜 다음 병 변 볼륨에 아무런 영향 MCAO 몸 체중 감소에 있는 감소를 제안 했다. 진통의 사용은, 또는 적어도 하지 보고, 대부분의 실험적인 뇌졸중 연구, 실험 결과에 가능한 혼동 효력 때문에. 그러나, 무 통을 완전히 피하는 항상 정당화 되지 그리고 과학적인 목표의 공적을 가진 동물의 복지 요구를 균형을 필요.
동물 크기 차이, 스트레인, 뇌혈관 해부학, 필 라 멘 트 크기와 형식 유사 이외에 모든 스트로크 결과23,24에 영향을 제안 했다. 여기에 설명 된 대체 접근 reperfusion, 따라서 감소, 적어도 부분에서 병 변 볼륨에서 동물 사이 본 변화 하는 동안 암소에 대 한 의존도 방지 합니다. 암소 해부학은 쥐, 높게 가변 특히는 C57BL /6 변형 실험 뇌졸중 연구에서 자주 사용 되는. C57BL/6 마우스의 90%는 다양 한 사후 통신 동맥 (PcomA) patency, MCA 영토13, 의 외부 구조의 부족 한 관류로 인 한 허 혈 성 손상의 볼륨에 영향을 미칠 수 있습니다 인해 불완전 한 암소는 25. 그림과 같이 마우스에 CCA를 복구, 혈액의 재건 립에 결과 통해 앞에서 설명한 쥐15에 허 혈 성 지역에 CCA 흐름. 대표적인 데이터 없지만 CCA에 혈액의 흐름은 직접 측정 하지는 CCA의 수리 reperfusion, 증가 보여 줍니다. 그러나, 인접 및 복구 위치에 원심 트렁크, 따라 pulsing 및 전체 상태에 반환으로 선박 수리 다음 혈액으로 CCA reperfuse를 시각화 하는 외과 의사에 대 한 가능 하다. 이 시각적 확인, 허 혈 성 영역의 레이저 도플러 flowmetry 읽기 함께 그릇의 성공적인 복구를 확인 하 사용할 수 있습니다. 조직 패드 응용 프로그램과 CCA에서 선박 클립의 제거 사이의 시간 조직 패드 응용 프로그램 사이의 시간을 줄이는 CCA의 결과 patency에 영향을 미칠 수 있습니다 하 고 클립 제거를 o 준수에서 조직 패드를 막을 것 이다 CCA의 pposite 쪽입니다. 비록 기술적으로 도전적인, 여기 설명 대체 MCAO 절차 보다 쥐에서 MCAO 수술 유도 하는 데 필요한 모든 추가 능력을 필요 하지 않습니다.
전통적으로 결과 측정에 높은 가변성을 연관, 실험적인 뇌졸중 연구 underpowered 될 하는 경향이 있을 수 있습니다. 경제적이 고 실용적인 우려와 함께에서 윤리 및 복지 요구 되 underpowered 연구에 기여할 수 있습니다. 결과 있는 가변성을 감소 하 고, 따라서, 실험적인 그룹에서 더 일관 된 병 변의 결과 생산, 적절 하 게 구동 되 고 연구의 궁극적인 목표와 더불어 더 효과적인 전력 계산을 수행할 수 있습니다.
결론적으로,이 대체 CCA 수리 절차, 쥐, 병 변 볼륨 실험 선 다음에 더 적은 가변성에 결과 및 가능 하 게 작은 실험 그룹을 적절 한 때 치료 효과 테스트 해야 전원 계산 사용 됩니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 교체, 구체화 및 연구 (NC3Rs; 동물의 감소를 위한 국가 센터에 의해 투자 되었다 CG에 NC/M000117/1). 저자는 그녀의 통계 조언에 대 한 실험 동물 및 마리아 Viskaduraki의 그들의 관리에 대 한 사단의 생물 의학 서비스, Leicester의 대학의 직원을 감사합니다. 대표 결과 질병 모델 & 메커니즘11허가 적응.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.7 mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight - use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2 mL |
Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel - manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx - rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
sterile Petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50 mm sterile Petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50 mm diameter is required. |
Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |
References
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