Summary
Her præsenterer vi en protokol for at anslå den respiratoriske og Fermentativ metabolisme ved at montere den eksponentielle vækst af Saccharomyces cerevisiae eksponentiel vækst ligningen. Beregning af de kinetiske parametre giver mulighed for screening af påvirkninger af stoffer/forbindelser på gæring eller mitokondrie respiration.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae celler i den eksponentielle fase opretholde deres vækst ved at producere ATP gennem gæring og/eller mitokondrie respiration. Gæringsdygtigt CO2 koncentration regulerer hovedsagelig, hvordan gærcellen generere ATP; således, variation i fermenterbare kulhydrater niveauer drev S. cerevisiaeenergiske metabolisme. Dette papir beskriver en høj overførselshastighed metode baseret på eksponentiel gær vækst til at vurdere virkningerne af koncentration og arten af kulstof kilde på luftvejene og Fermentativ stofskifte. Vækst af S. cerevisiae er målt i en mikrotiterplade eller rystet konisk kolbe ved at bestemme det optisk densitet (OD) på 600 nm. Derefter, en vækstkurven er bygget af plotting OD versus tid, hvilket giver mulighed for identifikation og udvælgelse af den eksponentielle fase, og er udstyret med eksponentiel vækst ligning at opnå kinetiske parametre. Lav-specifik tilvækst med højere fordobling gange generelt repræsenterer en respiratorisk vækst. Omvendt, højere-specifik tilvækst med lavere fordobling gange angive Fermentativ vækst. Tærskelværdier for fordobling tid og specifikke vækstrate estimeres ved hjælp af velkendte respiratorisk eller Fermentativ betingelser, såsom ikke-fermenterbare carbon kilder eller højere koncentrationer af Gæringsdygtigt sukker. Dette er opnået for hver specifikke stamme. Endelig, de beregnede kinetiske parametre er sammenlignet med tærskelværdier at etablere om gæren viser Fermentativ og/eller respiratorisk vækst. Fordelen ved denne metode er dens relative enkelhed for forstå virkningerne af et stof/sammensat på Fermentativ eller respiratoriske stofskifte. Det er vigtigt at fremhæve, at vækst er en indviklede og komplekse biologiske proces; Derfor, foreløbige data fra denne metode skal være bekræftet af kvantificeringen af iltforbrug og ophobning af gæring biprodukter. Derved kan denne teknik bruges som en indledende screening af forbindelser/stoffer, der kan forstyrre eller forbedrer Fermentativ eller respiratoriske stofskifte.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae vækst har fungeret som et værdifuldt redskab til at identificere snesevis af fysiologiske og molekylære mekanismer. Vækst måles primært af tre metoder: serielle fortyndinger for spot test, kolonidannende enhed optælling og vækstkurver. Disse teknikker kan bruges alene eller i kombination med en bred vifte af substrater, miljøforhold, mutanter og kemikalier til at undersøge konkrete svar eller fænotyper.
Mitokondrie respiration er en biologisk proces, hvor vækst kinetik har været anvendt med succes til at opdage ukendte mekanismer. I dette tilfælde tilskud af vækst medier med ikke-fermenterbare carbon kilder såsom glycerol, laktat eller ethanol (som er udelukkende metaboliseres af mitokondrie respiration), som den eneste CO2 og energi kilde giver mulighed for at vurdere de respiratorisk vækst, hvilket er vigtigt at opdage perturbationer i oxidativ fosforylering aktivitet1. På den anden side er det kompliceret at bruge vækst kinetiske modeller som en metode til at decifrere mekanismerne bag gæring.
Undersøgelse af gæring og mitokondriel respiration er afgørende for at belyse de molekylære mekanismer bag bestemte fænotyper som Crabtree og Warburg virkninger2,3. Crabtree effekt er karakteriseret ved en stigning af glykolytiske flux, undertrykkelse af mitokondrie respiration, og etablering af gæring som den primære vej til at generere ATP i overværelse af høje koncentrationer af fermenterbare kulhydrater (> 0,8 mM)4,5. Warburg effekt er metabolisk analog til Crabtree effekt, med forskellen er, at i pattedyrceller, den vigtigste produkt af gæring er laktat6. Faktisk er Warburg effekt udstillet af en bred vifte af kræftceller, udløser glukoseoptagelse og forbrug selv i nærværelse af ilt7. Derved, har at studere det molekylære grundlag af skiftet fra respiration til gæring i Crabtree effekt både bioteknologiske følger (for ethanolproduktion) og potentielle virkninger i kræftforskning.
S. cerevisiae vækst kan være et velegnet redskab til at studere effekterne Crabtree og Warburg. Denne idé er at i gær eksponentiel fase, den centrale veje bruges til at producere ATP er mitokondrie respiration og gæring, som er afgørende for at opretholde væksten. For eksempel, er vækst af S. cerevisiae tæt relateret til funktionen af ATP-genererende veje. I S. cerevisiae, mitokondrie respiration producerer ca 18 ATP molekyler per glukosemolekyle, mens gæring kun genererer 2 ATP molekyler, forventes derfor det, at væksten har snævre forbindelse med de metaboliske omsætningsveje producerer ATP8. I denne henseende, når gæringen er den vigtigste vej til at generere ATP, kompenserer gæren for den lave ATP produktion ved at øge satsen for glukoseoptagelse. Tværtimod er glukose forbrug af gærceller, som bruger mitokondrie respiration som ATP hovedkilden lav. Dette indikerer, at det er vigtigt for gær til forstand kulhydrat tilgængelighed før det besluttes, hvordan ATP skal genereres. Derfor, glucose tilgængelighed spiller en vigtig rolle i kontakten mellem gæring og mitokondriel respiration i S. cerevisiae. Ved tilstedeværelse af store mængder af glukose foretrækker gær gæring som den centrale rute til at generere ATP. Interessant, når gæren gæring, bevares den specifikke vækstrate på dens maksimale. På den anden side under lave niveauer af glukose producerer S. cerevisiae ATP ved hjælp af mitokondrie respiration, opretholde lavere vækstrater. Dermed, variation i koncentrationen af glukose og brugen af andre kulstof kilder fremkalde ændringer i gærs præference mellem Fermentativ og respiratoriske vækst. Under hensyntagen til dette forhold med eksponentiel vækst ligning, kan man opnå den biologiske betydning af kinetiske parametre såsom fordobling tid (Dt) og specifikke vækstrate (µ). For eksempel, blev lavere μ værdier fundet når gæren bruger mitokondrie respiration som den primære vej. Tværtimod, under forhold, der favoriserer gæring, blev højere µ værdier fundet. Denne metode kan bruges til at måle de sandsynlige mekanismer af nogen kemikalier, der påvirker gæring og mitokondriel respiration i S. cerevisiae.
Formålet med dette papir er at foreslå en metode baseret på vækst kinetik for screening virkninger af et givet stof/sammensat på mitokondrie respiration eller gæring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dyrkningsmedier og inokulum forberedelse
- Forberede 100 mL 2% gær extract-pepton-dextrose (YPD) flydende medium (tilføje 1 g gær extract, 2 g af kasein pepton, og 2 g af glukose til 100 mL med destilleret vand). Dispensere 3 mL af medierne i 15 mL steriliserbar koniske rør. Autoklave medier i 15 min ved 121 ° C og 1,5 psi.
Bemærk: Medierne kan opbevares i op til en måned på 4-8 ° C. - Podes en koniske rør fyldt med 3 mL af cool sterile 2% YPD bouillon med 250 μL af S. cerevisiae celler bevares i glycerol ved-20 ° C. Der inkuberes natten over i en orbitalryster ved 30 ° C med agitation på 200 rpm.
- Streak en petriskål (60 x 15 mm2) fyldt med steril 2% YPD agar (tilføje 10 g gær extract, 20 g af kasein pepton, 20 g af glukose, og 20 g af bakteriologiske agar til 1.000 mL destilleret vand) med celler dyrket i den koniske rør ved hjælp af en steril løkke. Inkuber petriskål ved 30 ° C, indtil de isolerede kolonier Vis vækst.
- Forberede pre-inokulat ved at vaccinere en enkelt isoleret koloni i en konisk rør fyldt med 10 mL af cool sterile 2% YPD bouillon og inkuberes det natten over ved 30 ° C med kontinuerlig agitation på 200 rpm.
2. dyrkningsmedier og vækstkurver i mikrotiterplade
- Forberede 10 mL 1% YPD bouillon (tilføje 0,1 g gær extract, 0,2 g af pepton, og 0,1 g glukose 10 ml destilleret vand), 10 mL 2% YPD bouillon (tilføje 0,1 g gær extract, 0,2 g af pepton, og 0,2 g glukose 10 ml destilleret vand) , og 10 mL 10% YPD bouillon (tilføje 0,1 g gær extract, 0,2 g af pepton, og 1 g glukose 10 ml destilleret vand). Autoklave disse wspomagaczy for 15 min ved 121 ° C og 1,5 psi.
Bemærk: Kultur medier tjener som en kontrol af Fermentativ vækst. - Forberede 10 mL 2% gær extract-pepton-ethanol (SKR) bouillon og 10 mL 2% gær extract-pepton-glycerol (YPG) bouillon. 2% SKR: tilføje 0,1 g gær extract, 0,2 g af pepton, og 0,2 mL ethanol til 10 mL destilleret vand. 2% YPG: tilføje 0,1 g gær extract, 0,2 g af pepton, og 0,2 mL glycerol 10 ml destilleret vand. Autoklave disse wspomagaczy for 15 min ved 121 ° C og 1,5 psi.
Bemærk: Glycerol og ethanol er ikke-fermenterbare carbon kilder, der er udelukkende metaboliseres af mitokondrie respiration. Af denne grund bruges de som en respiratorisk vækst kontrolelementer. I dette trin, kan type og koncentration af CO2 kilde i kultur medier ændres for at afprøve virkningerne på vækst fænotype ved hjælp af gær extract-pepton (YP) bouillon (10 g af gærekstrakt og 20 g af kasein pepton i 1.000 mL destilleret vand) som base. For at teste effekten af andre næringsstoffer ud over CO2, er syntetiske komplet (SC) medium suppleret efter formålet med forsøget. Base for SC medium er 1,8 g gær nitrogen base uden aminosyrer, 5 g ammoniumsulfat [(NH4)2SO4], 1.4 g mononatrium fosfat (NaH2PO4), og 2 g af drop-out blandes i 1.000 mL destilleret vand. Supplement til medierne med en carbon kilde og ekstra kvælstof kilde i de nødvendige koncentrationer. - Tilføje 145 μL af passende dyrkningsmedier til den eksperimentelle design til hver brønd med en steril mikrotiterplade (10 x 10-well) med låg og podes dem med 5 μl af den pre inokulum.
Bemærk: Hvis målet er at screene påvirkning af stoffer/forbindelser energiske metabolismen af gær, at stof/stof bør tilføjes under dette trin. Også, enhver form for mikrotiterplade med låg bør være nyttige. - Inkuber multi godt pladen på en mikrotiterplade læser ved 30 ° C, med konstant uro på 200 rpm for 48 h. foranstaltning det optisk densitet (OD) på 600 nm hver 30-60 min.
Bemærk: Hvis mikrotiterplade læseren ikke har mulighed for at udruge mikrotiterplade, kan det være inkuberes i en orbitalryster på de samme betingelser mellem hver måling af OD.
3. vækstkurver i rystet koniske kolber
- Tilføje 4,8 mL af den passende dyrkningsmedier til 20 mL koniske kolber og autoklave. Podes hver kolbe med 200 μl af den pre inokulum kultur på OD600nm ~ 2 i cool, sterile 2% YPD bouillon. Inkuber dem ved 30 ° C med konstant uro på 250 rpm i 24 timer.
Bemærk: Hvis Inkubationstiden er højere end 24 h, tilføje 12 mL af den passende dyrkningsmedier til 50 mL koniske kolber og autoklave. Podes dem med 500 μl af den pre inokulum. Det er også vigtigt at overveje Fermentativ vækst kontrolelementer (YP medier med 1%, 2% eller 10% glukose) og respiratoriske vækst kontrolelementer (YP medier med 2% glycerol eller ethanol). - Tage 100 μL af rystet konisk kolbe kultur og fortynde det i 900 μl af destilleret vand i en 1 mL Spektrofotometer kuvette, og forsigtigt mix af pipettering. Måle OD på 600 nm ved hjælp af et spektrofotometer hver 2 h. For at opnå den rigtige OD, multipliceres resultatet med ti.
4. databehandling og kinetiske parametre beregning
-
Opret en ny projektfil i statistisk pakke software. I afsnittet "ny tabelog graf", skal du vælge indstillingen "XY" .
- Vælg indstillingen: "Start med en tom datatabel" i afsnittet "Sample data" .
- Vælg diagramtype "Point og forbinder linje" . Forlade afsnittet "X" fravalgt i segmentet for "Subcolumns for replikater eller fejlværdier", og "Y" sektionen Vælg indstillingen: "Indtast (10) Repliker værdier i side om side subcolumns og plot middelværdi og fejl SD". Klik på knappen Opret.
Bemærk: Tabellen format har én X kolonne og flere Y kolonner, hver med 10 subcolumns valgt tidligere.
- Skriv den gang på som OD målinger blev taget i kolonnen X (f.eks., 0, 30, 60, 90 min eller 0, 1, 1,5, 2 h). I kolonnerne Y skrive OD-værdierne fra kulturerne.
- Identificere den eksponentielle vækstfase omdanne Y kolonnedata til logaritmer. Klik på knappen "Analyze" , Vælg "Omdanne" analyse, Vælg Y værdier ved hjælp af Y = Log(Y). Gå til "Galleri af resultater", Vælg "Omdanne" datatabellen, skal du klikke på knappen "Analyze" , og vælge "lineær regressionsanalysen". Udelukke de OD-værdier, der ikke følger en lineær opførsel. For at udelukke værdier, skal du markere dem i datatabellen og skrive "Ctrl + E".
Bemærk: Det er vigtigt at udelukke værdier, der ikke følger den eksponentielle fase, da den eksponentielle vækst ligning passer godt med den eksponentielle fase. - Vælg datatabellen i "Datatabeller Galleri", "Data 1". Klik på knappen "Analyze" og vælg "Ikke-lineær (curve fit)" regressionsanalyse blandt "XY analyser".
- Vælg datasæt til at analysere og klik på knappen "OK" . I fanen "Fit" Vælg afsnittet "Eksponentiel ligning" og vælg "eksponentiel vækst ligning" (, hvor X er celle koncentration, X0 er celle koncentration på nul tid, μ specifikke vækstrate, og t er tid). Bruge den "mindste kvadraters fit" som en passende metode og forlade umarkerede afsnittet interpolate. Klik på knappen "OK" .
Bemærk: Fanen med de ikke-lineære fit resultater er i "Galleri af resultater". Softwaren beregner fordobling tid (Dt) og specifikke vækstrate (μ). Softwaren viser μ som K i fanen resultater. - Åbner en ny projektfil, og vælg hvilken kolonne i afsnittet "nye tabel og figur" . Vælg indstillingen "Start med en tom datatabel" og vælg den ønskede figur. Vælge at plotte betyder med SD. Vælg knappen "Opret" .
- Kopiere μ eller Dt værdier fra fanen nonlinear fit resultater, der er i "Galleri af resultater" og indsætte dem i en kolonne. Endelig skal du vælge knappen "Analyze" og vælg den ønskede analyse i afsnittet "Kolonne analyser" til at sammenligne de kinetiske parametre for de forskellige nutrimental forhold.
Bemærk: De kinetiske parametre fremstillet af kontrolelementerne Fermentativ vækst (YP medier med 1%, 2% eller 10% glukose) og respiratoriske vækst kontrolelementer (YP medier med 2% glycerol eller ethanol) hjælper med at etablere tærsklen på Fermentativ og mitokondriel respiration, henholdsvis. Sammenligne den kinetiske parametre fra ernæringsmæssige tilstand og stof/sammensatte analyseres med det respiratoriske og Fermentativ vækst hjælpe med at identificere mulige virkning på luftveje eller Fermentativ stofskifte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vækstkurver kan bruges til foreløbigt forskelsbehandle respiratorisk og Fermentativ fænotyper i S. cerevisiae gær. Derfor, vi udføres batch kulturer af S. cerevisiae (BY4742) med forskellige glucose koncentrationer, der er blevet rapporteret til at fremkalde Fermentativ vækst: 1%, 2% og 10% (w/v)9. Kulturer viser et Fermentativ fænotype har en lille forsinkelse og en eksponentiel fase med en høj vækstrate (figur 1). Ethanol, glycerol og laktat er kulstof kilder, der kan blive metaboliseret kun gennem respiration; dermed, vi udførte kulturer af gær ved hjælp af disse CO2-kilder. Kulturer, som får energi primært ved oxidativ fosforylering viste en længere mellemliggende fase og langsom vækst i den eksponentielle fase (figur 2).
Analyse af vækstkurver giver kun kvalitative oplysninger; Derfor er det vigtigt at beregne de kinetiske parametre for at få kvantitative oplysninger. Vi beregnet Dt og μ med eksponentiel vækst ligning (figur 3). Vi fastsætte en tærskel for respiratorisk vækst værdier på Dt ≥11.5 h og μ ≤0.059 / h. Tærsklen for Fermentativ vækst blev sat på Dt ≤6.5 h og μ ≥0.149 / h (figur 3).
For at bevise nytten af denne screeningsværktøj vi har udviklet tre forsøg, med først til at vurdere virkningerne af forskellige resveratrol (RSV) koncentrationer på S. cerevisiae BY4742 celler med forskellige energiske status (figur 4) i rystet kolber. Det andet eksperiment har til formål at påvise virkningerne af forskellige ammonium sulfat (NH4+) koncentrationer på energimetabolisme af S. cerevisiae BY4742 (figur 5) i en mikrotiterplade. Endelig, tredje havde til formål at illustrere, hvordan ændringer i carbon kilde påvirker Fermentativ vækst i to forskellige S. cerevisiae stammer (W303 og industriel WLP530 anvendes til øl gæring) (figur 6). I forsøget bruger RSV, blev celle energiske status ændret ved varierende glukose koncentration. På 10% glukose, alle RSV koncentrationer testet ikke ændre den respiro-Fermentativ fase af gær men formindske den respiratoriske fase (under diauxic Skift, S. cerevisiae metaboliseres ethanol produceret under den eksponentielle fase af oxidativ fosforylering). Μ værdier bekræftet at S. cerevisiae under alle forhold afprøvet, viste Fermentativ adfærd, i modsætning til sin fænotype, når de dyrkes i 2% glycerol (tilstand bruges som en respiratorisk kontrol) (figur 4a). Når cellerne blev Energitilfoerslen med 1% glukose kun, bekræftet μ værdier, at 0.1, 1, 10 og 100 µM RSV, Fermentativ adfærd i den respiro-Fermentativ fase ikke var påvirket. Dog blev et fald i de respiratoriske fase under diauxic Skift observeret. Desuden, i en koncentration på 1.000 µM, RSV helt hæmmede cellevækst.
I det andet forsøg, celler blev suppleret med 10% glukose, en koncentration, der anses for tilstrækkelig til at fremkalde Crabtree effekt i S. cerevisiae. Derfor kunne vi iagttage virkningen fremmes af tilskud af forskellige koncentrationer af NH4+ i Fermentativ stofskifte. Dt værdier foreslog at 0,13, 0.66 og 1,99% NH4+ favør Fermentativ stofskifte, og det kan iagttages i vækstkurver at disse koncentrationer udvidet den kultur eksponentiel fase. Ikke desto mindre på 3,31% mM NH4+viste en tilvækst i Dt værdien, at denne koncentration fremkalder en respiro-Fermentativ stofskifte. Denne fænotype viste en udvidet lag fase i vækstkurver og langsommere vækst i den eksponentielle fase (figur 5).
I det tredje forsøg, celler af to forskellige S. cerevisiae stammer (W303 og WLP530) blev dyrket i forskellige koncentrationer af saccharose eller galactose at teste, hvis virkningerne af CO2-kilden på Dt -værdier blev stamme-afhængige. Som et Fermentativ kontrol, begge stammer blev dyrket i 2% glucose og Dt -værdier blev beregnet til at fastsætte en tærskel for Fermentativ vækst. Den Fermentativ Dt -værdier for stammer var forskellige, med ≤3.25 h W303 stamme og ≤6.84 h til WLP530 stamme. Det er derfor vigtigt at fremhæve nødvendigheden af, at validere Dt tærsklen for de forskellige stammer anvendes. Desuden, når saccharose blev brugt som carbon kilde, et Fermentativ fænotype blev observeret på 2% og 10% i begge stammer. Men når galactose blev brugt, stamme W303 ikke vise Fermentativ adfærd i nogen af de koncentrationer, der er testet, mens WLP530 stammen viste et Fermentativ fænotype på 2% galactose. Interessant nok, voksede W303 stammen i alle koncentrationer af både carbon energikilder testet. WLP530 stammen viste dog ikke vækst i den laveste koncentration af CO2 bruges (0,01%). Dette kan skyldes, at WLP530 bruges i øl industri og kulstof koncentrationer, det udsættes er generelt meget højere (figur 6).
Alt bevise data fra disse tre forsøg at vækstkurver og kinetiske parametre er nyttige for den foreløbige forskelsbehandling mellem respiratorisk og Fermentativ vækst i S. cerevisiae. Det er også vigtigt at fremhæve, at dette er et alsidigt værktøj, der kan bruges i forskellige aspekter af energi metabolisme forskning.
Figur 1: Effekt af forskellige glucose koncentrationer på S. cerevisiae vækst fænotype. Vækstkurver blev bygget ved måling af ekstinktionen på 600 nm hvert 30 min for 48 h. Da S. cerevisiae celler gære, kulturer viste en kort forsinkelse fase og hurtig vækstrate i den eksponentielle fase. Respiro-Fermentativ fase kunne følges af en deceleration vækstfase (respiratoriske fase), hvor ethanol fremstillet ved gæring metaboliseres ved hjælp af oxidativ fosforylering pathway, så den stationære fase er nået. Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Effekt af respirabelt carbon kilder på S. cerevisiae vækst fænotype. Vækstkurver blev bygget ved måling af ekstinktionen på 600 nm hvert 30 min for 48 h. celler af S. cerevisiae viste en langvarig lag fase og langsom vækstrate i den eksponentielle fase og generelt ikke viser et diauxic Skift. Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Effekt af kulstof kilde og dets koncentration på S. cerevisiae kinetiske parametre. (en) Dt værdier af S. cerevisiae BY4742 vækst under forskellige kulstof kilder; (b) μ værdier af S. cerevisiae BY4742 vækst under forskellige kulstof kilder i forskellige koncentrationer. Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en en-vejs ANOVA, efterfulgt af en Dunnett test (*p < 0,01 vs 2% glukose). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: effekt af resveratrol tilskud på forskellige celle energi statusser. (en) vækst fænotype og μ værdier ved hjælp af 10% glukose; (b) vækst fænotype og μ værdier ved hjælp af 1% glukose. Data fra vækstkurver præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse og μ værdier er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistiske analyser for μ værdier blev udført ved hjælp af en en-vejs ANOVA, efterfulgt af en Dunnett test [*p < 0,01 vs. respiratorisk kontrol med 2% glycerol (RC)]. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Effekten af ammonium sulfat kosttilskud på S. cerevisiae energimetabolisme. Vækstkurver blev bygget ved måling af ekstinktionen på 600 nm hvert 30 min for 48 h. præsenteres Data fra vækstkurver som gennemsnit ± standardafvigelse og μ værdier er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistiske analyser for Dt -værdier blev udført ved hjælp af en en-vejs ANOVA, efterfulgt af en Dunnett test [* p < 0,01 vs. respiratorisk kontrol med 2% glycerol (RC)]. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: effekten af galaktose og saccharose koncentration i Fermentativ metabolismen af Saccharomyces cerevisiae. (en) Dt -værdier for de W303 lab stamme og (b) Dt værdier for WLP530 industrielle stamme. Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistiske analyser for Dt -værdier blev udført ved hjælp af en en-vejs ANOVA, efterfulgt af en Dunnett test [* p < 0,01 vs 2% glukose (Fermentativ kontrol)]. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Har gået lang tid, da J. Monod10 gav udtryk for, at undersøgelsen af vækst af bakterielle kulturer er den grundlæggende metode til mikrobiologi. Fremkomsten af de molekylære værktøjer forsinkelser skik og undersøgelse af vækst som en teknik. På trods af kompleksiteten af vækst, som involverer mange indbyrdes forbundne processer, kan dens underliggende mekanismer beskrives ved hjælp af matematiske modeller11. Dette er en robust tilgang, der kan bruges som et supplerende værktøj til at belyse de mest indviklede molekylære mekanismer12.
For at få pålidelige resultater fra denne metode, er det vigtigt at overveje følgende kritiske trin. Agitation ved 250 omdrejninger i minuttet er afgørende for at opnå god vækst i kulstoffattige kilder, der udøver respiratorisk vækst, eftersom ved brug af lavere agitation hastigheder (150-180 rpm) vi observeret nedsat vækst i luftvejssygdomme. Det er vigtigt at indlede protokollen beskæftiger en frisk bestand, og det er også vigtigt at bevare en ensartet fænotype i assays. Vækst kinetik tærskelværdierne varierer mellem stammer og skal valideres efter tilstand til at blive brugt i assays. GraphPad prisme software foreslås fordi eksponentiel vækst ligning er allerede indlæst; men nogen andre software er egnet, forudsat det giver mulighed for programmering af den eksponentielle vækst ligning. I mikrotiterplade, anbefales det at medtage tre brønde med 150 μl af vækst medier uden inokulum – dette er et kontrolelement, der angiver, hvis mikrotiterplade wells har været udsat for forurening.
Det er vigtigt at angive, at afbilde OD data på en lineær skala kan gøre det svært at afgøre den logaritmiske vækstfase. Dette problem kan overvindes ved at afbilde OD data i en log-skala, så halter og logaritmiske vækstfase er klart synlige.
Denne protokol bruges kun til at screene en fænotype, så de specifikke effekter på gæring og mitokondriel respiration skal bekræftes. Vi anbefaler kvantificering af mitokondrie respiration af ilt forbrug assays13,14, mens gæring kan bestemmes ved ophobning af biprodukter såsom acetat, succinat, glycerol og ethanol9 .
S. cerevisiae vækst har fungeret som et middel til forståelse af molekylære mekanismer og fænotyper, med metoder fra screening til test-undersøgelser,. Ikke desto mindre talrige eksperimentelle design i litteraturen bruge gær vækst kun som en kvalitativ parameter (f.eks. plade fortyndinger eller vækstkurver), så beskæftigelsen af disse teknikker forsømmer værdifulde beviser. For eksempel, er den ilt til rådighed i agar plader anvendes til optælling mikrobielle population eller ved at foretage seriel-fortyndinger begrænset, komplicerende vækst måling respiratory betingelser. Desuden, når to eller flere celler forbliver knyttet til hinanden, kun én koloni er observeret. En anden begrænsning er brugen af vækstkurver som en visuel resultat at fremhæve forskelle i vækst, som kan se bort fra fakta om subtile forskelle. Derfor tillader oversættelsen af vækst oplysninger til kvantitative parametre opnåelsen af præcise data om den udøves fænotype. Ikke desto mindre, den matematiske repræsentation af vækst er en kompliceret videnskabelige virksomhed. De fleste undersøgelser undersøge fuld vækst (lag, log og stationære faser) af de mikroorganismer, at opnå høje flerleddede ligninger, der kun tjener en miljømæssig stand. Trods den relative enkelhed ved beregning af koefficienter af disse ligninger af lineær regression, er det svært at tildele dem til en iboende biologiske betydning15. Analyse af vækst ved at adskille vækst faser er matematisk pålidelige og ligetil. Et eksempel herpå er den ligning, eksponentiel vækst, som er baseret på første-ordens kinetik og passer godt med en kort forsinkelse og eksponentiel fase.
Endelig er studerer den log fase med eksponentiel vækst ligning en konsekvent metode til at forstå mitokondrie respiration eller gæring indflydelse på et bestemt stof eller miljø. Som en proof of concept demonstreret kvantificering af væksten i den eksponentielle fase at RSV specifikt påvirker luftvejene vækst13,14. Her serveres vækst som et værdifuldt redskab til at identificere at RIM15 sletning sandsynligt forbedrer Fermentativ metabolisme af delvis hæmning af respiration kapacitet i S. cerevisiae9. Disse data underbygger at observere vækst giver mulighed for undersøgelse af Fermentativ og respiratoriske stofskifte og er en simpel og pålidelig metode. Derfor denne tilgang giver mulighed for screening virkningerne af et bestemt stof på mitokondrie respiration eller gæring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af tilskud af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (grant nummer 293940) og Fundación TELMEX-TELCEL (grant nummer 162005585), begge til IKOM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction? Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
