Summary
Hier presenteren we een protocol voor het inschatten van de Ademhalings- en fermenterende metabolisme door het aanbrengen van de exponentiële groei van Saccharomyces cerevisiae voor de vergelijking van exponentiële groei. Berekening van de kinetische parameters zorgt voor de screening van invloeden van stoffen/verbindingen op gisting of mitochondriaal ademhaling.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae cellen in de exponentiële fase groei hun wordt aangewezen door het produceren van ATP door middel van fermentatie en/of mitochondriaal ademhaling. De fermenteerbare koolstofconcentratie regelt voornamelijk hoe de gistcellen genereren ATP; Dus, de variatie in fermenteerbare koolhydraten niveaus rijdt de energetische stofwisseling van S. cerevisiae. Dit witboek beschrijft een methode van de high-throughput gebaseerd op exponentiële gist groei te schatten van de effecten van veranderingen van de concentratie en de aard van de koolstofbron op ademhalings- en fermenterende metabolisme. De groei van S. cerevisiae is gemeten in een microplate of geschud conische kolf door bepaling van de optische dichtheid (OD) op 600 nm. Vervolgens is een groeicurve gebouwd door plotting OD tegen de tijd, waardoor identificatie en selectie van de exponentiële fase, en is uitgerust met de vergelijking van exponentiële groei te verkrijgen van de kinetische parameters. Lage specifieke groeisnelheden met hogere verdubbeling keer vertegenwoordigen in het algemeen een respiratoire groei. Daarentegen geven hogere specifieke groeisnelheden met lagere verdubbeling keer fermenterende groei. Drempelwaarden van een verdubbeling van de tijd en de specifieke groeisnelheid worden geschat met behulp van bekende respiratoire of fermenterende aandoeningen, zoals niet-fermenteerbare koolstof bronnen of hogere concentraties van fermenteerbare suikers. Dit percentage wordt verkregen voor elke specifieke soort. Tot slot worden de berekende kinetische parameters vergeleken met de drempelwaarden vast te stellen of de gist fermenterende en/of respiratoire groei toont. Het voordeel van deze methode is de relatieve eenvoud voor inzicht in de effecten van een stof/samengestelde op fermenterende of luchtwegen metabolisme. Het is belangrijk om te benadrukken dat groei een ingewikkelde en complexe biologische proces is; Daarom moet de voorlopige gegevens van deze methode worden bevestigd door de kwantificering van zuurstofverbruik en accumulatie van bijproducten van gisting. Daarmee is deze techniek kan worden gebruikt als een oriënterende van verbindingen/stoffen die kunnen storen of verbetering van fermenterende of luchtwegen metabolisme.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae groei heeft gediend als een waardevol instrument te identificeren van tientallen fysiologische en moleculaire mechanismen. Groei is gemeten voornamelijk op drie manieren: seriële verdunningen voor ter plaatse testen, kolonie-vormende unit tellen en groeikrommes. Deze technieken kunnen alleen of in combinatie met een verscheidenheid aan substraten, omgevingsfactoren, mutanten en chemicaliën te onderzoeken specifieke antwoorden of fenotypen worden gebruikt.
Mitochondriale ademhaling is een biologisch proces waarin groei kinetiek met succes toegepast is voor het ontdekken van onbekende mechanismen. In dit geval de suppletie van groei media met niet-fermenteerbare koolstof bronnen zoals glycerol, lactaat of ethanol (die uitsluitend worden gemetaboliseerd door mitochondriale ademhaling), omdat de enige bron van koolstof en energie voor de evaluatie van zorgt de respiratoire groei, die belangrijk is voor de opsporing van verstoringen in oxidatieve fosforylatie activiteit1. Aan de andere kant, is het ingewikkeld om groei kinetische modellen te gebruiken als een methode voor het ontcijferen van de mechanismen achter gisting.
De studie van gisting en mitochondriale ademhaling is essentieel voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen achter bepaalde fenotypen zoals de Crabtree en Warburg effecten2,3. Het effect van de Crabtree wordt gekenmerkt door een toename van glycolytic flux, onderdrukking van mitochondriale ademhaling, en de oprichting van gisting als de primaire route voor het genereren van ATP in aanwezigheid van hoge concentraties van fermenteerbare koolhydraten (> 0,8 mM)4,5. Het Warburg effect is metabolisch analoog naar de Crabtree-effect, met het verschil dat bij zoogdiercellen het belangrijkste product van de gisting lactaat6 is. Inderdaad, het Warburg effect wordt tentoongesteld door een verscheidenheid van kankercellen, triggering van de glucose-opname- en consumptie zelfs in aanwezigheid van zuurstof7. Aldus, heeft bestuderen van de moleculaire basis van de overstap van ademhaling om gisting in het effect van de Crabtree zowel de biotechnologische gevolgen (voor de productie van ethanol) en de potentiële effecten in kankeronderzoek.
S. cerevisiae groei mogelijk een geschikt hulpmiddel om te bestuderen van de Crabtree en Warburg effecten. Dit idee is gebaseerd op het feit dat in de exponentiële fase van gist, de centrale trajecten gebruikt voor de productie van ATP zijn mitochondriale ademhaling en gisting, die essentieel is om groei te ondersteunen. Bijvoorbeeld, is de groei van S. cerevisiae nauw verwant met de functie van ATP genererende trajecten. In S. cerevisiae, de mitochondriale ademhaling produceert ongeveer 18 ATP-moleculen per molecuul glucose, overwegende dat vergisting alleen 2 ATP-moleculen genereert, vandaar de verwachting is dat de groei nauwe banden met de stofwisselingsroutes heeft het produceren van ATP8. In dit opzicht, wanneer de gisting is de belangrijkste route voor het genereren van ATP, compenseert de gist de lage productie van ATP door het optrekken van het steunpercentage van de glucose-opname. Integendeel, is de glucose consumptie door gistcellen die gebruikmaken van mitochondriale ademhaling als de hoofdbron van ATP laag. Dit geeft aan dat het belangrijk is voor de gist om zin koolhydraten beschikbaarheid voordat er wordt bepaald hoe ATP zal worden gegenereerd. Dus, de beschikbaarheid van glucose speelt een belangrijke rol in de switch tussen gisting en mitochondriale ademhaling in S. cerevisiae. In de aanwezigheid van grote hoeveelheden glucose verkiest de gist gisting als de centrale route voor het genereren van ATP. Interessant is dat wanneer de gist is fermenteren, wordt de specifieke groeisnelheid gehandhaafd op zijn maximum. Aan de andere kant onder lage niveaus van de glucose produceert S. cerevisiae ATP mitochondriale ademhaling, met behoud van lagere groeicijfers. Aldus, variatie in de concentratie van glucose en het gebruik van andere bronnen koolstof veranderingen bij de gist de voorkeur tussen fermenterende en respiratoire groei veroorzaken. Rekening houdend met dit feit met de vergelijking van exponentiële groei, kan men de biologische betekenis van kinetische parameters zoals de verdubbeling van de tijd (Dt) en specifieke groeisnelheid (µ) verkrijgen. Lagere waarden µ bleken bijvoorbeeld wanneer de gist mitochondriale ademhaling als het primaire traject gebruikt. Integendeel, onder voorwaarden die gisting gunst, hogere waarden µ bleken. Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van de waarschijnlijke mechanismen van elke chemische stoffen op het gebied van fermentatie en mitochondriale ademhaling in S. cerevisiae.
Het doel van deze paper is voor te stellen een methode gebaseerd op de kinetiek van de groei voor het screenen van de effecten van een bepaalde stof/samengestelde op mitochondriale ademhaling of gisting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cultuurmedia en entmateriaal voorbereiding
- Bereiden van 100 mL vloeibare voedingsbodem van 2% gist extract-pepton-dextrose (YPD) (1 g gist extract, caseïne pepton, 2 g en 2 g glucose aan 100 mL gedestilleerd water toevoegen). Breng 3 mL van de media in 15 mL steriliseerbare conische buizen. Autoclaaf de media gedurende 15 minuten staan bij 121 ° C en 1,5 psi.
Opmerking: De media kunnen worden opgeslagen voor maximaal een maand bij 4-8 ° C. - Inoculeer een conische buis gevuld met 3 mL cool steriele 2% YPD bouillon met 250 μL van S. cerevisiae cellen bewaard in glycerol bij-20 ° C. Na een nacht bebroeden in een roteerschudapparaat bij 30 ° C met agitatie bij 200 omwentelingen per minuut.
- Streak in een petrischaal (60 x 15 mm2) gevuld met steriele 2% YPD agar (Voeg toe 10 g gist extract, caseïne pepton, 20 g 20 g glucose, en 20 g van bacteriologische agar aan 1000 mL gedestilleerd water) met de cellen die zijn geteeld in de conische buis met behulp van een steriele lus. Incubeer de petrischaal bij 30 ° C tot de geïsoleerde kolonies groei vertoont.
- Voorbereiding van de pre entmateriaal door het enten van een enkele geïsoleerde kolonie in een conische buis gevuld met 10 mL cool steriele 2% YPD Bouillon en Incubeer het 's nachts bij 30 ° C met continue agitatie bij 200 omwentelingen per minuut.
2. cultuurmedia en groeikrommes in Microplate
- Bereiden van 10 mL van de 1% YPD Bouillon (0,1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0,1 g van glucose aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen), 10 mL 2% YPD Bouillon (0,1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0.2 g glucose aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen) , en 10 mL 10% YPD Bouillon (0,1 g gist extract, pepton, 0.2 g en 1 g glucose aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen). Autoclaaf deze groei mediums voor 15 min bij 121 ° C en 1,5 psi.
Opmerking: De voedingsbodems dient als een controle van fermenterende groei. - 10 mL van 2% gist extract-pepton-ethanol (YPE) Bouillon en 10 mL van 2% gist extract-pepton-glycerol (YPG) Bouillon voorbereiden. Voor 2% YPE: 0.1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0,2 mL ethanol aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen. Voor 2% YPG: 0.1 g gist extract, 0.2 g pepton, en 0,2 mL glycerol aan 10 mL gedestilleerd water toevoegen. Autoclaaf deze groei mediums voor 15 min bij 121 ° C en 1,5 psi.
Opmerking: Glycerol en ethanol zijn bronnen van niet-fermenteerbare koolstof die uitsluitend worden gemetaboliseerd door mitochondriale ademhaling. Om deze reden worden ze gebruikt als een respiratoire groei-besturingselementen. In deze stap, kunnen de aard en de concentratie van koolstofbron in de cultuur-media worden gewijzigd om te testen van de effecten op groei fenotype met behulp van gist extract-pepton (YP) Bouillon (10 g gistextract en 20 g van caseïne pepton in 1000 mL gedestilleerd water) als basis. Om te testen de effecten van andere voedingsstoffen naast koolstof, wordt synthetische compleet (SC) medium aangevuld overeenkomstig het doel van het experiment. De basis voor SC medium is 1,8 g gist stikstof basis zonder aminozuren, 5 g ammoniumsulfaat [(NH4)2SO4], Mononatrium Fosfaat (NaH2PO4), 1.4 g en 2 g van drop-out mix in 1000 mL gedestilleerd water. Een aanvulling op de media met een koolstofbron en extra stikstofbron in de benodigde concentraties. - 145 μL van geschikte voedingsbodems voor de proefopzet toevoegen aan elk putje van een steriele microplate (10 x 10-well) met een deksel en enten ze met 5 μL van de pre entmateriaal.
Opmerking: Als het doel is om het scherm van de invloed van stoffen/verbindingen op de energetische stofwisseling van de gist, dat stof/samengestelde moet worden toegevoegd tijdens deze stap. Ook moet elk soort microplate met een deksel nuttig zijn. - Incubeer de multi goed plaat in een microplate lezer bij 30 ° C met constante agitatie bij 200 t/min voor 48 h. maatregel de optische dichtheid (OD) op 600 nm elke 30 of 60 min.
Opmerking: Als de microplate-lezer niet de optie om te broeden de microplate hoeft, kan het worden geïncubeerd in een roteerschudapparaat op dezelfde voorwaarden tussen elke meting van de OD.
3. groeikrommes in geschud erlenmeyers
- 4.8 mL van de geschikte voedingsbodems toevoegen aan 20 mL Erlenmeyerkolven en autoclaaf. Inoculeer elke kolf met 200 μL van de cultuur van de pre entmateriaal bij OD600nm ~ 2 in koele, steriele 2% YPD Bouillon. Incubeer hen bij 30 ° C met constante agitatie bij 250 omwentelingen per minuut gedurende 24 uur.
Opmerking: Als de incubatietijd hoger dan 24 h is, 12 mL van de geschikte voedingsbodems aan conische kolven van 50 mL en autoclaaf toevoegen. Inoculeer hen met 500 μL van de pre entmateriaal. Het is ook belangrijk om te overwegen de fermenterende groei (YP media met 1%, 2% of 10% glucose) en respiratoire groei besturingselementen (YP media met 2% glycerol of ethanol). - Neem 100 μl van de geschud erlenmeyer cultuur en Verdun het in 900 μL van gedistilleerd water in een cuvet van de spectrofotometer 1 mL en zachtjes Meng door pipetteren. Meten van de OD op 600 nm met behulp van een spectrofotometer elke 2 h. Voor het verkrijgen van de echte OD, vermenigvuldigt u het resultaat met tien.
4. verwerking van de gegevens en de berekening van de kinetische Parameters
-
Maak een nieuw projectbestand in het statistisch pakket-software. In de sectie van "nieuwe tabel en grafiek", de "XY" -optie te selecteren.
- Selecteer de optie: 'Start met een leeg gegevenstabel' in de sectie "Sample data" .
- Selecteer de "Punten en aansluitende lijn" type van de grafiek. De sectie van de "X" in het segment van de "Subcolumns voor replicatieonderzoeken of foutwaarden" uitgeschakeld laten, en in de "Y" sectie Kies de optie: "Voer (10) repliceren waarden in subcolumns naast elkaar en plot gemiddelde en fout SD". Klik op de knop maken.
Opmerking: De tabelindeling heeft een X-kolom en meerdere Y-kolommen, elk met de 10 subcolumns eerder gekozen.
- Schrijf de tijd op welke OD metingen werden genomen in de X-kolom (bijvoorbeeld 0, 30, 60, 90 min of 0, 1, 1.5, 2 h). In de Y-kolommen, schrijft de OD-waarden, verkregen uit de culturen.
- Het identificeren van de fase van de exponentiële groei de Y kolomgegevens omzetten in logaritmen. Klik op de knop "Analyseren" , kies het "Transformeren" -analyse, selecteer Y-waarden met behulp van Y = Log(Y). Ga naar de "Galerij van resultaten", selecteer "Transformeren" gegevenstabel, klikt u op "Analyseer" , en kies de "Lineaire regressie" analyse. Uitsluiten van de OD-waarden die een lineair gedrag niet volgen. Als u wilt uitsluiten van waarden, selecteert u deze in de gegevenstabel en typ "Ctrl + E".
Opmerking: Het is belangrijk om uit te sluiten van de waarden die niet de exponentiële fase, volgen omdat de exponentiële groei vergelijking goed bij de exponentiële fase past. - Selecteer de gegevenstabel in de "Gegevenstabellen galerij", "gegevens 1". Klik op de knop "Analyseren" en kies de "Niet-lineaire regressie (kromme fit)"-analyse onder de "XY analyses".
- Selecteer de volgende gegevensverzamelingen moeten analyseren en klik op de knop "OK" . Kies in het tabblad "Fit" de sectie "Exponentiële vergelijking" en selecteer de "exponentiële groei vergelijking" (, waar X cel concentratie is, X0 is cel concentratie tegelijkertijd nul μ is van de specifieke groeisnelheid, en t is tijd). Gebruiken van de "kleinste kwadraten" als een passende methode en de interpolate sectie uitgeschakeld laten. Klik op de knop "OK" .
Opmerking: Het tabblad met de niet-lineaire fit resultaten is in de "Galerij van resultaten". De software berekent verdubbeling tijd (Dt) en specifieke groeisnelheid (μ). De software toont μ als K op het tabblad resultaten. - Open een nieuw projectbestand en selecteer in de sectie "nieuwe tabel en grafiek" de kolom keuze. Kies de optie "Start met een leeg gegevenstabel" en selecteer de gewenste grafiek. Kiezen voor het uitzetten van het gemiddelde met de SD.-Selecteer de knop "Create" .
- De μ of Dt waarden uit het niet-lineaire fit resultaten tabblad dat is in de "Galerij van resultaten" kopiëren en plakken in een kolom. Tot slot Selecteer de knop "Analyseren" en kies de gewenste analyse in de sectie "Kolom analyses" om te vergelijken de kinetische parameters van de verschillende nutrimental voorwaarden.
Opmerking: De kinetische parameters verkregen de fermenterende groei besturingselementen (YP media met 1%, 2% of 10% glucose) en respiratoire groei besturingselementen (YP media met 2% glycerol of ethanol) helpt de drempel van fermenterende en mitochondriale ademhaling, stand respectievelijk. Vergelijken van de kinetische parameters van de voeding voorwaarde en stof/compound vehiculumcontrolegroep met de Ademhalings- en fermenterende groei helpen bij het identificeren van mogelijke effect op de luchtwegen of fermenterende metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Groeikrommes kunnen worden gebruikt om preliminair discrimineren tussen ademhalings- en fermenterende fenotypen in de S. cerevisiae gist. Dus we batch culturen van S. cerevisiae (BY4742) uitgevoerd met verschillende glucose concentraties die zijn gemeld voor het opwekken van fermenterende groei: 1%, 2% en 10% (m/v)9. Culturen waaruit een fermenterende fenotype hebben een kleine vertraging-fase en een exponentiële fase met een hoog groeipercentage (Figuur 1). Ethanol, glycerol, en lactaat zijn de koolstof-bronnen die kunnen worden gemetaboliseerd alleen via ademhaling; Dus, we uitgevoerd culturen van de gist met behulp van deze koolstof-bronnen. Culturen die energie voornamelijk door oxidatieve fosforylatie verkrijgen toonde een langere vertragingstijd fase en het trage tempo van de groei tijdens de exponentiële fase (Figuur 2).
Analyse van de groeikrommes alleen kwalitatieve informatie geeft; Vandaar, is het belangrijk om te berekenen van de kinetische parameters om kwantitatieve informatie te verkrijgen. We berekend de Dt en μ met behulp van de vergelijking van de exponentiële groei (Figuur 3). Wij stellen een drempel voor respiratoire groei waarden bij Dt ≥11.5 h en μ ≤0.059 / h. De drempel voor fermenterende groei werd vastgesteld op Dt ≤6.5 h en μ ≥0.149 / h (Figuur 3).
Om te bewijzen dat het nut van deze screening tool ontworpen we drie experimenten, met de eerste voor de evaluatie van de effecten van verschillende resveratrol (RSV) concentraties op S. cerevisiae BY4742 cellen met verschillende energetische status (Figuur 4) in geschud kolven. Het tweede experiment was gericht op het detecteren van de effecten van verschillende ammoniumsulfaat (NH4+) concentraties op het energiemetabolisme van S. cerevisiae BY4742 (Figuur 5) in een microplate. Tot slot de derde gericht om te illustreren hoe wijzigingen in koolstofbron beïnvloeden fermenterende groei in twee verschillende stammen van S. cerevisiae (W303 en de industriële WLP530 voor bier gisting gebruikt) (Figuur 6). In het experiment met behulp van RSV, is de energetische status van de cel bewerkt door het variëren van de concentratie van glucose. Bij 10% glucose, alle RSV concentraties getest veranderde niet de respiro-fermenterende fase van de gist maar het verlagen van de respiratoire fase (tijdens de diauxie shift, S. cerevisiae gemetaboliseerd de ethanol dat gewonnen is tijdens de exponentiële fase door oxidatieve fosforylatie). De μ -waarden bevestigd dat onder alle omstandigheden getest, S. cerevisiae fermenterende gedrag, in tegenstelling tot zijn fenotype toonde als volwassen in 2% glycerol (voorwaarde als een respiratoire controle gebruikt) (figuur 4a). Wanneer cellen werden energiek met slechts 1% glucose, bevestigd de μ -waarden dat op 0,1, 1, 10 en 100 µM RSV, niet fermenterende gedrag in de respiro-fermenterende fase werd beïnvloed. Echter werd een daling in de luchtwegen fase tijdens de verschuiving van de diauxie waargenomen. Bovendien, bij een concentratie van 1000 µM, RSV geremd volledig celgroei.
In het tweede experiment, cellen werden aangevuld met 10% glucose, een concentratie geacht voldoende voor het opwekken van het effect van de Crabtree in S. cerevisiae. Vandaar, kunnen we kijken wat het effect bevorderd door de suppletie van verschillende concentraties van NH4+ in fermenterende metabolisme. Dt -waarden voorgesteld dat 0.13, 0,66 en 1.99% NH4+ gunst fermenterende metabolisme en het kan worden waargenomen in de groeikrommes dat deze concentraties uitgebreid exponentiële fase van de cultuur. Echter bij 3.31% mM NH4+bleek een toename van de waarde van Dt dat deze concentratie een respiro-fermenterende metabolisme induceert. Dit fenotype toonde een uitgebreide lag fase in de groeikrommes en de langzamere groei in de exponentiële fase (Figuur 5).
In het derde experiment, cellen van twee verschillende stammen van S. cerevisiae (W303 en WLP530) werden gekweekt in verschillende concentraties van saccharose of galactose om te testen of de gevolgen van de koolstofbron voor Dt -waarden werden stam-afhankelijk. Beide stammen waren gegroeid in 2% glucose als een fermenterende controle-, en Dt -waarden werden berekend om een drempel voor fermenterende groei. De fermenterende Dt -waarden voor de stammen verschillend waren, en met ≤3.25 voor de W303-stam en de ≤6.84 voor de WLP530 h h stam. Daarom is het belangrijk te wijzen op de noodzaak voor de validatie van de drempel van Dt voor de verschillende stammen gebruikt. Bovendien, toen sacharose werd gebruikt als de koolstofbron, een fermenterende fenotype werd waargenomen op 2% en 10% in beide stammen. Echter toen galactose werd gebruikt, toonde de stam W303 geen fermenterende gedrag in een van de concentraties getest, terwijl de WLP530-stam een fermenterende fenotype op 2% galactose toonde. Interessant is dat groeide de W303-stam in alle concentraties van beide bronnen van de koolstof getest. De WLP530-stam toonde echter geen groei in de laagste concentratie van koolstof gebruikt (0.01%). Dit kan zijn omdat het WLP530 wordt gebruikt in de bierindustrie en de concentraties van de koolstof die is blootgesteld zijn over het algemeen veel hoger (Figuur 6).
Over het geheel genomen blijken de gegevens uit deze drie experimenten dat groeikrommes en kinetische parameters nuttig voor de voorlopige discriminatie tussen ademhalings- en fermenterende groei in S. cerevisiae zijn. Ook is het belangrijk om te benadrukken dat dit is een veelzijdige tool die kan worden gebruikt in verschillende aspecten van energie metabolisme-onderzoek.
Figuur 1: Effect van verschillende glucose concentraties op S. cerevisiae groei fenotype. Groeikrommes werden gebouwd door het meten van de extinctie op 600 nm elke 30 min. voor 48 uur. Toen S. cerevisiae cellen gisten, toonde culturen een korte vertraging fase en de snelle groei in de exponentiële fase. De respiro-fermenterende fase kan worden gevolgd door een groei vertraging fase (respiratoire), waar de ethanol geproduceerd door fermentatie wordt gemetaboliseerd met behulp van de oxidatieve fosforylatie traject, dan de stationaire fase is bereikt. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Effect van respirabel koolstof bronnen op S. cerevisiae groei fenotype. Groeikrommes werden gebouwd door het meten van de extinctie op 600 nm elke 30 min. voor 48 h. cellen van S. cerevisiae toonde een langdurige vertraging fase en de trage groei tijdens de exponentiële fase en in het algemeen niet tonen een verschuiving van de diauxie. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Effect van koolstofbron en de concentratie van S. cerevisiae kinetische parameters. (een) Dt waarden van S. cerevisiae BY4742 groei onder verschillende koolstof bronnen; (b) μ -waarden van S. cerevisiae BY4742 groei onder verschillende concentraties van verschillende koolstof bronnen. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een one-way ANOVA, gevolgd door de een Dunnett-test (*p < 0.01 vs. 2% glucose). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Effect van resveratrol suppletie op andere cel energie statussen. (een) groei fenotype en μ -waarden met 10% glucose; (b) groei fenotype en μ -waarden met behulp van 1% glucose. Gegevens uit de groeikrommes worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking, en μ -waarden worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking. Statistische analyses voor μ -waarden werden uitgevoerd met behulp van een one-way ANOVA, gevolgd door de een Dunnett-test [*p < 0,01 vs. respiratoire controle met 2% glycerol (RC)]. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Effect van ammoniumsulfaat suppletie op S. cerevisiae energiemetabolisme. Groeikrommes werden gebouwd door het meten van de extinctie op 600 nm elke 30 min. voor 48 h. gegevens uit groeikrommes worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking, en μ -waarden worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking. Statistische analyses voor Dt -waarden werden uitgevoerd met behulp van een one-way ANOVA, gevolgd door de een Dunnett-test [* p < 0,01 vs. respiratoire controle met 2% glycerol (RC)]. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Effect van galactose en sucrose concentratie in het fermenterende metabolisme van Saccharomyces cerevisiae. (een) Dt waarden voor de W303 lab stam en (b) Dt -waarden voor de industriële stam van WLP530. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaardafwijking. Statistische analyses voor Dt -waarden werden uitgevoerd met behulp van een one-way ANOVA, gevolgd door de een Dunnett-test [* p < 0,01 vs. 2% glucose (fermenterende control)]. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een lange tijd verstreken is sinds J. Monod10 uitgedrukt dat de studie van de groei van bacteriële culturen de basismethode van de microbiologie is. De komst van de moleculaire tools vertraagt het gebruik en de studie van de groei als een techniek. Ondanks de complexiteit van groei, waarbij tal van onderling samenhangende processen, kunnen de onderliggende mechanismen worden beschreven met behulp van wiskundige modellen11. Dit is een robuuste benadering die kan worden gebruikt als een aanvullend instrument voor het verhelderen van de meest ingewikkelde moleculaire mechanismen12.
Voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten van deze methode, is het belangrijk om te overwegen de volgende kritische stappen. Agitatie bij 250 omwentelingen per minuut is cruciaal voor een goede groei in koolstofarme bronnen die uitoefenen van respiratoire groei, aangezien bij het gebruik van lagere agitatie snelheden (150-180 rpm) we waargenomen groei in de luchtwegen verminderde. Het is belangrijk om het protocol met een verse voorraad initiëren, en het is ook essentieel voor het handhaven van een uniform fenotype in het testen. Groei kinetiek drempelwaarden variëren tussen stammen en moeten worden gevalideerd volgens de voorwaarde moet worden gebruikt bij het testen. De GraphPad prisma-software wordt voorgesteld omdat de exponentiële groei vergelijking al geladen is; andere software is echter geschikt, mits daarmee de programmering van de vergelijking van exponentiële groei. In de microplate, is het raadzaam om op te nemen van drie putten met 150 μl van groei media zonder entmateriaal — dit is een besturingselement dat aangeeft als de putjes microplate besmetting hebben opgelopen.
Het is belangrijk om aan te geven dat uitzetten van de gegevens van de OD op lineaire schaal kan maken het moeilijk om te bepalen van de logaritmische groeifase. Dit probleem kan worden verholpen door het uitzetten van de OD-gegevens in een logboek schaal zodat lag fase en logaritmische groeifase duidelijk zichtbaar zijn.
Dit protocol wordt alleen gebruikt om het scherm van een fenotype, zodat de specifieke gevolgen voor gisting en mitochondriale ademhaling moeten worden bevestigd. Het is raadzaam de kwantificering van de mitochondriale ademhaling door zuurstof verbruik assays13,14, terwijl gisting kan worden bepaald door de accumulatie van bijproducten zoals acetaat, succinaat, glycerol en ethanol9 .
S. cerevisiae groei heeft gediend als een middel voor het begrip van de moleculaire mechanismen en fenotypen, met methoden uit de screening te testen testen. Echter talrijke experimentele designs in de literatuur gebruik gist groei alleen als een kwalitatieve parameter (bijvoorbeeld plaat verdunningen of groeikrommes), zodat de werkgelegenheid van deze technieken waardevolle bewijs verwaarloost. Bijvoorbeeld, is de zuurstof beschikbaar in agar platen gebruikt voor microbiële populatie tellen of het maken van de seriële-verdunningen beperkt, complicerende groei meting onder de luchtwegen. Bovendien, wanneer twee of meer cellen aan elkaar bevestigd blijven, slechts één kolonie wordt waargenomen. Een andere beperking is het gebruik van groeikrommes dientengevolge visuele verschillen in groei, die buiten beschouwing feiten over subtiele verschillen laten kan. Derhalve in de vertaling van groei informatie aan kwantitatieve parameters vergunningen in het bereiken van nauwkeurige gegevens over het moe fenotype. De wiskundige vertegenwoordiging van groei is echter een ingewikkelde wetenschappelijke onderneming. De meeste studies onderzoeken volle groei (lag, log en stationaire fasen) van de micro-organismen, eersterangs polynomiale vergelijkingen die alleen één milieu voorwaarde dienen te verkrijgen. Ondanks de relatieve eenvoud bij het berekenen van coëfficiënten van deze vergelijkingen door lineaire regressie, is het moeilijk om te wijzen hen aan een inherente biologische zin15. De analyse van de groei door het scheiden van groeifases is wiskundig betrouwbaar en eenvoudig. Een voorbeeld hiervan is de vergelijking van exponentiële groei, die is gebaseerd op eersteordekinetiek en goed past bij een korte vertraging fase en de exponentiële fase.
Tot slot is bestuderen de fase van de log met behulp van de vergelijking van de exponentiële groei een consistente methode om te begrijpen van de invloed van mitochondriale ademhaling of vergisting op een specifieke compound of milieu. Als een bewijs van concept, kwantificering van groei in de exponentiële fase aangetoond dat RSV, specifiek van invloed is op respiratoire groei13,14. Hier, diende groei als een waardevol instrument te identificeren dat RIM15 schrapping waarschijnlijk fermenterende stofwisseling door gedeeltelijke remming van de ademhaling capaciteit in S. cerevisiae9 verbetert. Deze gegevens bevestigen dat observeren groei voor de studie van fermenterende en respiratoire stofwisseling zorgt en een eenvoudige en betrouwbare methode is. Vandaar deze aanpak maakt het mogelijk voor het screenen van de gevolgen van een specifieke stof voor de mitochondriale ademhaling of vergisting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd gesteund door subsidies van de Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (subsidie nummer 293940) en Fundación TELMEX-TELCEL (subsidie nummer 162005585), zowel IKOM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction? Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
