Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки метаболизм дыхания и ферментативным путем установки экспоненциальный рост Saccharomyces cerevisiae экспоненциальный рост уравнения. Расчета кинетических параметров позволяет для проверки влияния веществ/соединений на брожение или митохондриальное дыхание.
Abstract
Пивоваренные дрожжи клетки в экспоненциальной фазе роста, производя СПС через ферментации и/или митохондриальное дыхание. Концентрация углерода сбраживаемых главным образом регулирует как дрожжевых клеток генерировать СПС; Таким образом различия в уровнях сбраживаемых углеводов диски энергетический метаболизм S. cerevisiae. Этот документ описывает метод высокой пропускной способностью на основе экспоненциального дрожжей роста для оценки последствий изменения концентрации и характер источника углерода на метаболизм дыхания и ферментативной. Рост S. cerevisiae измеряется в Гонав или потрясен конической колбе путем определения оптической плотности (OD) на 600 Нм. Затем кривая роста построен построения ОД против времени, что позволяет выявление и отбор экспоненциальной фазе и оснащен экспоненциальный рост уравнение для получения кинетическими параметрами. Низкие конкретные темпы роста с выше удвоение раз обычно представляют дыхания рост. И наоборот более высокие темпы роста конкретных с нижней удвоение раз указывают на ферментативную рост. Пороговые значения удвоения время и темп роста конкретных оцениваются с помощью хорошо известных дыхания или ферментативную условия, такие как источников без сбраживаемых углерода или более высокие концентрации сбраживаемых Сахаров. Это получается для каждого конкретного штамма. Наконец рассчитанные кинетических параметров сравниваются с пороговые значения установить ли дрожжи показывает ферментативной и/или респираторных роста. Преимуществом данного метода является его относительная простота для понимания воздействия вещества/смеси на ферментативную или дыхательных путей метаболизма. Важно подчеркнуть, что рост является сложной и сложной биологический процесс; Таким образом предварительные данные из этого метода должен быть подтвержден количественная оценка потребления кислорода и накоплением побочные продукты брожения. Таким образом этот метод может использоваться как предварительный скрининг соединений/веществ, которые могут нарушить или улучшают ферментативную или дыхательных путей метаболизма.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae роста служит ценным инструментом для выявления десятки физиологических и молекулярных механизмов. Рост измеряется прежде всего тремя методами: серийных разведений для выборочной проверки, образуя колонии единица подсчета и кривых роста. Эти методы могут использоваться отдельно или в сочетании с различными субстратами, экологических условий, мутантов и химических веществ расследовать конкретные ответы или фенотипов.
Митохондриальное дыхание-это биологический процесс, в котором Кинетика роста успешно применяется для обнаружения неизвестных механизмов. В этом случае добавок питательных сред с без сбраживаемых углерода источников таких как глицерин, лактат или этанол (которые являются исключительно метаболизируется путем митохондриальное дыхание), как единственного источника углерода и энергии позволяет для оценки респираторные роста, который имеет важное значение для выявления возмущений в окислительного фосфорилирования деятельности1. С другой стороны это сложно пользоваться кинетической модели роста как метод для расшифровки механизмов за брожения.
Изучение митохондриального дыхания и брожения имеет важное значение для прояснения молекулярных механизмов за определенные фенотипов например Крабтри и Варбург эффекты2,3. Crabtree эффект характеризуется увеличением гликолитических потока, репрессии митохондриальное дыхание и создание ферментации как основной путь для генерации АТФ в присутствии высоких концентраций сбраживаемых углеводов (> 0,8 мм)4,5. Варбург эффект метаболически аналого-Crabtree эффект, с той разницей, что в клетках млекопитающих, основным продуктом ферментации молочной кислоты6. Действительно Варбург эффект проявляется на различных раковых клеток, вызывая глюкозы и потребления даже в присутствии кислорода7. Таким образом изучая молекулярные основы перехода от дыхания для ферментации в Crabtree эффект в биотехнологических последствия (для производства этанола) и потенциального воздействия исследований рака.
S. cerevisiae рост может быть подходящим инструментом для изучения влияния Crabtree и Варбург. Эта идея основывается на том, что в экспоненциальной фазе дрожжей, Центральный путей, используемых для производства АТФ, митохондриальных дыхания и брожения, которые необходимы для поддержания экономического роста. Например рост S. cerevisiae тесно связано с функции генерации АТФ пути. В S. cerevisiae, митохондриальное дыхание производит приблизительно 18 ATP молекулы на молекулу глюкозы тогда как ферментация генерирует только 2 молекулы АТФ, поэтому ожидается что темпы роста имеет тесные связи с метаболических производства АТФ8. В этой связи когда брожение является основной маршрут для генерации АТФ, дрожжи компенсирует низкий уровень производства АТФ, увеличивая скорость поглощения глюкозы. Напротив потребление глюкозы клетками дрожжей, которые используют митохондриальное дыхание как основной источник АТФ является низким. Это означает, что это важно для дрожжей в смысле наличия углеводов до определения того, как будет создаваться СПС. Таким образом, наличие глюкозы играет важную роль в переключение между ферментации и митохондриальное дыхание в S. cerevisiae. При наличии большого количества глюкозы дрожжи предпочитает ферментации как Центральный маршрут для генерации АТФ. Интересно, что когда дрожжи брожения, темпы роста конкретных поддерживается на своего максимума. С другой стороны под низкий уровень глюкозы, S. cerevisiae производит АТП с использованием митохондриальное дыхание, поддержание темпов роста. Таким образом различия в концентрации глюкозы и использование других источников углерода вызывают изменения в дрожжи предпочтения между роста ферментативной и дыхания. Принимая во внимание этот факт с помощью уравнения экспоненциальный рост, можно получить Биологическая смысль кинетических параметров, таких как удвоение время (Dt) и конкретных прирост (мкг). Например более низкие значения µ были найдены когда дрожжи в качестве основного пути использует митохондриальное дыхание. Напротив в условиях, которые способствуют ферментации, были обнаружены высокие значения µ . Эта методология может использоваться для оценки вероятных механизмов любых химических веществ, влияющих на брожение и митохондриальное дыхание в S. cerevisiae.
Цель этого документа должна предложить метод, основанный на Кинетика роста для проверки воздействия данного вещества/смеси на митохондриальное дыхание или ферментации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура средства массовой информации и подготовка посевным материалом
- Подготовка 100 мл 2% дрожжевой экстракт Пептон декстрозы (YPD) жидкой среды (добавить 1 г дрожжей экстракт, казеина Пептон, 2 g и 2 g глюкозы до 100 мл дистиллированной воды). Отказаться от 3 мл СМИ в 15 мл стерилизуются конические трубы. Автоклав СМИ за 15 мин при температуре 121 ° C и 1,5 psi.
Примечание: Средства массовой информации могут быть сохранены на срок до одного месяца на 4 – 8 ° C. - Прививать Конические трубки, заполненные с 3 мл прохладной стерильные 2% YPD бульон с 250 мкл клеток S. cerevisiae , сохранились в глицерин при-20 ° C. Инкубируйте на ночь в орбитальный шейкер при 30 ° C с перемешиванием на 200 об/мин.
- Полоска Петри (60 x 15 мм2) наполнены стерильный 2% YPD агар (добавить 10 г дрожжей экстракт, 20 g Пептон казеина, 20 г глюкозы, и 20 g бактериологического агар до 1000 мл дистиллированной воды) с клеток, выращиваемых в конической трубки с помощью стерильных цикла. Инкубируйте Петри в 30 ° C до тех пор, пока отдельные колонии показывают рост.
- Подготовить предварительный посевным материалом, прививки одной изолированной колонии в конической трубки заполнены с 10 мл прохладной стерильные 2% YPD бульона и проинкубируйте ее на ночь на 30 ° C при постоянном помешивании в 200 об/мин.
2. Культура СМИ и кривых роста в микропланшетов
- Подготовка 10 мл 1% YPD бульона (добавить 0,1 г дрожжей экстракт, 0,2 г Пептон, и 0,1 г глюкозы до 10 мл дистиллированной воды), 10 мл 2% YPD бульона (добавить 0,1 г дрожжей экстракт, 0,2 г Пептон, и 0,2 г глюкозы до 10 мл дистиллированной воды) и 10 мл 10% YPD бульона (добавить 0,1 г дрожжей экстракт, 0,2 г Пептон, и 1 г глюкозы до 10 мл дистиллированной воды). Автоклав эти роста сред для 15 мин при температуре 121 ° C и 1,5 psi.
Примечание: Культуры средств массовой информации служит элемент управления ферментативным роста. - Подготовка 10 мл 2% дрожжевой экстракт Пептон этанол (тип) бульона и 10 мл 2% дрожжевой экстракт Пептон глицерин бульона (YPG). 2% тип: добавить 0,1 г дрожжей экстракт, 0,2 г Пептон, и 0,2 мл этанола до 10 мл дистиллированной воды. 2% YPG: добавить 0,1 г дрожжей экстракт, 0,2 г Пептон, и 0,2 мл глицерина до 10 мл дистиллированной воды. Автоклав эти роста сред для 15 мин при температуре 121 ° C и 1,5 psi.
Примечание: Глицерин и этанола, источников без сбраживаемых углерода, которые являются исключительно метаболизируется путем митохондриальное дыхание. По этой причине они используются в качестве контроля дыхания рост. В этом шаге типа и концентрации источника углерода в культуре средств массовой информации могут быть изменены для проверки воздействия на рост фенотип, используя дрожжевой экстракт Пептон (YP) отвар (10 г экстракта дрожжей и 20 g Пептон казеина в 1000 мл дистиллированной воды) в качестве базы. Чтобы проверить действие других питательных веществ, кроме углерода, синтетические полного среднего (SC) дополняется согласно целью эксперимента. База для средних SC является 1.8 g базовый без аминокислоты, 5 г сульфата аммония дрожжи азота [(NH4)2т4], 1,4 г натрия фосфата (NaH2PO4), и 2 g отсева из смеси в 1000 мл дистиллированной воды. Дополнение к СМИ с источника углерода и источник дополнительного азота в необходимой концентрации. - Добавьте 145 мкл подходящих культуры средств массовой информации для экспериментальных дизайн каждой скважины стерильные Гонав (10 x 10-а) с крышкой и прививать им с 5 мкл предварительно посевным материалом.
Примечание: Если цель состоит в том, чтобы экранировать влияние веществ/соединений на энергетический метаболизм дрожжи, что вещество/смесь следует добавить во время этого шага. Кроме того любой тип микропланшетов с крышкой должно быть полезным. - Инкубировать несколькими хорошо пластины в Считыватель микропланшетов при 30 ° C с постоянным перемешиванием в 200 об/мин за 48 ч. измерения оптической плотности (OD) на 600 Нм каждые 30 или 60 мин.
Примечание: Если Считыватель микропланшетов не имеют возможность для инкубации микроплиты, он может быть инкубировали в орбитальный шейкер на тех же условиях между каждого измерения ОД.
3. рост кривых в потрясен Конические колбы
- Добавьте 4,8 мл подходит культуры средств массовой информации в 20 мл Конические колбы и автоклав. Прививать каждый флакон с 200 мкл предварительно посевные культуры в ОД600nm ~ 2 в прохладном, стерильные 2% YPD бульон. Инкубируйте их в 30 ° C с постоянным агитации за 24 часа на 250 об/мин.
Примечание: Если инкубационный период выше, чем 24 часа, добавьте 12 мл подходящие средства массовой информации культуры 50 мл Конические колбы и автоклав. Прививать им с 500 мкл предварительно посевным материалом. Важно также рассмотреть ферментативным роста (YP СМИ с 1%, 2% или 10% глюкозы) и дыхательных путей роста элементов управления (YP СМИ с 2% глицерина или этанола). - Взять 100 мкл потрясен коническую колбу культуры и развести его в 900 мкл в кювет спектрофотометр 1 мл дистиллированной воды и осторожно перемешать, закупорить. Измерить ОД на 600 Нм, используя спектрофотометр каждые 2 ч. Для получения реальной ОД, умножьте результат на десять.
4. обработка данных и расчета кинетических параметров
-
Создание нового файла проекта в Статистический пакет программного обеспечения. В разделе «Новая таблица и график»выберите параметр «XY» .
- Выберите вариант: «Начать с пустой таблицы» в разделе «Примеры» .
- Выберите тип диаграммы «Точек и соединительная линия» . Оставить в разделе «X» , снят в сегменте «Перемножения реплицирует или значения ошибок», и в «Y» раздел выберите вариант: «Введите (10) реплицировать значения в бок о бок перемножения и сюжет среднее и SD ошибка». Нажмите кнопку Создать.
Примечание: Формат таблицы имеет один столбец X и несколько столбцов в Y, каждое с 10 перемножения, отобранных ранее.
- Запись времени, в котором ОД измерения были проведены в столбце X (например, 0, 30, 60, 90 мин или 0, 1, 1.5, 2 ч). В столбцах Y напишите ОД значения, полученные из культур.
- Определите фазы экспоненциального роста, преобразования данных столбца Y в логарифмы. Нажмите на кнопку «Анализировать» , выберите «Преобразовать» анализ, выберите значения Y, используя Y = Log(Y). Перейдите в «Галерея результатов», выберите «Преобразовать» таблицы данных, нажмите кнопку «Анализировать» и выберите «Линейной регрессии» анализ. Исключите ОД значения, которые не следуют линейное поведение. Чтобы исключить значения, выберите их в таблице данных и типа «Ctrl + E».
Примечание: Важно исключить значения, которые не следуют экспоненциальной фазе, так как уравнение экспоненциальный рост хорошо сочетается с экспоненциальной фазе. - В «Галерея таблицы данных», выберите таблицу данных » данных 1». Нажмите на кнопку «Анализировать» и выберите «Нелинейной регрессии (кривая fit)» анализ среди «XY анализа».
- Выберите наборы данных для анализа и нажмите кнопку «ОК» . В закладке «Fit» выберите раздел «Экспоненциальные уравнения» и выберите «экспоненциальный рост уравнение» (, где X является концентрация клеток, X0 является концентрация клеток на нулевое время, μ ставка определенного роста, и t — время). Используйте «наименьших квадратов пригодный» как метода установки и оставить невыбранном секции интерполяция. Нажмите кнопку «ОК» .
Примечание: Вкладка с результатами нелинейные ЦФ находится в «Галерея результатов». Программное обеспечение вычисляет удвоение время (Dt) и конкретные темпы роста (μ). Программное обеспечение показывает μ как K на вкладке результаты. - Открыть файл нового проекта и в разделе «Новая таблица и график» , выберите Выбор столбцов. Выберите опцию «Начать с пустой таблицы» и выберите нужную диаграмму. Выберите участок средней с SD. Выберите кнопку «Создать» .
- Скопируйте μ или Dt значения из вкладки нелинейные ЦФ результаты, которая находится в «Галерея результатов» и вставьте их в столбце. Наконец выберите кнопку «Анализировать» и выберите требуемый анализ в разделе «Столбец анализа» для сравнения кинетических параметров различных nutrimental условий.
Примечание: Кинетические параметры, полученные из контроля ферментативной роста (YP СМИ с 1%, 2% или 10% глюкозы) и контроль дыхания рост (YP СМИ с 2% глицерина или этанол) помогает установить порог ферментативной и митохондриальное дыхание, соответственно. Сравнивая кинетических параметров от состояния питания и вещество/смесь assayed с дыхательной и ферментативным роста помогают определить возможное влияние на метаболизм дыхания или ферментативную.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кривые роста может использоваться для предварительно различать дыхания и ферментативным фенотипы в дрожжей S. cerevisiae . Таким образом, мы исполняли партии культуры S. cerevisiae (BY4742) с концентрациями различных глюкозы, представивших побудить ферментативным рост: 1%, 2% и 10% (w/v)9. Культуры, показаны ферментативным фенотипа имеют небольшое отставание фазы и экспоненциальной фазе с высокими темпами роста (рис. 1). Этанол, глицерин и лактат являются источники углерода, которые могут быть метаболизируется только через дыхание; Таким образом мы провели культуры дрожжей, с использованием этих источников углерода. Культур, которые получают энергию, главным образом, окислительное фосфорилирование показал больше участка запаздывания и медленные темпы роста в экспоненциальной фазе (рис. 2).
Анализ кривых роста обеспечивает только качественную информацию; Следовательно важно вычислить кинетические параметры для получения количественной информации. Мы рассчитали Dt и μ формуле экспоненциального роста (рис. 3). Мы установили порог для дыхания рост значения на Dt ≥11.5 h и μ ≤0.059 / ч. Порог для бродильных роста был установлен в Dt ≤6.5 h и μ ≥0.149 / ч (рис. 3).
Чтобы доказать полезность этого инструмента отбора мы разработали три экспериментов, с первым для оценки воздействия концентраций различных ресвератрол (РСВ) на BY4742 S. cerevisiae клетки с различными энергетический статус (рис. 4) в Потрясенный колбы. Второй эксперимент, направленных для выявления воздействия концентраций различных сульфата аммония (NH4+) на энергетический метаболизм BY4742 S. cerevisiae (рис. 5) в микроплиты. Наконец, третий призван проиллюстрировать, как изменения в источник углерода влияют на ферментативную роста в двух различных штаммов S. cerevisiae (W303 и промышленного WLP530 используется для брожения пива) (рис. 6). В эксперименте с использованием RSV энергичный статус клеток была изменена различной концентрации глюкозы. В 10% раствор глюкозы, все концентрации RSV испытания не изменить этапа respiro ферментативную дрожжей но уменьшение дыхательной фазы (во время смены diauxic, S. cerevisiae метаболизируется этанол производится в ходе этапа экспоненциальный, Окислительное фосфорилирование). Значения μ подтвердил, что при любых условиях испытания, S. cerevisiae показал ферментативным поведения, вопреки его фенотипу когда выросли в 2% глицерина (условие используется как элемент респираторных) (рис. 4a). Когда клетки были под напряжением с только 1% глюкозы, значения μ подтвердил, что на 0.1, 1, 10 и 100 мкм RSV, Ферментативная поведение в стадии respiro ферментативную не затрагивается. Однако было отмечено снижение в процессе дыхания во время смены diauxic. Кроме того в концентрации 1000 мкм, RSV полностью предотвратили рост клеток.
Во втором эксперименте, клетки были дополнены с 10% глюкозы, концентрация, считается достаточным побудить Crabtree эффект в S. cerevisiae. Таким образом мы могли наблюдать эффект, способствует добавок различных концентраций NH4+ в бродильной метаболизма. Dt значения предложил что 0,13, 0.66 и 1.99% NH4+ пользу ферментативным метаболизм, и его можно наблюдать в кривых роста продлить эти концентрации экспоненциальной фазе культуры. Тем не менее на 3,31% мм NH4+, увеличение в значении Dt показал, что эта концентрация индуцирует respiro ферментативную метаболизма. Этот фенотип показан расширенный запаздывание фазы в кривых роста и более низкие темпы роста в экспоненциальной фазе (рис. 5).
В третьем эксперименте, клетки двух разных штаммов S. cerevisiae (W303 и WLP530) были выращены в различной концентрации сахарозы или галактозы проверить если эффекты источника углерода на значения Dt штамм зависимых. Ферментативная управления оба штаммы были выращены в 2% раствор глюкозы, а чтобы задать порог для бродильных роста были рассчитаны значения Dt . Ферментативная значения Dt , штаммы были разные, с ≤3.25 h W303 штамма и ≤6.84 h для WLP530 деформации. Таким образом важно подчеркнуть необходимость для проверки Dt порог для различных штаммов, используемых. Кроме того когда сахарозы был использован в качестве источника углерода, Ферментативная фенотип наблюдалась на 2% и 10% в обоих штаммов. Однако когда используется галактозы, штамм W303 не представила ферментативным поведение в любой концентрации, тестирование, в то время как штамм WLP530 показал ферментативным фенотип в 2% галактозы. Интересно, что штамм W303 вырос в все концентрации обоих источников углерода испытания. Хотя WLP530 деформации не показывают рост при низкой концентрации углерода используется (0,01%). Это может быть потому, что WLP530 используется в пивной отрасли и концентрации углерода, которым он подвержен обычно гораздо выше (Рисунок 6).
Вообще данные из этих трех экспериментов доказать, что кривых роста и кинетические параметры являются полезными для предварительного дискриминацию между дыхания и ферментативным роста в S. cerevisiae. Кроме того важно подчеркнуть, что это универсальный инструмент, который может быть использован в различных аспектах исследования метаболизма энергии.
Рисунок 1: Влияние концентрации различных глюкозы на S. cerevisiae роста фенотип. Кривые роста были построены путем измерения оптической плотности на 600 Нм каждые 30 мин в течение 48 часов. Когда клетки S. cerevisiae брожение, культур показали короткий запаздывание фазы и быстрые темпы роста экспоненциальной фазе. Этапа respiro ферментативную может сопровождаться роста замедления фаза (дыхательных), где производится путем ферментации этанола метаболизируется с помощью окислительного фосфорилирования путь, а затем достиг стационарной фазы. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Влияние вдыхаемых углерода источников на S. cerevisiae роста фенотип. Кривые роста были построены путем измерения оптической плотности на 600 Нм каждые 30 мин за 48 ч клеток S. cerevisiae показало длительное запаздывание фазы и медленный темп роста экспоненциальной фазе и обычно не показывают diauxic сдвиг. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Эффект источника углерода и его концентрация на кинетические параметры S. cerevisiae . () Dt значения S. cerevisiae BY4742 роста при различных углеродных источников; (b) значения μ S. cerevisiae BY4742 роста при различных концентрациях различных углеродных источников. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистические анализы были проведены с использованием односторонней ANOVA, следуют Дуннетт тест (*p < 0.01 против 2% раствор глюкозы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: влияние добавок ресвератрола на различных клеток энергии статусов. () рост фенотипа и μ значения с помощью 10% глюкозы; (b) роста фенотипа и μ значений с использованием 1% глюкозы. Данные из кривых роста представлены как среднее ± стандартная ошибка, и μ значения представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ для значения μ были проведены с использованием односторонней ANOVA, следуют Дуннетт тест [*p < 0.01 против. дыхательных путей управления с 2% глицерина (RC)]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Влияние сульфата аммония добавок на метаболизм энергии S. cerevisiae . Кривые роста были построены путем измерения оптической плотности на 600 Нм каждые 30 мин за 48 ч. представлены данные из кривых роста как среднее ± стандартная ошибка, и μ значения представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ для значений Dt были проведены с использованием односторонней ANOVA, следуют Дуннетт тест [* p < 0.01 против. дыхательных путей управления с 2% глицерина (RC)]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: эффект концентрации галактозы и сахарозы в ферментативным метаболизмом Saccharomyces cerevisiae. () Dt значения для W303 штамма и (b) Dt значения lab для промышленный штамм WLP530. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ для значений Dt были проведены с использованием односторонней ANOVA, следуют Дуннетт тест [* p < 0.01 против 2% раствор глюкозы (ферментативным управления)]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Много времени прошло с момента J. Monod10 выразил, что изучение роста бактериальных культур является основным методом микробиологии. Появление молекулярной инструменты задержки использования и изучения роста как техника. Несмотря на сложность роста, которая включает в себя множество взаимосвязанных процессов его основных механизмов можно охарактеризовать с помощью математической модели11. Это надежный подход, который может использоваться в качестве дополнительного инструмента для выяснения наиболее сложные молекулярные механизмы12.
Для получения надежных результатов от этого метода, важно рассмотреть следующие критические шаги. Агитации на 250 об/мин имеет решающее значение для достижения хорошего роста в низкоуглеродистых источников, которые оказывают дыхательных путей роста, так как при использовании нижней агитации скорости (150 – 180 об/мин) наблюдается снижение темпов роста в респираторных заболеваний. Важно инициировать протокол, используя свежий запас, и также важно для поддержания единообразного фенотип в анализов. Кинетика роста пороговые значения различаются среди штаммов и должны быть проверены по условию для использования в анализов. GraphPad Призма программное обеспечение предлагается потому, что уравнение экспоненциальный рост уже предустановленной; Однако любое другое программное обеспечение подходит, условии, что она позволяет программирования экспоненциальный рост уравнения. В микроплиты, рекомендуется включить три скважины с 150 мкл питательных сред без посевным материалом — это элемент управления, указывающее, если Гонав скважин пострадали от загрязнения.
Важно указать, что печати данных ОД на линейной шкале могут сделать его трудно определить фазы логарифмического роста. Эту проблему можно преодолеть путем построения ОД данных в масштабе журнала, так что хорошо видны лаг-фаза и фаза логарифмического роста.
Этот протокол используется только для экрана фенотип, поэтому должны быть подтверждены специфические эффекты на митохондриальной дыхания и брожения. Мы рекомендуем количественная оценка митохондриальное дыхание кислородом потребления анализов13,14, в то время как брожение может определяться накопление субпродукты например ацетат, сукцинат, глицерин и этанола9 .
S. cerevisiae роста служил в качестве средства для понимания молекулярных механизмов и фенотипы, с методами от скрининга для тестирования assays. Тем не менее, многочисленные экспериментальные проекты в литературе служит рост дрожжей только качественных параметров (например, плиты разведениях или кривых роста), так что занятости этих методов не учитывает ценные доказательства. Например кислород в агар пластин, используемых для подсчета микробной популяции или серийных разведений ограничен, осложняющих измерение роста при респираторных заболеваний. Кроме того когда две или более ячеек остаются прикрепленными к друг другу, наблюдается только одна колония. Еще одним ограничением является использование кривых роста как визуальный результат для выделения различий в темпах роста, который может оставить в стороне факты о тонкие различия. Таким образом перевод информации роста количественных параметров позволяет достижение точных данных о оказывали фенотип. Тем не менее математическое представление роста является сложным научным предприятием. Большинство исследований изучить полный рост (ЛАГ, журнал и стационарной фазы) микроорганизмов, получение полиномиальных уравнений высокого порядка, которые служат только один состояния окружающей среды. Несмотря на относительную простоту при расчете коэффициентов этих уравнений методом линейной регрессии трудно назначить их неотъемлемое биологическое значение15. Анализ роста путем разделения фаз роста математически надежной и простой. Примером этого является уравнение экспоненциальный рост, который основан на кинетике первого порядка и хорошо сочетается с короткой задержки фазы и экспоненциальной фазе.
Наконец изучая этапа журнала, используя уравнение экспоненциальный рост является последовательный метод понять влияние митохондриальное дыхание или ферментации на конкретного соединения или окружающей среды. Как доказательство концепции квантификации роста в экспоненциальной фазе продемонстрировал, что RSV конкретно затрагивает дыхания рост13,14. Здесь роста служил в качестве ценного инструмента для выявления RIM15 удаления вероятно улучшает ферментативным метаболизм ингибитированием частичное дыхание потенциала в S. cerevisiae9. Эти данные подтверждают, что наблюдения роста позволяет для изучения ферментативной и дыхательных метаболизмом и это простой и надежный метод. Следовательно такой подход позволяет для проверки воздействия конкретного вещества на митохондриальное дыхание или ферментации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан, предоставляет Consejo Nacional de науки y Tecnología (Грант № 293940) и Фонд "Телмекс"-TELCEL (Грант № 162005585), оба с ИКОМ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction? Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
