Summary
Aquí presentamos un protocolo para estimar el metabolismo respiratorio y fermentativo encajando el exponencial crecimiento de Saccharomyces cerevisiae a la ecuación de crecimiento exponencial. Cálculo de los parámetros cinéticos permite la proyección de la influencia de compuestos de sustancias en fermentación o respiración mitocondrial.
Abstract
Las células de Saccharomyces cerevisiae en la fase exponencial sostienen su crecimiento mediante la producción de ATP por fermentación o respiración mitocondrial. La concentración de carbono fermentables principalmente gobierna cómo las células de levadura generan ATP; por lo tanto, la variación en los niveles de carbohidratos fermentables impulsa el metabolismo energético de S. cerevisiae. Este papel describe un método de alto rendimiento basado en el crecimiento exponencial de la levadura para estimar los efectos de los cambios de la concentración y naturaleza de la fuente de carbono sobre el metabolismo respiratorio y fermentativo. El crecimiento de S. cerevisiae es medido en una microplaca o sacudirse cónico matraz mediante la determinación de la densidad óptica (OD) a 600 nm. Entonces, una curva de crecimiento es construida por OD trazado frente al tiempo, que permite la identificación y selección de la fase exponencial y está equipado con la ecuación de crecimiento exponencial para obtener parámetros cinéticos. Las tasas de crecimiento bajo con tiempos de duplicación superiores generalmente representan un crecimiento respiratorio. Por el contrario, mayores tasas de crecimiento específico con menores tiempos de duplicación indican crecimiento fermentativo. Valores umbral de duplicar el tiempo y la tasa de crecimiento específico se calculan usando condiciones respiratorias o fermentativas bien conocidas, tales como fuentes de carbono no fermentables o altas concentraciones de azúcares fermentables. Esto se obtiene de cada cepa específica. Por último, los parámetros cinéticos calculados se comparan con los valores de umbral para establecer si la levadura demuestra crecimiento fermentativo o respiratorio. La ventaja de este método es su relativa sencillez para la comprensión de los efectos de un compuesto de sustancia en el metabolismo fermentativo o respiratorio. Es importante destacar que el crecimiento es un proceso intrincado y complejo biológico; por lo tanto, los datos preliminares de este método deben ser corroborados por la cuantificación del consumo de oxígeno y la acumulación de subproductos de la fermentación. Por lo tanto, esta técnica puede utilizarse como una proyección preliminar de compuestos/sustancias que pueden alterar o mejorar el metabolismo fermentativo o respiratorio.
Introduction
Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae ha servido como una herramienta valiosa para identificar decenas de mecanismos fisiológicos y moleculares. Crecimiento se mide principalmente por tres métodos: diluciones seriadas para pruebas de punto, unidad formadora de colonias contando y las curvas de crecimiento. Estas técnicas se pueden utilizar solo o en combinación con una variedad de sustratos, condiciones ambientales, mutantes y productos químicos para investigar las respuestas específicas o fenotipos.
La respiración mitocondrial es un proceso biológico en el cual cinética de crecimiento se ha aplicado con éxito para descubrir mecanismos desconocidos. En este caso, la suplementación del medio de crecimiento con carbono no fermentables fuentes tales como el glicerol, el lactato o el etanol (que se metabolizan exclusivamente por la respiración mitocondrial), como la única fuente de carbono y energía permite evaluar la crecimiento respiratorio, que es importante detectar las perturbaciones en la fosforilación oxidativa actividad1. Por otro lado, es complicado usar modelos cinéticos de crecimiento como un método para descifrar los mecanismos detrás de la fermentación.
El estudio de la fermentación y la respiración mitocondrial es fundamental para dilucidar los mecanismos moleculares detrás de ciertos fenotipos como el Crabtree y Warburg efectos2,3. El efecto Crabtree se caracteriza por un aumento del flujo glicolítico, la represión de la respiración mitocondrial y el establecimiento de la fermentación como la vía primaria para generar ATP en presencia de altas concentraciones de carbohidratos fermentables (> 0,8 mM)4,5. El efecto de Warburg es metabólicamente análogo al efecto Crabtree, con la diferencia que en células de mamíferos, el principal producto de la fermentación es lactato6. De hecho, el efecto de Warburg es exhibido por una variedad de células cancerosas, provocando la absorción de glucosa y consumo incluso en presencia de oxígeno7. De tal modo, estudiando la base molecular de la cambio de respiración a la fermentación en el efecto Crabtree tiene repercusiones biotecnología (producción de etanol) e impactos potenciales en la investigación del cáncer.
Crecimiento de S. cerevisiae puede ser una herramienta adecuada para estudiar los efectos de Crabtree y Warburg. Esta idea es basa en el hecho de que en la fase exponencial de la levadura, las vías central utilizadas para producir ATP son la respiración mitocondrial y la fermentación, que son esenciales para sostener el crecimiento. Por ejemplo, el crecimiento de S. cerevisiae está íntimamente relacionada con la función de las vías generadoras de ATP. En moléculas de S. cerevisiae, la respiración mitocondrial produce aproximadamente 18 ATP por molécula de glucosa, mientras que la fermentación sólo genera 2 moléculas de ATP, por lo tanto, se espera que la tasa de crecimiento tiene estrecha vínculos con las vías metabólicas la producción de ATP8. En este sentido, cuando la fermentación es la ruta principal para generar ATP, la levadura compensa la baja producción de ATP mediante el aumento de la tasa de absorción de la glucosa. Por el contrario, el consumo de glucosa por las células de levadura que utilizan la respiración mitocondrial como la principal fuente de ATP es bajo. Esto indica que es importante que la levadura a la disponibilidad de hidratos de carbono de sentido antes de determinar cómo se genera ATP. Por lo tanto, la disponibilidad de la glucosa desempeña un papel importante en el interruptor entre fermentación y respiración mitocondrial en S. cerevisiae. En presencia de altas cantidades de glucosa, la levadura prefiere la fermentación como la ruta central para generar ATP. Curiosamente, cuando la fermentación de la levadura, la tasa de crecimiento se mantiene en su máximo. Por otra parte, bajo niveles bajos de glucosa, S. cerevisiae produce ATP utilizando la respiración mitocondrial, manteniendo tasas de crecimiento. Por lo tanto, variación en la concentración de la glucosa y el uso de otras fuentes de carbono inducir cambios en la preferencia de la levadura entre el crecimiento fermentativo y respiratorio. Teniendo en cuenta este hecho con la ecuación de crecimiento exponencial, se puede obtener el significado biológico de parámetros cinéticos como la duplicación de tiempo (Dt) y tasa de crecimiento específico (μ). Por ejemplo, se encontraron menores valores de μ cuando la levadura utiliza la respiración mitocondrial como la vía principal. Por el contrario, bajo condiciones que favorecen la fermentación, se encontraron valores más altos de μ . Esta metodología puede utilizarse para medir los probables mecanismos de sustancias químicas que afectan a la fermentación y la respiración mitocondrial en S. cerevisiae.
El objetivo de este trabajo es proponer un método basado en la cinética de crecimiento para la detección de los efectos de un determinada sustancia/compuesto sobre la respiración mitocondrial o fermentación.
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Protocol
1. medios de cultivo y preparación del inóculo
- Preparar 100 mL de medio líquido de 2% levadura extracto-peptona-dextrosa (YPD) (agregue 1 g de levadura extracto, 2 g de peptona de caseína, y 2 g de glucosa a 100 mL de agua destilada). Pipetear 3 mL de los medios de comunicación en esterilizable tubos cónicos de 15 mL. Autoclave de los medios de comunicación durante 15 min a 121 ° C y 1.5 psi.
Nota: Los medios de comunicación pueden conservarse hasta un mes en 4 – 8 ° C. - Inocular un tubo cónico con 3 mL de fresco caldo YPD 2% estéril con 250 μL de células de S. cerevisiae conservadas en glicerol a-20 ° C. Incubar durante una noche en un agitador orbital a 30 ° C con agitación a 200 rpm.
- Racha de un plato de Petri (60 x 15 mm2) lleno de estéril agar YPD al 2% (agregue Extracto de 10 g de levadura, 20 g de peptona de caseína, 20 g de glucosa, y 20 g de agar bacteriológico a 1.000 mL de agua destilada) con las células en el tubo cónico con un asa estéril. Incubar la placa de Petri a 30 ° C hasta que las colonias aisladas muestran crecimiento.
- Preparar el inóculo previo al inocular una colonia aislada solo en un tubo cónico con 10 mL de fresco caldo YPD 2% estéril e incubar durante la noche a 30 ° C con agitación a 200 rpm.
2. medios de cultivo y las curvas de crecimiento en microplaca
- Preparar 10 mL de caldo YPD 1% (agregar 0.1 g de levadura extracto, 0,2 g de peptona, y 0,1 g de glucosa en 10 mL de agua destilada), 10 mL de caldo YPD 2% (agregue 0.1 g de levadura extracto, 0,2 g de peptona, y 0,2 g de glucosa en 10 mL de agua destilada) y 10 mL de caldo YPD 10% (agregue 0.1 g de levadura extracto, 0,2 g de peptona, y 1 g de glucosa en 10 mL de agua destilada). Autoclave de estos medios de crecimiento durante 15 min a 121 ° C y 1.5 psi.
Nota: Los medios de cultivo sirve como control de crecimiento fermentativo. - Preparar 10 mL de caldo de (YPE) 2% levadura peptona-extracto-etanol y 10 mL de caldo de 2% levadura peptona-extracto-glicerol (YPG). 2% YPE: Añadir 0.1 g de levadura extracto, 0,2 g de peptona, y 0,2 mL de etanol a 10 mL de agua destilada. 2% YPG: Añadir 0.1 g de levadura extracto, 0,2 g de peptona, y 0,2 mL de glicerol al 10 mL de agua destilada. Autoclave de estos medios de crecimiento durante 15 min a 121 ° C y 1.5 psi.
Nota: La glicerina y etanol son fuentes de carbono no fermentables que se metabolizan exclusivamente por la respiración mitocondrial. Por esta razón, se utilizan como un control de crecimiento respiratorio. En este paso, pueden cambiarse el tipo y concentración de fuente de carbono en los medios de cultivo para probar los efectos en el fenotipo de crecimiento utilizando como base el caldo de peptona extracto (YP) de levadura (10 g de extracto de levadura y 20 g de peptona de caseína en 1.000 mL de agua destilada). Para probar los efectos de otros nutrientes además de carbono, sintético medio completo de (SC) es complementado según el objetivo del experimento. La base de medio SC es 1,8 g de levadura nitrógeno base sin aminoácidos, 5 g de sulfato de amonio [(NH4)2SO4], 1,4 g de fosfato monosódico (NaH2PO4), y 2 g de abandono en 1.000 mL de agua destilada. Suplemento de los medios de comunicación con una fuente de carbono y fuente de nitrógeno adicional en las concentraciones necesarias. - Añadir 145 μL de medio de cultivo adecuado para el diseño experimental en cada pocillo de una microplaca estéril (10 x 10-bien) con una tapa e inocular con 5 μL del inóculo antes.
Nota: Si el objetivo es detectar la influencia de compuestos de sustancias en el metabolismo energético de la levadura, debe agregarse sustancia/compuesto durante este paso. También, cualquier tipo de microplaca con tapa debe ser útil. - Incube la placa varios pocillos en un lector de microplacas a 30 ° C con agitación constante a 200 rpm por 48 h. medir la densidad óptica (OD) a 600 nm cada 30 o 60 minutos.
Nota: Si el lector de microplacas no tiene la opción de Incube las microplacas, pueden ser incubado en un agitador orbital en las mismas condiciones entre cada medición del OD.
3. crecimiento curvas en matraces cónicos de sacudido
- Añadir 4,8 mL de los medios de cultivo adecuados para autoclave y matraces 20 mL. Inocular cada frasco con 200 μL de la cultura pre-inóculo en OD600 nm ~ 2 en fresco, estéril 2% caldo YPD. Incúbelos a 30 ° C con agitación constante a 250 rpm por 24 h.
Nota: Si el período de incubación es superior a 24 h, añadir 12 mL de los medios de cultivo adecuados para autoclave y matraces de 50 mL. Les inocule con 500 μL del inóculo antes. También es importante considerar el crecimiento fermentativo controles (media YP con glucosa 1%, 2% o 10%) y controles de crecimiento respiratorio (medios YP con glicerol de 2% o etanol). - Tomar 100 μL de la cultura sacudido frasco cónico y diluirlo en 900 μL de agua destilada en una cubeta del espectrofotómetro 1 mL y suavemente mezclar mediante pipeteo. Medir la do a 600 nm usando un espectrofotómetro cada 2 h. Para obtener la do real, multiplique el resultado por diez.
4. procesamiento de datos y cálculo de parámetros cinéticos
-
Crear un nuevo archivo de proyecto en el software de paquete estadístico. En la sección de "nueva tabla y el gráfico", elija la opción "XY" .
- Seleccione la opción: "Comenzar con una tabla de datos vacía" en la sección "Datos de ejemplo" .
- Seleccione el tipo de gráfico "Puntos y línea de conexión" . Dejar la sección de "X" no seleccionada en el segmento de "Subcolumns de repeticiones o valores de error", y en la "Y" sección seleccionar la opción: "Ingresar valores repetidos (10) en subcolumns de lado a lado y parcela media y Error". Haga clic en el botón crear.
Nota: El formato de tabla tiene una columna de X y varias columnas Y, cada uno con el 10 subcolumns elegidos previamente.
- Escribir la hora en que OD se tomaron medidas en la columna de X (por ejemplo, 0, 30, 60, 90 min o 0, 1, 1.5, 2 h). En las columnas Y escriba los valores de OD obtenidos de las culturas.
- Identificar la fase de crecimiento exponencial transformar datos de la columna Y de logaritmos. Haga clic en el botón "Analizar" , elige el análisis de "Transformar" , seleccione valores Y usando Y = Log(Y). Ir a la "Galería de resultados", seleccione "Transformar" la tabla de datos, haga clic en el botón "Analizar" y escoge " regresión lineal". Excluir los valores de OD que no siguen un comportamiento lineal. Para excluir los valores, seleccione en la tabla de datos y escriba "Ctrl + E".
Nota: Es importante excluir los valores que no sigan la fase exponencial, ya que la ecuación de crecimiento exponencial se adapta bien a la fase exponencial. - En la "Galería de tablas de datos", seleccione la tabla de datos "datos 1". Haga clic en el botón "Analizar" y elige el análisis de la "Regresión no lineal (ajuste de la curva)" entre el "análisis XY".
- Seleccione los conjuntos de datos a analizar y haga clic en el botón "OK" . En la ficha "Fit" elija la sección de "Ecuación exponencial" y seleccione la "ecuación de crecimiento exponencial" (donde X es la concentración de células, X0 es la concentración de células a tiempo cero, μ es la tasa de crecimiento específico, y t es el tiempo). Utilizar el "ajuste de mínimos cuadrados" como un método de ajuste y deje sin seleccionar la sección de interpolar. Haga clic en el botón "OK" .
Nota: La ficha con los resultados de forma no lineales está en la "Galería de resultados". El software calcula doblaje tiempo (Dt) y específicas de crecimiento (μ). El software muestra μ K en la pestaña resultados. - Abra un nuevo archivo de proyecto y en la sección "nueva tabla y gráfico" , seleccionar la opción columna. Elige la opción "Inicio con una tabla de datos vacía" y seleccione la gráfica deseada. Elija representar la media con el SD. Seleccione el botón "Crear" .
- Copiar el μ o Dt los valores de la ficha de resultados de forma no lineal que se encuentra en la "Galería de resultados" y pegarlos en una columna. Por último, seleccione el botón "Analizar" y elegir el análisis deseado en la sección de "Análisis de la columna" para comparar los parámetros cinéticos de las diferentes condiciones nutrimentales.
Nota: Los parámetros cinéticos obtienen de los controles de crecimiento fermentativo (media YP con glucosa 1%, 2% o 10%) y controles de crecimiento respiratorio (medios YP con glicerol de 2% o etanol) ayuda a establecer el umbral de la respiración mitocondrial y fermentativa, respectivamente. Comparando el cinético parámetros de la condición nutricional y sustancia/compuesto ensayaron con el crecimiento fermentativo y respiratorio ayudan a identificar el posible efecto sobre el metabolismo fermentativo o respiratorio.
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Representative Results
Las curvas de crecimiento pueden utilizarse para diferenciar preliminarmente los fenotipos respiratorios y fermentativos de la levadura S. cerevisiae . Por lo tanto, se realizaron cultivos batch de S. cerevisiae (BY4742) con concentraciones diferentes de glucosa que se han divulgado para inducir el crecimiento fermentativo: 1%, 2% y 10% (w/v)9. Las culturas que muestran un fenotipo fermentativo tienen un pequeño retraso y una fase exponencial con una alta tasa de crecimiento (figura 1). Etanol, glicerol y lactato son las fuentes de carbono que pueden ser metabolizadas sólo a través de la respiración; así, se realizaron cultivos de la levadura utilizando las fuentes de carbono. Culturas que obtención energía por fosforilación oxidativa demostraron una fase lag más larga y lenta tasa de crecimiento durante la fase exponencial (figura 2).
Análisis de las curvas de crecimiento proporciona sólo información cualitativa; por lo tanto, es importante calcular los parámetros cinéticos para obtener información cuantitativa. Se calculó el Dt y μ utilizando la ecuación de crecimiento exponencial (figura 3). Establecemos un umbral de valores de crecimiento respiratorio en Dt ≥11.5 h y μ ≤0.059 / h. El umbral para el crecimiento fermentativo se fijó en Dt ≤6. 5 h y μ ≥0.149 / h (figura 3).
Para demostrar la utilidad de esta herramienta de evaluación diseñamos tres experimentos, con el primero para evaluar los efectos de las concentraciones de resveratrol diferentes (RSV) en células de S. cerevisiae BY4742 con diverso estado energético (figura 4) en frascos de sacudido. El segundo experimento se pretende detectar los efectos de concentraciones diferentes sulfato de amonio (NH4+) en el metabolismo energético de S. cerevisiae BY4742 (figura 5) en una microplaca. Por último, el tercero pretende ilustrar cómo los cambios en la fuente de carbono afectan crecimiento fermentativo de dos diferentes cepas de S. cerevisiae (W303 y el industrial WLP530 utilizar para la fermentación de la cerveza) (figura 6). En el experimento con RSV, el estado energético de la célula fue modificado variando la concentración de glucosa. En el 10% de glucosa, todas las concentraciones de RSV probadas no cambió la fase respiro-fermentativo de la levadura pero disminuir la fase respiratoria (durante el turno de la diauxic, S. cerevisiae metaboliza el etanol producido durante la fase exponencial de fosforilación oxidativa). Los valores μ confirmaron que bajo todas las condiciones probadas, S. cerevisiae mostraron comportamiento fermentativo, contrario a su fenotipo cuando se cultiva en 2% de glicerol (condición usada como un control respiratorio) (figura 4a). Cuando las células se energizaron con sólo 1% de la glucosa, los valores μ confirman que a 0.1, 1, 10 y 100 μm RSV, comportamiento fermentativo en la fase de respiro-fermentativo no fue afectado. Sin embargo, se observó una disminución en la fase respiratoria durante la diauxic cambio. Por otra parte, en una concentración de 1.000 μm, RSV completamente había inhibido el crecimiento celular.
En el segundo experimento, las células fueron complementadas con glucosa 10%, una concentración que se considera suficiente para inducir el efecto Crabtree en S. cerevisiae. Por lo tanto, pudimos observar el efecto promovido por la suplementación de diferentes concentraciones de NH4+ en metabolismo fermentativo. Valores de Dt sugirieron 0.13, 0.66 y metabolismo fermentativo de 1.99% NH4+ favor, y se puede observar en las curvas de crecimiento que estas concentraciones habían extendido fase exponencial de la cultura. Sin embargo, a 3.31% mM NH4+, un incremento en el valor de Dt mostró que esta concentración induce un metabolismo respiro-fermentativo. Este fenotipo demostró una fase de retraso prolongado en la curvas de crecimiento y tasa de crecimiento más lento en la fase exponencial (figura 5).
En el tercer experimento, las células de dos diferentes cepas de S. cerevisiae (W303 y WLP530) fueron cultivadas en diferentes concentraciones de sacarosa o galactosa para probar si los efectos de la fuente de carbono en Dt los valores fueron dependiente de la cepa. Como un control fermentativo, ambas cepas fueron cultivadas en 2% de glucosa, y se calcularon los valores de Dt para establecer un umbral para el crecimiento fermentativo. La fermentación Dt los valores de las cepas fueron diferentes, con ≤3.25 h para la cepa W303 y ≤6.84 h para la WLP530 tensión. Por lo tanto, es importante destacar la necesidad de validar el umbral Dt para las diferentes cepas utilizadas. Por otra parte, cuando sacarosa fue utilizada como la fuente de carbono, un fenotipo fermentativo se observó en 2% y 10% en ambas cepas. Sin embargo, cuando se utilizó la galactosa, la cepa W303 no mostraron comportamiento fermentativo en cualquiera de las concentraciones probadas, mientras que la cepa de WLP530 demostró un fenotipo fermentativo en galactosa 2%. Curiosamente, la cepa W303 creció en todas las concentraciones de ambas fuentes de carbón probadas. Sin embargo, la cepa de WLP530 no mostraron crecimiento en la menor concentración de carbono utilizado (0.01%). Esto puede ser porque WLP530 se utiliza en la industria de la cerveza y las concentraciones de carbono al que está expuesto son generalmente mucho más alta (figura 6).
En conjunto, los datos de estos tres experimentos demuestran que las curvas de crecimiento y parámetros cinéticos son útiles para la discriminación preliminar entre el crecimiento fermentativo y respiratorio en S. cerevisiae. También, es importante destacar que se trata de una herramienta versátil que puede utilizarse en diferentes aspectos de la investigación del metabolismo de energía.
Figura 1: Efecto de las concentraciones de glucosa diferentes en fenotipo de crecimiento de S. cerevisiae . Las curvas de crecimiento fueron construidas midiendo la densidad óptica a 600 nm cada 30 min durante 48 h. Cuando las células de S. cerevisiae fermentan, culturas mostraron una fase lag corto y rápido crecimiento durante la fase exponencial. La fase de respiro-fermentativo podría seguida de una fase de desaceleración de crecimiento (fase respiratoria), donde se metaboliza el etanol producido por fermentación mediante la vía de la fosforilación oxidativa, luego se alcanza la fase estacionaria. Datos se presentan como el media ± error de estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efecto de fuentes de carbono respirable en fenotipo de crecimiento de S. cerevisiae . Las curvas de crecimiento fueron construidas midiendo la densidad óptica a 600 nm cada 30 min para 48 h. células de S. cerevisiae mostró una fase lag prolongado y la tasa de crecimiento lento durante la fase exponencial y no muestran generalmente un diauxic cambio. Datos se presentan como el media ± error de estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Efecto de fuente de carbono y su concentración en los parámetros cinéticos de S. cerevisiae . (a) Dt los valores de crecimiento de S. cerevisiae BY4742 en fuentes de carbono diferentes; valores μ (b) del crecimiento de S. cerevisiae BY4742 bajo diferentes concentraciones de fuentes de carbono diferentes. Datos se presentan como la media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un ANOVA de una vía seguido de prueba de Dunnett (*p < 0.01 vs. 2% de glucosa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: efecto de la suplementación con resveratrol en Estados de energía de celda diferentes. (un) crecimiento fenotipo y μ valores usando glucosa 10%; (b) crecimiento fenotipo y μ valores usando 1% de glucosa. Datos de las curvas de crecimiento se presentan como el media ± error de estándar, y se presentan los valores μ como la media ± desviación estándar. Análisis estadísticos para los valores μ se realizaron utilizando un ANOVA de una vía seguido de prueba de Dunnett [*p < control respiratorio vs 0,01. con 2% de glicerol (RC)]. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efecto de la suplementación con sulfato de amonio en el metabolismo energético de S. cerevisiae . Se construyeron curvas de crecimiento mediante la medición de la densidad óptica a 600 nm cada 30 min para 48 h. datos de curvas de crecimiento se presentan como el media ± error de estándar, y se presentan los valores μ como la media ± desviación estándar. Análisis estadísticos para los valores de Dt se realizaron utilizando un ANOVA de una vía seguido de prueba de Dunnett [* p < control respiratorio vs 0,01. con 2% de glicerol (RC)]. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: efecto de la concentración de galactosa y sacarosa en el metabolismo fermentativo de cerevisiae del Saccharomyces. (a) Dt los valores de los W303 lab cepa (b) Dt valores y para la cepa industrial WLP530. Datos se presentan como la media ± desviación estándar. Análisis estadísticos para los valores de Dt se realizaron utilizando un ANOVA de una vía seguido de prueba de Dunnett [* p < 0.01 vs. 2% de glucosa (control fermentativo)]. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mucho tiempo ha pasado desde que J. Monod10 expresa que el estudio del crecimiento de cultivos bacterianos es el método básico de la microbiología. El advenimiento de las herramientas moleculares retrasa el uso y el estudio del crecimiento como una técnica. A pesar de la complejidad de crecimiento que involucra numerosos procesos relacionados entre sí, sus mecanismos subyacentes pueden describirse mediante el uso de modelos matemáticos11. Se trata de un enfoque robusto que puede utilizarse como herramienta complementaria para dilucidar los mecanismos moleculares más complejas12.
Para obtener resultados confiables de este método, es importante considerar los siguientes pasos críticos. Agitación a 250 rpm es fundamental para lograr buen crecimiento en fuentes de baja emisión de carbono que ejercen el crecimiento respiratorio, ya que al utilizar menores velocidades de agitación (150 – 180 rpm) se observó crecimiento en afecciones respiratorias. Es importante iniciar el protocolo que emplea una acción fresca y también es esencial para mantener un fenotipo uniforme en los ensayos. Valores de umbral de la cinética de crecimiento varían entre cepas y deben ser validados según la condición para ser utilizado en los ensayos. El software GraphPad Prism se propone porque la ecuación de crecimiento exponencial ya está cargada; sin embargo, cualquier otro software es conveniente, siempre permite la programación de la ecuación de crecimiento exponencial. En la microplaca, se recomienda incluir tres pozos con 150 μL de medio de crecimiento sin inóculo, este es un control que indica si los pozos de la microplaca han sufrido contaminación.
Es importante indicar que trazar los datos de OD en una escala lineal puede hacerlo duro determinar la fase de crecimiento logarítmico. Este problema se puede superar mediante la representación de los datos de OD en una escala logarítmica para que fase lag y la fase de crecimiento logarítmico son claramente visibles.
Este protocolo es utilizado para detectar un fenotipo, por lo que deberán confirmarse los efectos específicos sobre la fermentación y la respiración mitocondrial. Se recomienda la cuantificación de la respiración mitocondrial de oxígeno consumo ensayos13,14, mientras que la fermentación puede ser determinada por la acumulación de subproductos como el acetato, succinato, glicerina y etanol9 .
Crecimiento de S. cerevisiae ha servido como un medio para la comprensión de mecanismos moleculares y fenotipos, con métodos de detección a las pruebas de ensayos de. Sin embargo, numerosos diseños experimentales en la literatura usan levadura crecimiento sólo como parámetro cualitativo (por ejemplo, diluciones de placa o curvas de crecimiento), por lo que el empleo de estas técnicas descuida evidencia valiosa. Por ejemplo, el oxígeno disponible en placas de agar utilizadas para el recuento de población microbiana o haciendo diluciones de la serie es limitado, que complica la medición de crecimiento en condiciones respiratorias. Además, cuando dos o más células quedan conectadas entre sí, se observa sólo una colonia. Otra limitación es el uso de las curvas de crecimiento como resultado visual para resaltar diferencias en el crecimiento, que puede dejar a un lado datos sobre diferencias sutiles. Por lo tanto, la traducción de la información de crecimiento en parámetros cuantitativos permite la consecución de datos precisos sobre el fenotipo ejercido. Sin embargo, la representación matemática del crecimiento es una complicada empresa científica. Mayoría de estudios examina crecimiento completo (lag, registro y fases estacionarias) de los microorganismos, obtención de ecuaciones polinómicas de orden superior que sólo sirven una condición ambiental. A pesar de la relativa simplicidad en el cálculo de los coeficientes de estas ecuaciones por regresión lineal, es difícil asignar a un significado biológico inherente15. El análisis del crecimiento por separación de fases de crecimiento es matemáticamente fiable y sencillo. Un ejemplo de esto es la ecuación de crecimiento exponencial, que se basa en la cinética de primer orden y se adapta bien a una fase exponencial y fase de retardo corto.
Por último, estudiar la fase de registro utilizando la ecuación de crecimiento exponencial es un método coherente para comprender la influencia de la respiración mitocondrial o fermentación en un compuesto específico o medio ambiente. Como una prueba de concepto, cuantificación del crecimiento en la fase exponencial demostró que RSV específicamente afecta crecimiento respiratorio13,14. Aquí, crecimiento sirve como una herramienta valiosa para identificar que RIM15 supresión probable mejora metabolismo fermentativo por inhibición parcial de la capacidad de respiración en S. cerevisiae9. Estos datos corroboran que observación de crecimiento permite el estudio de los metabolismos fermentativos y respiratorios y es un método simple y confiable. Por lo tanto, este enfoque permite para la detección de los efectos de una sustancia específica en la respiración mitocondrial o fermentación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (número 293940) y Fundación TELMEX-TELCEL (número 162005585), ambos a IKOM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
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