Summary
Burada solunum ve fermantatif metabolizma Saccharomyces cerevisiae üstel büyüme üstel büyüme Denklem için yaklaştırarak tahmin etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Kinetik parametrelerin hesaplanması maddeler/bileşikler etkileri fermantasyon veya mitokondrial solunum testi ile taranması için izin verir.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae hücreleri veya üssel faz olarak onların büyüme fermantasyon ve/veya mitokondrial solunum ATP üreten sürdürmek. Fermente karbon konsantrasyonu esas olarak Maya hücreleri ATP oluşturmak nasıl yönetir; Böylece, fermente karbonhidrat düzeyleri varyasyon S. cerevisiaeenerjik metabolizma kullanıyor. Bu kağıt toplama değişikliklerin etkisini ve solunum ve fermantatif metabolizmasına karbon kaynağı niteliği tahmin etmek için üstel Maya büyüme dayalı yüksek üretilen iş yöntemi açıklanır. S. cerevisiae büyüme bir Mikroplaka ölçülen veya konik sarsıldı 600 optik yoğunluk (OD) malzemelerini şişesi nm. Sonra bir büyüme eğrisi zaman, hangi kimlik ve üssel faz yelpazesi sağlar ve üstel büyüme denklemle kinetik parametrelerin elde etmek için monte karşı çizdirme OD tarafından inşa edilmiştir. Düşük belirli büyüme oranları daha yüksek katlama süreler genellikle solunum büyüme temsil eder. Buna karşılık, daha yüksek belirli büyüme oranları daha düşük katlama kez fermantatif büyüme gösterir. Zaman ve belirli büyüme oranı iki katına eşik değerleri fermente karbon kaynakları veya daha yüksek konsantrasyonlarda fermente şekerler gibi iyi bilinen solunum veya fermantatif koşullar kullanarak tahmin edilir. Bunun için belirli her zor elde edilir. Son olarak, hesaplanan kinetik parametrelerin Maya fermantatif ve/veya solunum büyüme gösterip göstermediğini kurmak için eşik değerleri ile karşılaştırılır. Bu yöntemin avantajı fermantatif veya solunum metabolizma bir madde/bileşik etkilerini anlamak için göreli basitliğidir. Büyüme karışık ve karmaşık bir biyolojik süreç olduğunu vurgulamak önemlidir; Bu nedenle, bu yöntem ilk veri oksijen tüketim miktar ve fermantasyon yan birikimi tarafından corroborated gerekir. Böylece, bu teknik bileşikler/maddeler rahatsız ya da fermantatif veya solunum metabolizma artırmak bir ön elemeyi olarak kullanılabilir.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae büyüme fizyolojik ve moleküler mekanizmaları onlarca tanımlamak için değerli bir araç hizmet vermiştir. Büyüme öncelikle üç yöntemlerle ölçülen: spot test, koloni oluşturan birim sayma ve büyüme eğrileri seri dilutions. Bu teknikler belirli yanıtlar veya fenotipleri araştırmak için tek başına veya birlikte çeşitli yüzeyler, çevre koşulları, mutantlar ve kimyasallar ile kullanılabilir.
Mitokondrial solunum içinde büyüme kinetik başarıyla bilinmeyen mekanizmaları keşfetmek için uygulanmış olan biyolojik bir süreçtir. Bu durumda, tek karbon ve enerji kaynağı değerlendirmek için izin verdiğinden takviyesi ile fermente karbon büyüme ortamının gliserol, laktat veya (ki sadece mitokondrial solunum tarafından metabolize) etanol gibi kaynakları Solunum büyüme, tedirginlikler Oksidatif fosforilasyon faaliyet1' algılamak önemlidir. Diğer taraftan, fermantasyon arkasında mekanizmaları deşifre bir yöntem olarak büyüme kinetik modelleri kullanmak karmaşıktır.
Fermantasyon ve mitokondrial solunum Crabtree ve Warburg etkileri2,3gibi belirli fenotipleri arkasında moleküler mekanizmaları aydınlatmak için esastır. Crabtree etkisi ile karakterize bir artış glycolytic akı, baskı mitokondrial solunum ve fermantasyon ATP fermente karbonhidrat yüksek konsantrasyonda huzurunda oluşturmak için birincil yolu olarak kurulması (> 0.8 mM)4,5. Memeli hücrelerinde, ana, fermantasyon laktat6ürünü Warburg etkisi metabolik olarak Crabtree etkisi farkı ile analog bu olmak. Gerçekten de, kanser hücrelerinin, Glikoz alımı ve tüketimi bile oksijen7huzurunda uyarının harekete geçirilmesine karşılık çeşitli tarafından Warburg etkisi sergilenmektedir. Böylece, solunum geçiş Crabtree etkisi fermantasyon için moleküler temeli eğitim biyoteknolojik yankıları (etanol üretimi için) hem de olası etkileri kanser araştırma vardır.
S. cerevisiae büyüme Crabtree ve Warburg etkileri çalışmaya uygun bir araç olabilir. Maya üssel faz mitokondrial solunum ve fermantasyon, büyüme sürdürmek için gerekli olan ATP üretmek için kullanılan merkezi yolları vardır gerçeğine dayanarak bu fikir. Örneğin, S. cerevisiae gelişimini yakından ATP üretme yolları fonksiyonuyla ilişkilidir. Fermantasyon sadece 2 ATP molekülleri, üretir, ancak glukoz molekülü başına S. cerevisiae ' mitokondrial solunum üretir yaklaşık 18 ATP molekülleri, bu nedenle bu büyüme hızı metabolik yollar ile sıkı bağlantıları bulunmaktadır bekleniyor üreten ATP8. Fermantasyon ATP üretmek için ana yolu olduğunda, bu bağlamda, Maya düşük ATP üretimi için Glikoz alımı hızını artırarak dengeler. Aksine, mitokondrial solunum ana ATP kaynağı olarak kullanmak Maya hücreleri glikoz tüketiminden düşüktür. Bu ATP nasıl oluşturulacaklarını belirleme önce Maya duyu karbonhidrat durumu için önemli olduğunu gösterir. Bu nedenle, glikoz kullanılabilirlik fermantasyon ve mitokondrial solunum arasında geçiş içinde önemli bir rol oynar S. cerevisiae. Huzurunda yüksek miktarda glikoz Maya fermantasyon ATP üretmek için orta yol olarak tercih ediyor. İlginçtir, Maya fermantasyon belirli büyüme oranı, en yüksek seviyede korunur. Öte yandan, glikoz seviyesinin düşük altında S. cerevisiae düşük büyüme oranları koruyarak mitokondrial solunum, kullanarak ATP üretir. Böylece, toplama varyasyon glikoz ve diğer karbon kaynaklarının Maya'nın tercihi fermantatif ve solunum büyüme arasında değişimler ikna etmek. Üstel büyüme denklem bu gerçeği dikkate alarak, bir saat (Dt) ve belirli büyüme hızı (µ) iki katına gibi kinetik parametrelerin biyolojik anlamını elde edebilirsiniz. Örneğin, Maya birincil yolu mitokondrial solunum kullandığında alt µ değerleri bulunmuştur. Aksine, fermantasyon lehine koşullar altında yüksek µ değerleri bulunmuştur. Bu metodoloji fermantasyon ve mitokondrial Solunum etkileyen herhangi bir kimyasal muhtemel mekanizmaları ölçmek için kullanılabilir S. cerevisiae.
Bu kağıt amacı belirli bir madde/bileşik etkilerini mitokondrial solunum veya fermantasyon süzmek için büyüme kinetik esas alarak bir yöntemini teklif etmektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kültür Medya ve Inoculum hazırlık
- 100 mL % 2 maya özü-pepton-Dekstroz (YPD) sıvı orta hazırlamak (1 gr maya ekstresi, kazein pepton, 2 g ve 2 g glikoz için 100 mL distile su ekleyin). Medya 3 mL 15 mL edilemezler konik tüpler içine dağıtmak. Basınçlı kap 15dk 121 ° C ve 1,5 psi için medya.
Not: Medya bir ay 4-8 ° C'de depolanabilir - Serin steril % 2 YPD et suyu 3 mL gliserol-20 ° C'de korunmuş S. cerevisiae hücre 250 μL ile dolu bir konik tüp aşılamak Gecede 200 devirde ajitasyon ile bir orbital Shaker-30 ° C'de kuluçkaya.
- Petri kabına (60 x 15 mm2) steril % 2 YPD agar ile dolu çizgi (10 g maya ekstresi, kazein pepton, 20 g glikoz, 20 g ve 20 g bakteriyolojik agar için 1000 mL distile su ekleyin) bir kısır döngü kullanarak konik tüp içinde yetiştirilen hücreleri ile. İzole kolonilerin gelişim göstermek kadar 30 ° C'de Petri kabına kuluçkaya.
- 10 mL serin steril % 2 YPD et suyu ile dolu bir konik tüp içine izole bir koloni aşı öncesi inoculum hazırlamak ve bu gecede 200 devirde sürekli ajitasyon ile 30 ° C'de kuluçkaya.
2. Kültür Medya ve Mikroplaka büyüme eğrileri
- 10 mL % 1'ypd suyu hazırlamak (0,1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 0.1 g glikoz için 10 mL distile su ekleyin), % 2 YPD suyu 10 mL (0,1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 0.2 g glikoz için 10 mL distile su ekleyin) ve 10 mL % 10 YPD suyu (0,1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 1 g glikoz için 10 mL distile su ekleyin). Basınçlı kap 15dk 121 ° C ve 1,5 psi için bu büyüme ortamları.
Not: Kültür medya fermantatif büyüme bir denetim olarak hizmet vermektedir. - 10 mL % 2 maya özü-pepton-etanol (türü) suyu ve 10 mL % 2 maya özü-pepton-gliserol (YPG) suyu hazırlayın. % 2 türü: 0.1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve 10 mL etanol 0.2 mL distile su ekleyin. % 2 için YPG: 0.1 g maya ekstresi, pepton, 0.2 g ve gliserol 10 mL için 0.2 mL distile su ekleyin. Basınçlı kap 15dk 121 ° C ve 1,5 psi için bu büyüme ortamları.
Not: Gliserol ve etanol sadece mitokondrial solunum tarafından metabolize fermente karbon kaynakları vardır. Bu nedenle, onlar bir solunum büyüme denetimleri kullanılır. Bu adımda, maya özü-pepton (YP) suyu (10 g maya özü ve kazein pepton 1000 mL distile su içinde 20 g) bir üs olarak kullanarak büyüme fenotip üzerindeki etkilerini test etmek için karbon kaynağı Kültür medya konsantrasyon ve türünü değiştirilebilir. Karbon yanı sıra diğer besin etkilerini sınamak için sentetik tam (SC) orta denemenin amacı göre desteklenen. Maya azot temel amino asitler, 5 g amonyum sülfat 1.8 g için SC orta noktasıdır [(NH4)2SO4], monosodyum fosfat (NaH2PO4), 1.4 g ve 2 g bırakma 1000 mL distile su karışımı. Ek bir karbon kaynağı ve ek azot kaynağı gerekli konsantrasyonlarda ile medya. - Deneysel tasarım için uygun kültür ortamının 145 μL her şey bir kapak ile steril Mikroplaka (10 x 10-de) ekleyin ve onları ön inoculum 5 μL ile aşılamak.
Not: amaç maddeler/bileşikler etkisi Maya enerjik metabolizma ekran için ise, bu madde/bileşik bu adımı sırasında eklenmelidir. Ayrıca, bir kapak ile Mikroplaka her türlü yararlı olmalıdır. - 30 ° C'de Mikroplaka Okuyucu 48 h. ölçü 600 optik yoğunluk (OD) için 200 devirde sabit ajitasyon ile çok iyi plaka kuluçkaya nm her 30 veya 60 dak.
Not: Mikroplaka Okuyucu Mikroplaka kuluçkaya seçeneği varsa, bu bir orbital çalkalayıcı, OD her ölçüm arasında aynı koşulları içinde inkübe.
3. büyüme eğrileri sarsılmış konik şişeler içinde
- Uygun kültür ortamının 4,8 mL 20 mL konik şişeler ve basınçlı kap ekleyin. Her şişesi 200 μL OD600nm ~ 2 serin, steril % 2 YPD suyu içinde ön inoculum kültürünün ile aşılamak. Onları 24 h için 250 rpm sabit ajitasyon ile 30 ° C'de kuluçkaya.
Not: kuluçka süresi 24 saat yüksekse, 50 mL konik şişeler ve basınçlı kap uygun kültür ortamının 12 mL ekleyin. Onları ön inoculum 500 μL ile aşılamak. Fermantatif büyüme denetimleri (YP medya % 1, % 2 veya % 10 glikoz ile) ve solunum büyüme denetimleri (YP % 2 gliserol veya etanol ortamla) dikkate almak önemlidir. - Sarsılmış konik şişesi kültürünün 100 μL al ve 900 μL 1 mL spektrofotometre küvet içinde distile su içinde seyreltik ve karışımı yavaşça pipetting tarafından. 600 OD ölçmek bir spektrofotometre her 2 h kullanarak nm. Gerçek OD elde etmek için sonucu on tarafından çarpın.
4. veri işleme ve kinetik parametrelerin hesaplama
-
Yeni bir proje dosyasında istatistik paketi yazılımında oluşturun. "Yeni tablove grafik" bölümünde "XY" seçeneğini seçin.
- Seçeneği seçin: "bir boş veri tablosu ile Start" "Örnek veriler" bölümünde.
- "Noktaları ve bağlantı hattı" grafik türünü seçin. "X" bölümü "Çoğaltır veya hata değerleri için Subcolumns" kesim içinde seçili bırakın ve içinde "Y" seçeneği seçin: "Yan yana subcolumns (10) Çoğalt değerler girin ve ortalama ve hata SD Arsa". Oluştur düğmesini tıklatın.
Not: Tablo biçiminde bir X sütun ve birden fazla Y sütun, her biri daha önce seçilen 10 subcolumns var.
- Yazma hangi aşırı doz ölçümleri X sütununda alınmıştır zaman (Örneğin, 0, 30, 60, 90 dakika veya 0, 1, 1.5, 2 h). Y sütunlarda kültürler elde OD değerleri yazın.
- Logaritma Y sütun veri dönüştürme ve üstel büyüme aşamasında tanımlayın. "Analiz" düğmesini tıklatın, "Dönüştürmek" analiz, Y kullanarak Y değerlerini seçin Log(Y) =. "Galeri sonuçları", "Dönüştürmek" veri tablo seçin "Analiz" düğmesini tıklatın ve "Doğrusal regresyon" analiz seçin gidin. Doğrusal bir davranış takip etmez OD değerleri almamak. Değerleri almamak için bunları veri tablosunu seçin ve "Ctrl + E"yazın.
Not: Üstel büyüme denklem de veya üssel faz ile uyuyor beri izleyen veya üssel faz değil değerleri almamak önemlidir. - "Veri tabloları Galeri", veri tablosunu seçin "veri 1". "Analiz" düğmesini tıklatın ve "Doğrusal olmayan regresyon (eğri FIT)" Analizi "XY analizleri" arasındaseçin.
- Analiz ve "Tamam" düğmesini tıklatın veri kümelerini seçin. "Üstel denklemi" bölümüne "Uygun" sekmesini seçin ve "üstel büyüme denklemi" seçin (, nerede hücre konsantrasyonu, X X0 sıfır zamanda μ hücre konsantrasyon olduğunu belirli büyüme oranı ve t zamanı). "Uyan en az kare sayısını" uygun yöntemi olarak kullanmak ve aradeğerleme bölümü seçili bırakın. "Tamam" düğmesini tıklatın.
Not: "Galeri sonuçlarının"doğrusal olmayan uygun sonuçlar ile sekmesidir. Katlama zaman (Dt) ve özel yazılım hesaplar büyüme oranı (μ). Yazılım μ K olarak sonuçları sekmesini gösterir. - Yeni bir proje dosyasını açın ve "yeni tablo ve grafik" bölümünde, sütun seçim seçin. "Bir boş veri tablosu ile Başlat" seçeneğini seçin ve istediğiniz grafiği seçin. Ortalama SD seçin "Oluştur" düğmesine çizmek seçin.
- "Galeri sonuçlarının" doğrusal olmayan uygun sonuçlar sekmesini μ veya Dt değerleri kopyalamak ve bir sütunda yapıştırabilirsiniz. Son olarak, "Analiz" düğmesini seçin ve istediğiniz analiz farklı nutrimental koşullardan kinetik parametrelerin karşılaştırmak için "Sütun analizleri" bölümünde seçin.
Not: Kinetik parametrelerin fermantatif büyüme denetimleri (YP medya % 1, % 2 veya % 10 glikoz ile) elde edilen ve solunum büyüme denetimleri (YP % 2 gliserol veya etanol ortamla) yardımcı olur fermantatif ve mitokondrial solunum eşiği belirlemek, anılan sıraya göre. Kinetik karşılaştırma beslenme durumu ve madde/bileşik ile solunum ve fermantatif büyüme denetlesinler parametreleri tanımlayan olası etkisi solunum veya fermantatif metabolizmasına yardımcı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Büyüme eğrileri birime S. cerevisiae Maya solunum ve fermantatif fenotipleri arasında ayırımcılık için kullanılabilir. Bu nedenle, biz S. cerevisiae (BY4742) toplu iş kültürleri fermantatif büyümesini teşvik bildirilmiştir farklı glikoz konsantrasyonu ile gerçekleştirilen: % 1, % 2 ve % 10 (w/v)9. Fermantatif fenotip gösterilen kültürler küçük gecikme faz ve bir yüksek büyüme oranı (resim 1) ile bir üssel faz hakkına sahiptir. Etanol, gliserol ve laktat sadece solunum metabolize karbon kaynakları. Böylece, bu karbon kaynakları kullanarak maya kültürleri gerçekleştirilen. Başlıca Oksidatif fosforilasyon tarafından enerji elde kültürler bir daha uzun bir gecikme faz ve büyüme veya üssel faz (Şekil 2) sırasında yavaş hızı gösterdi.
Analiz büyüme eğrilerinin sadece nitel bilgi sağlar; Bu nedenle, nicel bilgi edinme kinetik parametrelerin hesaplamak önemlidir. Dt ve μ (Şekil 3) üstel büyüme denklem kullanılarak hesaplanır. Dt ≥11.5 h ve μ ≤0.059 solunum büyüme değerleri için bir eşik ayarlamak / s. Fermantatif büyüme için eşik Dt ≤6.5 h ve μ ≥0.149 ayarla / h (Şekil 3).
Bu tarama araç kullanışlılığı kanıtlamak için biz üç deneyler, farklı resveratrol (RSV) konsantrasyonları ile farklı enerjik statüsünde (Şekil 4) S. cerevisiae BY4742 hücreleri üzerinde etkilerini değerlendirmek için ilk ressam ile sarsılmış şişeler. S. cerevisiae BY4742 konsantrasyonları farklı amonyum sülfat (NH4+) enerji metabolizmasına etkileri algılamak için ikinci deneme amaçlı (Şekil 5) bir Mikroplaka içinde. Son olarak, iki farklı fermantatif büyüme karbon kaynağındaki değişikliklerin nasıl etkilediğini göstermek için üçüncü amaçlı S. cerevisiae suşları (W303 ve WLP530 kullanılan bira fermantasyon için sanayi) (Şekil 6). RSV kullanarak denemede glikoz konsantrasyonu değiştirerek hücre enerjik durumu güncellenmiştir. % 10 glikoz, test tüm RSV konsantrasyonları Maya respiro fermantatif aşaması değişmedi ama solunum faz azaltmak (diauxic kaydırma sırasında S. cerevisiae veya üssel faz tarafından sırasında üretilen etanol metabolize edilir Oksidatif fosforilasyon). μ değerleri test tüm koşullar altında % 2 gliserol (solunum denetimi olarak kullanılan koşul) yetiştirilen onun fenotip aksine fermantatif davranış S. cerevisiae gösterdi doğruladı (Şekil 4a). Hücreler yalnızca % 1 glikoz ile enerjik zaman μ değerleri 0,1, 1, 10 ve 100 µM RSV respiro fermantatif aşamasında fermantatif davranış değil etkilendi doğruladı. Ancak, diauxic shift solunum aşamasında bir düşüş gözlenmiştir. Ayrıca, 1000 µM konsantrasyon RSV tamamen hücre büyümesini inhibe.
İkinci denemede hücrelerin % 10 glikoz, Crabtree yürürlükte ikna etmek yeterli kabul bir konsantrasyon ile takıma S. cerevisiae. Bu nedenle, NH4+ fermantatif metabolizması farklı konsantrasyonlarda takviyesi tarafından teşvik etkisi gözlemlemek. O 0,13, 0.66 ve %1,99 NH4+ iyilik fermantatif metabolizma Dt değerlerini önerdi ve bu konsantrasyonları kültürün üssel faz genişletilmiş büyüme eğrileri görülebilmektedir. Yine de, %3.31 mM NH4+, bu konsantrasyon respiro fermantatif metabolizma indükler Dt değer bir artış gösterdi. Bu fenotip bir genişletilmiş gecikme faz gösterdi büyüme eğrileri ve daha yavaş büyüme oranı veya üssel faz (Şekil 5).
Üçüncü denemede, iki farklı hücreleri S. cerevisiae suşları (W303 ve WLP530) sükroz veya galaktoz Dt değerlerini karbon kaynağı etkileri olsa test etmek için farklı konsantrasyonlarda yetiştirilen zorlanma bağlıdır. Fermantatif denetimi olarak her iki suşlar % 2 glikoz yetiştirilmiştir ve Dt değerlerini fermantatif büyüme için bir eşik ayarlamak için hesaplanmıştır. Fermantatif Dt değerlerini suşları farklıydı için ≤3.25 W303 zorlanma ve ≤6.84 için WLP530 s s ile süzün. Bu nedenle, kullanılan farklı suşları için Dt eşik doğrulamak için gerekliliğini vurgulamak önemlidir. Ayrıca, sukroz karbon kaynağı olarak kullanıldığında % 2 ve % 10 her iki suşlar fermantatif fenotip gözlendi. Galaktoz kullanıldığında, ancak, zorlanma W303 fermantatif davranış herhangi bir test, WLP530 zorlanma fermantatif fenotip %2 galaktoz gösterdi iken konsantrasyonları belli etmedi. İlginçtir, W303 yük test her iki karbon kaynakları tüm konsantrasyonlarda büyüdü. Yine de, WLP530 zorlanma büyüme kullanılan karbon (% 0.01) en düşük konsantrasyon belli etmedi. Bunun nedeni WLP530 bira endüstrisinde kullanılan ve genellikle çok daha yüksek (Şekil 6) için yararlanılır karbon konsantrasyonları vardır olabilir.
Özet olarak, bu üç deneyler verilerden büyüme eğrileri ve kinetik parametrelerin S. cerevisiaesolunum ve fermantatif büyüme arasında ön ayrımcılık için yararlı olduğunu kanıtlamak. Ayrıca, bu enerji metabolizması araştırma farklı yönlerini kullanılabilecek çok yönlü bir araç olduğunu vurgulamak önemlidir.
Resim 1: Farklı glikoz konsantrasyonu S. cerevisiae büyüme fenotip üzerindeki etkisi. Büyüme eğrileri inşa 600 optik yoğunluk ölçerek nm her 30 dk. 48 h için. S. cerevisiae hücreleri Maya, kültürler kısa gecikme faz ve hızlı büyüme hızı veya üssel faz sırasında gösterdi. Respiro fermantatif faz burada fermantasyon tarafından üretilen etanol Oksidatif fosforilasyon yolu kullanarak metabolize edilir, daha sonra durağan faz ulaşıldığında bir büyüme yavaşlama faz tarafından (solunum fazı), takip edilebilir. Verileri ortalama ± standart hata sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Solunabilir karbon kaynakları üzerindeki etkisini S. cerevisiae büyüme fenotip. Büyüme eğrileri inşa 600 optik yoğunluk ölçerek nm S. cerevisiae 48 h. hücreler için 30 her dk bir uzun süreli bir gecikme faz ve yavaş büyüme oranı veya üssel faz sırasında gösterdi ve genellikle bir diauxic kayma belli etmedi. Verileri ortalama ± standart hata sunulmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Karbon kaynağı ve S. cerevisiae kinetik parametrelerin onun konsantrasyon etkisi. (bir) Dt değerleri S. cerevisiae BY4742 büyüme altında farklı karbon kaynakları; (b) μ değerleri farklı konsantrasyonları farklı karbon kaynakları altında S. cerevisiae BY4742 büyüme. Verileri ortalama ± standart sapma sunulmaktadır. İstatistiksel analizler gerçekleştirilen bir Dunnett'ın test tarafından takip bir tek yönlü ANOVA kullanarak (*p < %0.01 2 glikoz vs). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: resveratrol takviyesi farklı hücre enerji durumları üzerinde etkisi. % 10 glikoz kullanarak (bir) büyüme fenotip ve μ değerleri; % 1 glikoz (b) büyüme fenotip ve μ değerleri kullanarak. Ortalama ± standart hata büyüme eğrileri verileri sunulmaktadır ve μ değerleri ortalama ± standart sapma sunulmaktadır. μ değerler için istatistiksel analizler gerçekleştirilen bir Dunnett'ın test tarafından takip bir tek yönlü ANOVA kullanarak [*p < % 2 gliserol (RC) ile 0,01 vs. solunum denetim]. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Amonyum sülfat takviyesi S. cerevisiae enerji metabolizmasına etkisi. Büyüme eğrileri inşa 600 optik yoğunluk ölçerek nm her 30 dk. 48 h. için büyüme eğrileri verilerden ortalama ± standart hata sunulmaktadır ve μ değerleri ortalama ± standart sapma sunulmaktadır. Dt değerleri için istatistiksel analizler gerçekleştirilen bir Dunnett'ın test tarafından takip bir tek yönlü ANOVA kullanarak [* p < % 2 gliserol (RC) ile 0,01 vs. solunum denetim]. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: fermantatif metabolizmasını galaktoz ve sukroz konsantrasyon etkisini Saccharomyces cerevisiae. W303 lab zorlanma ve (b) Dt değerlerini WLP530 endüstriyel zorlanma için (bir) Dt değerleri. Verileri ortalama ± standart sapma sunulmaktadır. Dt değerleri için istatistiksel analizler gerçekleştirilen bir Dunnett'ın test tarafından takip bir tek yönlü ANOVA kullanarak [* p < 0,01 vs % 2 glikoz (fermantatif denetimi)]. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
J. Monod10 bakteriyel kültürlerde büyüme çalışmanın Mikrobiyoloji temel yöntemi olduğunu ifade beri uzun zaman geçti. Moleküler araçları gelişiyle kullanım ve çalışma bir teknik olarak büyüme geciktirir. Çok sayıda birbiriyle ilişkili süreçlerinden büyüme karmaşıklığına rağmen onun temel mekanizmaları matematiksel modeller11kullanarak tanımlanabilir. En karmaşık moleküler mekanizmaları12aydınlatmak için tamamlayıcı bir aracı olarak kullanılan güçlü bir yaklaşımdır.
Bu yöntem güvenilir sonuçlar elde etmek için aşağıdaki kritik adımları dikkate almak önemlidir. Ajitasyon 250 devirde alt kullanırken solunum koşulları büyüme Biz gözlenen ajitasyon hızları (150-180 rpm) azaltılmış beri sarfetmek solunum büyüme, düşük karbon kaynakları iyi büyüme ulaşmak için önemlidir. Taze bir hisse senedi istihdam Protokolü başlatmak önemlidir ve tek tip bir fenotip deneyleri içinde korumak için önemlidir. Büyüme kinetik eşik değerleri suşları arasında değişir ve deneyleri içinde kullanılmak üzere koşullarına göre doğrulanması gerekir. Üstel büyüme denklem zaten önceden yüklenmiş çünkü GraphPad prizma yazılım önerilmiştir; üstel büyüme eşit olarak programlama sağlar ancak, başka bir yazılım uygun, sağlanır. Mikroplaka içinde bu üç wells ile inoculum olmadan büyüme ortamının 150 μL eklemek önerilir — Bu Mikroplaka wells kirlenme acı çekti gösterir bir denetimdir.
OD veri doğrusal bir ölçek üzerinde çizme bu Logaritmik büyüme aşaması belirlemek zorlaştırabilir olduğunu belirtmek önemlidir. Bu sorun lag faz ve Logaritmik büyüme faz açıkça görünecek şekilde OD verileri bir günlük ölçeğinde komplo tarafından üstesinden gelebilir.
Bu iletişim kuralı yalnızca bir fenotip fermantasyon ve mitokondrial solunum belirli etkileri onaylandığı takdirde bu yüzden ekran için kullanılır. Fermantasyon asetat, süksinat, gliserol ve etanol9 gibi yan birikimi tarafından belirlenen süre oksijen tüketimi deneyleri13,14tarafından mitokondrial solunum miktar tavsiye ediyoruz .
S. cerevisiae büyüme moleküler mekanizmaları anlamak için bir araç olarak hizmet vermiştir ve fenotipleri, test için tarama yöntemleri ile deneyi. Yine de, çok sayıda Deneysel tasarımlar literatürde Maya büyüme sadece nitel parametre olarak (Örneğin, plaka dilutions veya büyüme eğrileri), kullanın böylece değerli kanıt bu teknikler istihdam ihmal. Örneğin, elde edilebilir içinde ağar kaplamalar mikrobiyal nüfus sayımı veya seri-dilutions yapmak için kullanılan oksijen, büyüme ölçüm solunum koşulları altında karmaşık hale getiren sınırlıdır. Ayrıca, ne zaman iki veya daha fazla hücre birbirine bağlı kalır, tek bir koloni görülmektedir. Büyüme eğrileri kullanım ince farklar hakkında gerçekleri bir kenara bırakabilir büyüme farklılıkları vurgulamak için görsel sonuç olarak başka bir kısıtlamadır. Bu nedenle, nicel parametreleri için bilgi büyüme tercümesi hakkında sarf fenotip hassas veri ulaşılmasına izin verir. Yine de, büyüme matematiksel gösterimi bir karmaşık bilimsel kuruluştur. En çalışmaları mikroorganizmaların sadece bir çevre koşulu hizmet yüksek dereceden polinom denklemler elde tam büyüme (gecikme, günlüğü ve sabit aşama) inceleyin. Bu denklem katsayıları tarafından doğrusal regresyon hesaplanırken göreli basitliğine rağmen onları için bir doğal biyolojik anlam15atamak zordur. Matematiksel olarak güvenilir ve doğru sözlü büyüme fazları ayıran tarafından büyüme analizidir. Bunun bir örneği üzerinde birinci dereceden kinetik dayanır ve bir kısa gecikme faz ve üssel faz uyan üstel büyüme denklemdir.
Son olarak, üstel büyüme denklemi kullanarak log fazı eğitim mitokondrial solunum veya fermantasyon etkisi belirli bileşik veya ortamı anlamak için tutarlı bir yöntemdir. Kavramının bir kanıtı olarak, miktar veya üssel faz büyüme RSV özellikle solunum büyüme13,14etkiler gösterdi. Burada, büyüme RIM15 silinmesi olasılığı S. cerevisiae9' solunum kapasitesi kısmi inhibisyon tarafından fermantatif metabolizma artırır tanımlamak için değerli bir araç görev yaptı. Bu veriler büyüme gözlemleyerek fermantatif ve solunum metabolizmaya çalışma için izin verir ve basit ve güvenilir bir yöntemdir doğrulamaktadır. Bu nedenle, bu yaklaşım belirli bir maddenin etkilerini mitokondrial solunum veya fermantasyon eleme için sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu proje desteklenmiştir göre Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (grant numarası 293940) ve Fundación TELMEX-TELCEL (grant sayı 162005585), IKOM için her ikisi de verir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction? Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
