Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتقدير الأيض معفن والجهاز التنفسي باحتواء النمو الأسى ل Saccharomyces cerevisiae لمعادلة النمو المتسارع. يسمح حساب المعلمات الحركية لفحص تأثيرات المواد/المركبات على التخمر أو التنفس المتقدرية.
Abstract
الخلايا saccharomyces cerevisiae في المرحلة الأسية مواصلة نموها بإنتاج ATP عن طريق التخمير و/أو التنفس المتقدرية. أن تركيز الكربون تخمر أساسا يحكم كيفية توليد خلايا الخميرة ATP؛ وهكذا، يدفع التباين في مستويات تخمر الكربوهيدرات الأيض نشطة من S. cerevisiae. وتصف هذه الورقة أسلوب الفائق يقوم على نمو الخميرة الأسية لتقدير الآثار المترتبة على التغييرات تركيز وطبيعة مصدر الكربون في الأيض معفن والجهاز التنفسي. نمو S. cerevisiae يقاس صفيحة أو اهتزت المخروطية قارورة بواسطة تحديد الكثافة البصرية (OD) 600 نانومتر. ثم، هو بناها منحنى نمو OD رسم مقابل الوقت، مما يسمح بتحديد واختيار المرحلة الأسية، ومزودة بمعادلة النمو الأسى للحصول على معلمات الحركية. عموما تمثل معدلات نمو منخفضة محددة بإضعاف مضاعفة أعلى نمو الجهاز تنفسي. على العكس من ذلك، تشير معدلات نمو محددة مع انخفاض مرات مضاعفة النمو معفن. تقدر قيم العتبة لمضاعفة الوقت ومعدل نمو محددة باستخدام شروط الجهاز التنفسي أو معفن المعروفة جيدا، مثل مصادر الكربون غير تخمر أو تركيزات أعلى من تخمر السكريات. يتم الحصول على هذه لكل سلالة معينة. أخيرا، تتم مقارنة المعلمات الحركية المحسوبة بقيم العتبة تحديد ما إذا كانت الخميرة يظهر النمو معفن و/أو الجهاز التنفسي. وميزة هذا الأسلوب هو بساطتها النسبية لفهم آثار مادة/مجمع على الأيض معفن أو الجهاز التنفسي. من المهم تسليط الضوء على أن النمو عملية بيولوجية معقدة ومعقدة؛ ولذلك، البيانات الأولية من هذا الأسلوب يجب أن تؤكده التحديد الكمي لاستهلاك الأوكسجين وتراكم مشتقات التخمير. وبالتالي، يمكن استخدام هذا الأسلوب كفرز أولى للمركبات/المواد التي قد تخل أو تعزيز الأيض معفن أو الجهاز التنفسي.
Introduction
النمو saccharomyces cerevisiae بمثابة أداة قيمة تحديد عشرات الآليات الفيزيولوجية والجزيئية. ويقاس النمو أساسا بثلاث طرق: تخفيف المسلسل لاختبار البقعة، ووحدة تشكيل مستعمرة العد، ومنحنيات النمو. يمكن استخدام هذه التقنيات وحدها أو في تركيبة مع مجموعة متنوعة من ركائز والظروف البيئية، وطفرات والمواد الكيميائية للتحقيق في استجابات محددة أو تعمل.
التنفس المتقدرية هو عملية بيولوجية فيها حركية النمو وقد طبقت بنجاح لاكتشاف آليات غير معروفة. وفي هذه الحالة، مصادر مكملات وسائط النمو مع الكربون غير تخمر مثل الجلسرين أو لاكتات الإيثانول (التي يستقلبان حصرا بالتنفس المتقدرية)، كما يسمح للكربون والطاقة هو المصدر الوحيد لتقييم نمو الجهاز التنفسي، هو أمر مهم للكشف عن اضطرابات في الفسفرة النشاط1. من ناحية أخرى، أنها معقدة استخدام نماذج النمو الحركية كطريقة لفك رموز الآليات وراء التخمير.
دراسة التخمر والتنفس المتقدرية ضروري لتوضيح الآليات الجزيئية وراء بعض تعمل مثل كرابتري وواربورغ2،الآثار3. أثر كرابتري يتسم بزيادة قدرها glycolytic التمويه، القمع للتنفس المتقدرية، وإنشاء للتخمير كالمسار الأساسي لتوليد ATP وجود تركيزات عالية من الكربوهيدرات تخمر (> 4،0.8 ملم)5. أثر واربورغ أيضي تمثيلي لأثر كرابتري، مع الفرق أن في خلايا الثدييات، هو المنتج الرئيسي للتخمير لاكتات6. وفي الواقع، معروض أثر واربورغ بمجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية، تسبب امتصاص الجلوكوز والاستهلاك حتى في وجود الأكسجين7. وبالتالي، دراسة الأساس الجزيئي للتبديل من التنفس للتخمير في أثر كرابتري قد آثار التكنولوجيا الحيوية (لإنتاج الإيثانول) والآثار المحتملة في أبحاث السرطان.
قد يكون النمو S. cerevisiae أداة مناسبة لدراسة آثار كرابتري وواربورغ. هذه الفكرة تستند إلى حقيقة أن مرحلة الأسى الخميرة، هي مسارات المركزية المستخدمة لإنتاج ATP التنفس المتقدرية والتخمير، وضرورية للحفاظ على النمو. على سبيل المثال، نمو S. cerevisiae اتصالاً وثيقا بوظيفة سبل توليد ATP. في S. cerevisiae، ATP تنتج قرابة 18 التنفس المتقدرية جزيئات كل جزيء الجلوكوز، بينما يولد التخمير فقط 2 جزيئات ATP، ومن ثم يتوقع أن معدل النمو قد ضيق الروابط مع المسارات الأيضية إنتاج ATP8. وفي هذا الصدد، عند التخمير هو الطريق الرئيسي لتوليد ATP، يعوض الخميرة لإنتاج ATP منخفضة عن طريق زيادة معدل امتصاص الجلوكوز. على العكس من ذلك، منخفض استهلاك الجلوكوز خلايا الخميرة التي تستخدم التنفس المتقدرية ATP المصدر الرئيسي. يشير هذا إلى أن من المهم للخميرة إلى توافر الكربوهيدرات الشعور قبل تحديد كيف سيتم إنشاء ATP. ولذلك، توافر الجلوكوز دوراً هاما في التبديل بين التخمير والتنفس المتقدرية في cerevisiae س. وجود كميات كبيرة من السكر، يفضل الخميرة التخمير كالتوجيه المركزي لتوليد ATP. من المثير للاهتمام، عندما يتم تخمر الخميرة، هو الحفاظ على معدل نمو محددة إلى الحد الأقصى. من ناحية أخرى، ضمن مستويات منخفضة من الجلوكوز ينتج S. cerevisiae ATP باستخدام التنفس المتقدرية، الحفاظ على انخفاض معدلات النمو. وبالتالي، التباين في التركيز الجلوكوز واستخدام مصادر الكربون الأخرى تحدث تغييرات في تفضيل للخميرة بين النمو معفن والجهاز التنفسي. تأخذ في الاعتبار هذه الحقيقة مع معادلة النمو الأسى، يمكنك الحصول على معنى البيولوجية لمعلمات الحركية مثل مضاعفة الوقت (Dt) ومعدل النمو المحددة (μ). على سبيل المثال، تم العثور على قيم μ أقل عندما يستخدم الخميرة التنفس المتقدرية كالمسار الأساسي. على العكس من ذلك، عثر على ظروف لصالح التخمير، قيم μ أعلى. يمكن استخدام هذه المنهجية لقياس الآليات المحتملة لأي من المواد الكيميائية التي تؤثر على التخمر والتنفس المتقدرية في cerevisiae س.
والهدف من هذه الورقة أن يقترح أسلوب يقوم على حركية النمو لفحص آثار مادة/مركب معين على التنفس المتقدرية أو التخمير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-وسائل الإعلام الثقافة وإعداد العدوى
- تحضير 100 مل من استخراج-ببتون-سكر العنب (YPD) الخميرة 2% المتوسطة السائل (إضافة 1 غ خميرة استخراج، ز 2 من ببتون الكازين، و 2 غ السكر إلى 100 مل من الماء المقطر). الاستغناء عن 3 مل من وسائط الإعلام إلى 15 مل أنابيب مخروطية تعقيمها. اﻷوتوكﻻف وسائط الإعلام لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية و 1.5 رطل/بوصة مربعة.
ملاحظة: يمكن تخزين وسائط الإعلام لمدة تصل إلى شهر واحد في 4 – 8 درجة مئوية. - تطعيم أنبوب مخروطي مليئة 3 مل من بارد مرق YPD 2% العقيمة مع 250 ميكروليتر من الخلايا S. cerevisiae الاحتفاظ في الجلسرين في-20 درجة مئوية. تبني بين عشية وضحاها في شاكر مداري عند 30 درجة مئوية مع الانفعالات 200 لفة في الدقيقة.
- الانتصارات طبق بتري (60 × 15 مم2) مليئة معقم أجار YPD 2% (إضافة 10 جرام خميرة استخراج، 20 غراما ببتون الكازين، 20 غراما السكر، و 20 غراما أجار البكتريولوجية إلى 1,000 مل من الماء المقطر) مع الخلايا نمت في أنبوب مخروطي باستخدام حلقة عقيمة. احتضان طبق بيتري في 30 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات المعزولة النمو.
- تعد العدوى قبل حلول تطعيم مستعمرة معزولة وحيدة في أنبوب مخروطي مليئة 10 مل من بارد مرق YPD 2% العقيمة واحتضان ذلك بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع التحريك المستمر 200 لفة في الدقيقة.
2-وسائل الإعلام الثقافة ومنحنيات النمو في ميكروسكوبية
- إعداد 10 مل مرق YPD 1% (إضافة استخراج 0.1 غرام خميرة، 0.2 جم ببتون، و 0.1 غرام السكر إلى 10 مل من الماء المقطر)، 10 مل مرق YPD 2% (إضافة استخراج 0.1 غرام خميرة، 0.2 جم ببتون، و 0.2 جم جلوكوز إلى 10 مل من الماء المقطر) ، و 10 مل مرق YPD 10% (إضافة استخراج 0.1 غرام خميرة، 0.2 جم ببتون، و 1 غرام السكر إلى 10 مل من الماء المقطر). اﻷوتوكﻻف هذه الوسائط النمو لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية و 1.5 رطل/بوصة مربعة.
ملاحظة: وسائط الإعلام الثقافة بمثابة عنصر تحكم النمو معفن. - إعداد 10 مل مرق ([يب]) استخراج-ببتون-الإيثانول الخميرة 2% و 10 مل من مرق (يبج) استخراج-ببتون-والغليسيرول الخميرة 2%. 2% [يب]: إضافة استخراج 0.1 غرام خميرة، 0.2 جم ببتون، و 0.2 مل إيثانول إلى 10 مل من الماء المقطر. % 2 يبج: إضافة استخراج 0.1 غرام خميرة، 0.2 جم ببتون، و 0.2 مل الجلسرين إلى 10 مل من الماء المقطر. اﻷوتوكﻻف هذه الوسائط النمو لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية و 1.5 رطل/بوصة مربعة.
ملاحظة: يتم والغليسيرول والايثانول مصادر الكربون غير تخمر يستقلبان حصرا بالتنفس المتقدرية. لهذا السبب، فإنها تستخدم كعناصر نمو الجهاز تنفسي. في هذه الخطوة، قد يتغير نوع وتركيز الكربون المصدر في وسائط الثقافة لاختبار تأثيرات على نمو النمط الظاهري باستخدام الخميرة استخراج-ببتون (يب) مرق (10 جرام من الخميرة استخراج و 20 غراما من ببتون الكازين في 1,000 مل ماء المقطر) كقاعدة. ويكمل الاصطناعية المتوسطة (SC) كاملة لاختبار آثار المواد المغذية الأخرى إلى جانب الكربون، وفقا للهدف من هذه التجربة. القاعدة لاتفاقية استكهولم متوسطة 1.8 غرام من الخميرة النيتروجين قاعدة دون الأحماض الأمينية، 5 غ كبريتات الأمونيوم [(NH4)2هكذا4], 1.4 غرام فوسفات أحادية الصوديوم (نة2ص4)، ومزيج ز 2 من التسرب في 1,000 مل ماء المقطر. تكملة وسائط الإعلام مع مصدر الكربون ومصدر النيتروجين إضافية في التركيزات المطلوبة. - إضافة ميكروليتر 145 من وسائط الثقافة مناسبة للتصميم التجريبي لكل بئر من الميكروسكوبية العقيمة (10 × 10-جيد) مع غطاء وتطعيم لهم مع 5 ميكروليتر من العدوى قبل.
ملاحظة: إذا كان الهدف هو الشاشة تأثير المواد/المركبات على عملية الأيض نشطة من الخميرة، ينبغي إضافة المادة/المجمع السكني أثناء هذه الخطوة. أيضا، ينبغي أن يكون أي نوع من صفيحة مع غطاء مفيدة. - احتضان لوحة متعددة جيدا في قارئ ميكروسكوبية في 30 درجة مئوية مع إثارة مستمرة 200 لفة في الدقيقة ل h. 48 قياس الكثافة البصرية (OD) 600 نانومتر كل 30 أو 60 دقيقة.
ملاحظة: إذا لم يكن لدى القارئ الميكروسكوبية الخيار لاحتضانها الصفيحة، قد المحتضنة في شاكر مدارية في نفس الظروف بين كل قياس التطوير التنظيمي.
3-نمو منحنيات في قوارير المخروطية اهتزت
- إضافة مل 4.8 من وسائل الإعلام ثقافة مناسبة لقوارير مخروطية 20 مل والاوتوكلاف. تطعيم كل قارورة مع 200 ميكروليتر ثقافة العدوى قبل في OD600nm ~ 2 في مرق YPD 2% بارد، وعقيمة. احتضان لهم عند 30 درجة مئوية مع إثارة مستمرة 250 لفة في الدقيقة ح 24.
ملاحظة: إذا كانت فترة الحضانة أعلى من ح 24، إضافة 12 مل وسائط الثقافة مناسبة إلى 50 مل قوارير المخروطية والاوتوكلاف. تطعيم لهم مع 500 ميكروليتر من العدوى قبل. من المهم أيضا النظر في عناصر النمو معفن (يب وسائل الإعلام مع الجلوكوز 1%، 2%، أو 10%) وعناصر نمو الجهاز التنفسي (يب وسائل الإعلام مع والغليسيرول 2% أو الإيثانول). - تأخذ 100 ميكروليتر من ثقافة هز قارورة مخروطية وتمييع في ميكروليتر 900 من الماء المقطر في ومبومو جهاز المطياف الضوئي 1 مل المزيج بلطف بيبيتينج. قياس OD 600 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي كل ح 2. للحصول على التوجيه التشغيلي الحقيقي، اضرب النتيجة عشرة.
4-تجهيز البيانات وحساب معلمات الحركية
-
قم بإنشاء ملف مشروع جديد في برنامج الحزمة الإحصائية. في المقطع "جديد من الجدولوالرسم البياني"، اختر الخيار "س" .
- حدد الخيار: "تبدأ باستخدام جدول بيانات فارغ" في المقطع "نموذج البيانات" .
- حدد نوع الرسم البياني "النقاط وخط الربط" . اترك المقطع "X" غير محددة في هذا الجزء من "سوبكولومنس replicates أو القيم الخطأ"، وفي "Y" المقطع اختر الخيار: "قم بإدخال قيم تكرار (10) في سوبكولومنس جنبا إلى جنب وارسم يعني و SD خطأ". انقر فوق الزر إنشاء.
ملاحظة: تنسيق الجدول على عمود X واحد والعديد من أعمدة Y، كل منها سوبكولومنس 10 المختار سابقا.
- كتابة الوقت في التطوير التنظيمي الذي أخذ القياسات في العمود العاشر (مثلاً 0، 30، 60، 90 دقيقة أو 0، 1، 1-5، ح 2). في الأعمدة Y، كتابة OD القيم التي تم الحصول عليها من الثقافات.
- تحديد مرحلة النمو الأسى تحويل بيانات العمود Y إلى اللوغاريتمات. انقر فوق الزر "تحليل" ، اختر "تحويل" التحليل، حدد قيم Y باستخدام Y = Log(Y). انتقل إلى "معرض للنتائج"، حدد جدول البيانات "تحويل" ، انقر فوق الزر "تحليل" ، واختر تحليل ": انحدار خطي" . استبعاد القيم OD التي لا تتبع خطي وسلوك. لاستبعاد القيم، قم بتحديدها في جدول البيانات، ثم اكتب "Ctrl + E".
ملاحظة: من المهم استبعاد القيم التي لا تتبع المرحلة الأسية منذ معادلة النمو الأسى تناسبها تماما مع المرحلة الأسية. - في "معرض جداول البيانات"، حدد جدول البيانات "بيانات 1". انقر فوق الزر "تحليل" واختر تحليل "الانحدار غير الخطية (تناسب منحنى)" بين "التحليلات XY".
- حدد مجموعات البيانات تحليلها وانقر فوق الزر "موافق" . في علامة التبويب "احتواء" اختر القسم "المعادلة الأسية" وحدد "معادلة النمو الأسى" (حيث X تركيز الخلية، X0 تركيز خلية صفر الوقت، μ معدل نمو محددة، وهو t الوقت). استخدام "صالح لمجموع المربعات" كوسيلة ملائمة وترك غير محدد المقطع إينتيربولاتي. انقر فوق الزر "موافق" .
ملاحظة: علامة التبويب مع نتائج تناسب غير الخطية في "معرض للنتائج". البرنامج يحسب مضاعفة الوقت (Dt) والخاصة بمعدل النمو (μ). ويبين البرنامج μ كفى علامة التبويب نتائج. - افتح ملف مشروع جديد، وفي المقطع "جديد من الجدول والرسم البياني" ، حدد الخيار العمود. اختر الخيار "بدء باستخدام جدول بيانات فارغ" ، وحدد الرسم البياني المطلوب. اختر الرسم في الوسط مع التنمية المستدامة. اختر الزر "إنشاء" .
- نسخ قيم Dt أو μ من علامة التبويب نتائج تناسب غير الخطية التي في "معرض للنتائج" ولصقها في عمود. وأخيراً، حدد الزر "تحليل" واختيار التحليل المطلوب في المقطع "تحليلات العمود" لمقارنة المعلمات الحركية لمختلف الظروف نوتريمينتال.
ملاحظة: معلمات الحركية التي تم الحصول عليها من عناصر النمو معفن (يب وسائل الإعلام مع الجلوكوز 1%، 2%، أو 10%)، وعناصر نمو الجهاز التنفسي (يب وسائل الإعلام مع والغليسيرول 2% أو الإيثانول) يساعد على وضع عتبة التنفس معفن والميتوكوندريا، على التوالي. مقارنة الحركية المعلمات من الحالة التغذوية والجوهر/مجمع جزيئي مع نمو الجهاز التنفسي ومعفن يساعد على تحديد الأثر الممكن على الأيض الجهاز التنفسي أو معفن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن استخدام منحنيات النمو للتمييز مبدئياً بين تعمل معفن والجهاز التنفسي في الخميرة S. cerevisiae . ولذلك، أجرينا الثقافات دفعة من س. سيريفيسيا (BY4742) بتركيزات مختلفة الجلوكوز التي أبلغ عنها لحفز النمو معفن: 1% و 2% و 10% (w/v)9. الثقافات التي تظهر النمط الظاهري معفن على مرحلة متخلفة صغيرة ومرحلة أسي بمعدل نمو مرتفع (الشكل 1). الإيثانول ووالغليسيرول لاكتات هي مصادر الكربون التي يمكن مءيض فقط عن طريق التنفس؛ وهكذا، أجرينا ثقافات الخميرة استخدام تلك المصادر الكربون. وأظهرت الثقافات أن الحصول على الطاقة أساسا عن طريق الفسفرة مرحلة انتقالية أطول وبطء معدل النمو خلال المرحلة الأسية (الشكل 2).
ويوفر تحليل منحنيات النمو فقط المعلومات النوعية؛ ومن ثم فمن المهم أن حساب المعلمات الحركية للحصول على المعلومات الكمية. حسبنا Dt و μ باستخدام معادلة النمو الأسى (الشكل 3). نحن حددت عتبة لقيم نمو الجهاز التنفسي في Dt ≥11.5 ≤0.059 ح و μ /h. تم تعيين الحد الأدنى للنمو معفن في Dt ≤6.5 ≥0.149 ح و μ /ح (الشكل 3).
ليثبت مدى فائدة هذه الأداة فحص قمنا بتصميم التجارب الثلاث، مع الأولى لتقييم آثار تركيزات مختلفة ريسفيراترول (RSV) في الخلايا BY4742 S. cerevisiae مع حالة حيوية مختلفة (الشكل 4) في اهتزت قوارير. التجربة الثانية التي تهدف إلى الكشف عن آثار تركيزات مختلفة من كبريتات الأمونيوم (NH4+) في عملية الأيض الطاقة BY4742 S. cerevisiae (الشكل 5) في ميكروسكوبية. أخيرا، الثالث يهدف إلى توضيح كيف تؤثر التغييرات في مصدر الكربون على النمو معفن في مختلفين وسلالات S. cerevisiae (W303 والصناعي WLP530 تستخدم لتخمير البيرة) (الشكل 6). في تجربة استخدام RSV، تعديل حالة الخلية النشطة باختلاف تركيز الجلوكوز. في الجلوكوز 10 ٪، جميع التركيزات RSV اختبار لم تتغير في مرحلة ريسبيرو معفن من الخميرة ولكن إنقاص المرحلة التنفسية (أثناء التحول ديوكسيك، S. cerevisiae استقلاب الإيثانول أنتجت خلال مرحلة الأسى التي الفسفرة). وأكد القيم μ أن ظروف كل اختبار، أظهرت S. cerevisiae السلوك معفن، خلافا للنمط الظاهري، عندما نما بنسبة 2% والغليسيرول (شرط استخدامها كعنصر تحكم الجهاز تنفسي) (الشكل 4 أ). عندما تم تنشيط الخلايا الجلوكوز 1% فقط، وقيم μ أكدت أن السلوك معفن في مرحلة ريسبيرو معفن لم تتأثر في 0.1، 1 و 10 و 100 ميكرومتر RSV،. ومع ذلك، لوحظ انخفاضا في المرحلة التنفسية أثناء التحول ديوكسيك. وعلاوة على ذلك، بتركيز 1,000 ميكرومتر، RSV تماما تحول دون نمو الخلايا.
في التجربة الثانية، استكملت الخلايا الجلوكوز 10 ٪، وتركيز تعتبر كافية لحمل أثر كرابتري في cerevisiae س. ومن ثم، يمكن أن نلاحظ تأثير تعززه المكملات لتركيزات مختلفة من NH4+ في الأيض معفن. قيم Dt اقترحت أن 0.13 و 0.66 1.99 في المائة NH4+ صالح معفن الأيض، ويمكن أن يلاحظ في منحنيات النمو أن هذه التركيزات تمديد المرحلة الأسية للثقافة. على الرغم من ذلك، أظهرت زيادة في قيمة Dt 3.31% ملم NH4+، أن يدفع هذا التركز أيض ريسبيرو معفن. وأظهر هذا النمط الظاهري مرحلة انتقالية موسعة في منحنيات النمو ومعدل نمو أبطأ في المرحلة الأسية (الشكل 5).
في التجربة الثالثة، خلايا اثنين مختلف سلالات S. cerevisiae (W303 و WLP530) كانت تزرع بتركيزات مختلفة من السكروز أو اللبن اختبار ما إذا كانت آثار الكربون المصدر على قيم Dt تعتمد على السلالة. كعنصر تحكم معفن، كانت تزرع كل سلالات في الجلوكوز 2%، وتم حساب قيم Dt لتحديد عتبة للنمو معفن. معفن دتي القيم للسلالات مختلفة، مع ≤3.25 ح لسلالة W303 و ≤6.84 ح WLP530 سلالة. ولذلك، من المهم تسليط الضوء على ضرورة التحقق من صحة عتبة Dt للسلالات المختلفة المستخدمة. وعلاوة على ذلك، عندما كان يستخدم السكروز كمصدر للكربون، لوحظ النمط الظاهري معفن في 2% و 10% في كلا سلالات. ومع ذلك، عندما استخدمت اللبن، لم تظهر سلالة W303 السلوك معفن في أي من التركيزات التي اختبرت، بينما أظهرت سلالة WLP530 النمط الظاهري معفن في اللبن 2%. من المثير للاهتمام، وسلالة W303 نما في تركيزات جميع مصادر الكربون كل اختبار. رغم ذلك، لم تظهر سلالة WLP530 النمو في أدنى تركيز الكربون المستخدمة (0.01 ٪). قد يكون هذا لأنه يستخدم WLP530 في صناعة البيرة وتركيزات الكربون التي يتعرض لها هي عموما كثير أعلى (الشكل 6).
بالإجمال، إثبات البيانات من هذه التجارب الثلاث أن منحنيات النمو ومعلمات الحركية مفيدة للتمييز الأولى بين نمو الجهاز التنفسي ومعفن في S. cerevisiae. أيضا، من المهم تسليط الضوء على أن هذا هو أداة متعددة الاستخدامات التي يمكن استخدامها في الجوانب المختلفة لبحوث الطاقة الأيض.
الشكل 1: تأثير تركيزات الجلوكوز مختلفة عن النمط الظاهري النمو S. cerevisiae . شيدت منحنيات النمو عن طريق قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر كل 30 دقيقة ح 48. عند الهياج الخلايا S. cerevisiae ، أظهرت الثقافات مرحلة انتقالية قصيرة ومعدل نمو سريع خلال المرحلة الأسية. يمكن اتباعها في مرحلة ريسبيرو معفن بمرحلة تباطؤ نمو (المرحلة التنفسية)، حيث يتم استقلاب الإيثانول تنتجها التخمير باستخدام مسار الفسفرة، ثم الوصول إلى مرحلة ثابتة. يتم عرض البيانات كالخطأ القياسي ± يعني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: تأثير مصادر الكربون للاستنشاق على النمط الظاهري النمو S. cerevisiae . شيدت منحنيات النمو عن طريق قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر كل 30 دقيقة لخلايا 48 h. من S. cerevisiae أظهرت مرحلة انتقالية طويلة ومعدل النمو البطيء أثناء مرحلة الأسى وعموما لم تظهر تحولاً دياوكسيك. يتم عرض البيانات كالخطأ القياسي ± يعني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تأثير مصادر الكربون وتركيزه على معلمات الحركية S. cerevisiae . () Dt قيم النمو BY4742 S. cerevisiae تحت مصادر الكربون مختلفة؛ (ب) القيم μ S. cerevisiae BY4742 النمو بتركيزات مختلفة من مصادر متنوعة من الكربون. وتعرض البيانات يعني ± الانحراف المعياري. أجريت التحليلات الإحصائية باستخدام ANOVA اتجاه واحد متبوعاً بالاختبار دونيت (*p < 0.01 مقابل الجلوكوز 2%). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: أثر مكملات رسفيراترول في حالات الطاقة خلية مختلفة. () نمو قيم النمط الظاهري و μ استخدام الجلوكوز 10 ٪؛ (ب) نمو النمط الظاهري μ القيم واستخدام الجلوكوز 1%. تعرض بيانات من منحنيات النمو كالخطأ القياسي يعني ±، وتعرض القيم μ ± متوسط الانحراف المعياري. أجريت تحاليل إحصائية لقيم μ استخدام ANOVA اتجاه واحد متبوعاً بالاختبار دونيت [*p < مقابل 0.01. مراقبة الجهاز التنفسي مع والغليسيرول 2% (اتفاقية روتردام)]. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: أثر مكملات كبريتات الأمونيوم في استقلاب الطاقة S. cerevisiae . وشيدت منحنيات النمو عن طريق قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر كل 30 دقيقة ل 48 h. تعرض بيانات من منحنيات النمو كالخطأ القياسي يعني ±، وتعرض القيم μ ± متوسط الانحراف المعياري. أجريت التحليلات الإحصائية لقيم Dt باستخدام ANOVA اتجاه واحد متبوعاً بالاختبار دونيت [* ف < مقابل 0.01. مراقبة الجهاز التنفسي مع والغليسيرول 2% (اتفاقية روتردام)]. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: تأثير تركيز اللبن والسكروز في استقلاب معفن Saccharomyces cerevisiae. () دt قيم W303 مختبر السلالة) و (ب) دتي القيم لسلالة WLP530 الصناعية. وتعرض البيانات يعني ± الانحراف المعياري. أجريت التحليلات الإحصائية لقيم Dt باستخدام ANOVA اتجاه واحد متبوعاً بالاختبار دونيت [* ف < 0.01 مقابل 2% جلوكوز (التحكم معفن)]. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد مر وقت طويل J. مونو10 وأعرب عن أن دراسة نمو الثقافات البكتيرية هي الطريقة الأساسية لعلم الأحياء المجهرية. تأخير ظهور الأدوات الجزيئية في الاستخدام ودراسة النمو كأسلوب. وعلى الرغم من الطابع المعقد للنمو الذي ينطوي على العديد من العمليات المترابطة، يمكن وصف آلياتها الأساسية باستخدام النماذج الرياضية11. هذا هو نهج قوية يمكن استخدامها كأداة تكميلية لتوضيح الآليات الجزيئية أعقد12.
للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها من هذا الأسلوب، من المهم أن تنظر في الخطوات الحاسمة التالية. التحريض على 250 دورة في الدقيقة أمر حاسم في تحقيق نمو جيد في مصادر الكربون المنخفضة التي تمارس نمو الجهاز التنفسي، منذ عند استخدام أقل الانفعالات بسرعة (150 – 180 لفة في الدقيقة) لاحظنا انخفاض النمو في ظروف الجهاز التنفسي. من المهم الشروع في البروتوكول باستخدام أسهم جديدة، وأيضا من الضروري الاحتفاظ النمط الظاهري موحدة في الاختبارات. قيم العتبة حركية النمو تختلف بين سلالات ويجب التحقق من صحتها وفقا للشرط لاستخدامها في الاختبارات. ويقترح البرنامج "المنشور جرافباد" لأنه هو الفعل مسبقة في معادلة النمو الأسى؛ أي برامج أخرى غير مناسبة، شريطة أنه يسمح البرمجة في معادلة النمو المتسارع. في الميكروسكوبية، من المستحسن أن تدرج ثلاثة آبار مع 150 ميكروليتر من وسائط النمو دون العدوى – وهذا هو عنصر تحكم يشير إلى إذا الآبار الميكروسكوبية التي عانت من التلوث.
من المهم الإشارة إلى أن رسم بيانات التطوير التنظيمي على نطاق خطية قد تجعل من الصعب تحديد مرحلة النمو لوغاريتمي. ويمكن التغلب على هذه المشكلة برسم البيانات OD في نطاق سجل حتى تكون مرئية بوضوح مرحلة انتقالية ومرحلة النمو لوغاريتمي.
هذا البروتوكول يستخدم فقط شاشة النمط الظاهري، لذلك يجب تأكيد آثار محددة على التخمر والتنفس المتقدرية. نوصي بالتحديد الكمي للتنفس المتقدرية بالأكسجين استهلاك فحوصات13،14، بينما يمكن تحديد التخمير وتراكم المنتجات الثانوية مثل اسيتات، succinate، الجلسرين، والايثانول9 .
النمو S. cerevisiae بمثابة وسيلة لفهم الآليات الجزيئية وتعمل، مع أساليب من الفحص لاختبار فحوصات. ومع ذلك، استخدام العديد من التصاميم التجريبية في الأدب نمو الخميرة فقط كمعلمة نوعية (مثل، لوحة تخفيف أو منحنيات النمو)، وبتوظيف هذه التقنيات يتجاهل أدلة قيمة. على سبيل المثال، الأوكسجين المتوفرة في لوحات أجار المستخدمة لعد السكان الميكروبية أو صنع المسلسل-تخفيف محدود، إلى تعقيد قياس النمو تحت ظروف الجهاز التنفسي. وعلاوة على ذلك، عندما اثنين أو أكثر من خلايا لا تزال تعلق بعضها البعض، لوحظ مستعمرة واحدة فقط. قيد آخر هو استخدام منحنيات النمو كنتيجة مرئية لتسليط الضوء على الاختلافات في النمو، والتي قد تترك جانبا من الحقائق عن الفروق الدقيقة. ولذلك، يسمح ترجمة المعلومات النمو لمعلمات الكمية تحقيق بيانات دقيقة حول النمط الظاهري مارست. ومع ذلك، يتم تمثيل رياضي للنمو مؤسسة علمية معقدة. معظم الدراسات دراسة كاملة النمو (متخلفة، وسجل، ومراحل ثابتة) للكائنات الحية المجهرية، الحصول على الترتيب العالي المعادلات متعدد الحدود التي تخدم فقط من الشروط البيئية. وعلى الرغم من البساطة النسبية عند حساب معاملات هذه المعادلات بالانحدار الخطي، من الصعب تعيين لهم معنى بيولوجية متأصلة15. تحليل النمو بفصل مراحل النمو رياضيا موثوق بها ومباشرة. مثال على ذلك هو معادلة النمو الهائل، الذي يستند إلى حركية الدرجة الأولى وتتلاءم جيدا مع مرحلة انتقالية قصيرة والأسى.
وأخيراً، الذين يدرسون في مرحلة تسجيل باستخدام معادلة النمو الأسى أسلوب متناسق لفهم تأثير التنفس المتقدرية أو التخمير في مجمع معين أو بيئة. كدليل على المفهوم، أظهر التقدير الكمي للنمو في مرحلة الأسى أن RSV تحديداً يؤثر على نمو الجهاز التنفسي13،14. هنا، النمو بمثابة أداة قيمة لتحديد أن الحذف RIM15 المحتمل يحسن الأيض معفن بإعاقة جزئية القدرة على التنفس في S. cerevisiae9. وتؤكد هذه البيانات أن مراقبة النمو يسمح لدراسة الأيض معفن والجهاز التنفسي، وهي طريقة بسيطة وموثوق بها. ومن ثم، يسمح هذا النهج لفحص آثار مادة محددة على التنفس المتقدرية أو التخمير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وقد أيد هذا المشروع بمنح y Consejo ناسيونال دي العلوم التكنولوجيا (رقم المنحة 293940) ومؤسسة تيلمكس-TELCEL (رقم المنحة 162005585)، على حد سواء ليضرب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction? Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
