Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以估计的呼吸和发酵代谢通过适当的指数增长的酿酒酵母的指数增长方程。动力学参数的计算允许筛选物质/化合物对发酵或线粒体呼吸的影响。
Abstract
酵母细胞在指数阶段通过发酵和/或线粒体呼吸产生 ATP 来维持其生长。发酵碳浓度主要控制酵母细胞如何产生 ATP;因此, 发酵碳水化合物水平的变化推动了酵母的能量代谢。本文介绍了一种基于指数酵母生长的高通量方法, 以估计浓度变化和碳源性质对呼吸和发酵代谢的影响。通过测定 600 nm 的光密度 (OD), 在微板块或摇动的锥形烧瓶中测定酵母的生长。然后用绘制 OD 与时间的方法建立生长曲线, 允许指数相的识别和选择, 并配以指数增长方程获得动力学参数。低特异增长率以加倍倍的速度通常代表呼吸增长。反之, 更高的特定增长率以低倍倍的速度表明发酵生长。利用已知的呼吸或发酵条件, 如非发酵碳源或较高浓度的发酵糖, 估计加倍时间和特定生长速率的阈值。这是为每个特定的应变得到。最后, 将所计算的动力学参数与阈值进行比较, 确定酵母是否显示发酵和/或呼吸生长。这种方法的优点是它相对简单, 了解物质/化合物对发酵或呼吸代谢的影响。重要的是要强调, 增长是一个复杂和复杂的生物过程;因此, 该方法的初步数据必须通过定量的氧消耗和发酵副产物的积累来证实。因此, 这种技术可以作为初步筛选的化合物/物质, 可能扰乱或提高发酵或呼吸代谢。
Introduction
酿酒酵母的生长已成为识别许多生理和分子机制的宝贵工具。增长主要用三种方法来衡量: 现场测试的串行稀释、集落单元计数和生长曲线。这些技术可以单独使用或结合各种基质、环境条件、突变体和化学物质来调查特定的反应或表型。
线粒体呼吸是一个生物过程中, 生长动力学已成功地应用于发现未知机制。在这种情况下, 补充的增长媒体与非可发酵的碳源, 如甘油, 乳酸, 或乙醇 (这是完全代谢的线粒体呼吸), 作为唯一的碳和能源的来源, 可以评估呼吸生长是检测氧化磷酸化活性1的扰动的重要因素。另一方面, 用生长动力学模型来破译发酵后的机理是很复杂的。
对发酵和线粒体呼吸的研究对于阐明某些表型的分子机制, 如 Crabtree 和华宝效应2,3至关重要。Crabtree 效应的特点是酵通量增加, 线粒体呼吸抑制, 并建立发酵为主要途径生成 ATP 的存在高浓度的可发酵碳水化合物 (>0.8 毫米)4,5。华宝效应是代谢模拟到 Crabtree 效应, 不同的是, 在哺乳动物细胞, 发酵的主要产品是乳酸6。的确, 华宝效应是由多种癌细胞所表现出来的, 即使在氧气7的情况下, 也会引发葡萄糖的摄取和消耗。因此, 研究从呼吸到发酵的 Crabtree 效应的分子基础, 既有生物技术的影响 (乙醇的生产), 也有潜在的癌症研究的影响。
酵母的生长可能是研究 Crabtree 和华宝效应的合适工具。这个想法基于的事实是, 在酵母指数阶段, 用于生产 ATP 的中心途径是线粒体呼吸和发酵, 这是维持生长必不可少的。例如,酵母的生长与 ATP 生成通路的功能密切相关。在美国酿酒酵母中,线粒体呼吸产生的每葡萄糖分子大约有18个 atp 分子, 而发酵只产生2个 atp 分子, 因此预计生长速率与代谢通路有紧密的联系。生产 ATP8。在这方面, 当发酵是生成 atp 的主要途径时, 酵母通过提高葡萄糖摄取率来补偿低 atp 的产量。相反, 使用线粒体呼吸作为主要 ATP 来源的酵母细胞的葡萄糖消耗量是低的。这表明, 在确定 ATP 的生成方式之前, 酵母对碳水化合物的可用性有很重要的意义。因此, 葡萄糖的有效性在酵母发酵和线粒体呼吸之间的转换中起着重要的作用.在大量葡萄糖的存在下, 酵母更倾向于发酵作为生成 ATP 的中心途径。有趣的是, 当酵母发酵时, 特定的生长速率保持在最大值。另一方面, 在低血糖水平下,酵母通过线粒体呼吸产生 ATP, 维持较低的生长速率。因此, 葡萄糖浓度的变化和其他碳源的使用导致酵母在发酵和呼吸生长之间的偏好发生变化。考虑到这一事实的指数增长方程, 可以获得的生物意义的动力学参数, 如加倍时间 (Dt) 和特定增长率 (µ)。例如, 当酵母使用线粒体呼吸作为主要途径时, 发现了较低的µ值。相反, 在有利于发酵的条件下, 发现了较高的µ值。这种方法可用于测量任何影响酵母发酵和线粒体呼吸的化学物质的可能机制.
本文的目的是提出一种基于生长动力学的方法来筛选特定物质/化合物对线粒体呼吸或发酵的影响。
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Protocol
1. 文化媒体和接种准备
- 准备100毫升2% 酵母萃取物-蛋白胨-葡萄糖 (YPD) 液体培养基 (添加1克酵母萃取物, 2 克酪蛋白蛋白胨, 2 克葡萄糖到100毫升蒸馏水)。将3毫升的介质放入15毫升消毒锥形管中。在121摄氏度和 1.5 psi 的情况下, 将介质蒸压15分钟。
注: 介质可存储至多一个月的4–8°c。 - 用3毫升的凉无菌 2% YPD 汤和 250 ul 的酵母细胞, 在-20 摄氏度的甘油中保存一只锥形管接种.在30摄氏度的轨道振动筛中一夜之间孵化, 200 转每分钟搅拌。
- 将培养皿 (60 x 15 毫米2) 填充为无菌 2% YPD 琼脂 (添加10克酵母提取物, 20 克酪蛋白蛋白胨, 20 克葡萄糖, 20 克细菌琼脂到1000毫升蒸馏水) 与细胞生长在锥形管使用无菌循环。孵育培养皿在30摄氏度, 直到孤立的殖民地显示增长。
- 准备前接种通过接种一个单一的孤立的殖民地到一个圆锥形管填充10毫升的凉爽无菌 2% YPD 汤和孵化它隔夜30°c 与连续搅拌在 200 rpm。
2. 微板块中的培养基和生长曲线
- 准备10毫升 1% YPD 汤 (添加0.1 克酵母提取物, 0.2 克的蛋白胨, 0.1 克葡萄糖到10毫升蒸馏水), 10 毫升 2% YPD 汤 (添加0.1 克酵母提取物, 0.2 克的蛋白胨, 0.2 克葡萄糖到10毫升蒸馏水), 10 毫升 10% YPD 汤 (添加0.1 克酵母提取物, 0.2 克蛋白胨, 1 克葡萄糖到10毫升蒸馏水)。在121摄氏度和 1.5 psi 的情况下, 这些生长培养基为15分钟。
注: 培养基作为发酵生长的控制。 - 制备10毫升2% 酵母萃取物-蛋白胨-乙醇 (YPE) 汤和10毫升2% 酵母萃取物-蛋白胨-甘油 (YPG) 汤。2% YPE: 添加0.1 克酵母萃取物, 0.2 克的蛋白胨, 0.2 毫升乙醇到10毫升蒸馏水。2% YPG: 添加0.1 克酵母萃取物, 0.2 克的蛋白胨, 和0.2 毫升甘油到10毫升蒸馏水。在121摄氏度和 1.5 psi 的情况下, 这些生长培养基为15分钟。
注: 甘油和乙醇是非发酵的碳源, 完全代谢的线粒体呼吸。因此, 它们被用作呼吸生长控制。在这一步骤中, 可以改变培养基中碳源的类型和浓度, 用酵母萃取物-蛋白胨 (YP) 汤 (10 克酵母提取物和20克酪蛋白蛋白胨在1000毫升蒸馏水中) 作为基础来测试对生长表型的影响。为了测试除碳以外其他营养素的影响, 合成完全 (SC) 培养基根据实验的目的进行补充。SC 培养基的基部为1.8 克, 无氨基酸的酵母氮基, 5 克硫酸铵 [(NH4)2所以4], 1.4 克磷酸味精 (NaH2PO4), 2 毫升的蒸馏水中的滴出混合的克。在所需浓度下, 用碳源和附加氮源补充介质。 - 添加 145 ul 的适当培养基为实验设计的每一个无菌微板块 (10 x 10 井) 与盖子和接种他们与 5 ul 的前接种。
注: 如果目的是筛选物质/化合物对酵母的能量代谢的影响, 该物质/化合物应添加在此步骤。此外, 任何类型的微板块有盖子应该是有用的。 - 在30摄氏度的微板块阅读器中孵化多井板, 在 200 rpm 时以恒定的搅拌为48小时. 测量光学密度 (OD) 在600毫微米每30或60分钟。
注: 如果微板块阅读器没有选择孵化微板块, 它可能会孵化在一个轨道振动筛在相同的条件之间的每测量 OD。
3. 摇锥烧瓶的生长曲线
- 将适当培养基的4.8 毫升加入20毫升锥形烧瓶和高压釜。接种每瓶 200 ul 的前接种文化在 OD600nm ~ 2 在凉爽, 无菌 2% YPD 汤。孵化他们在30°c 以恒定的鼓动在250转每分钟 24 h。
注: 如果潜伏期大于24小时, 将适当培养基的12毫升添加到50毫升锥形烧瓶和高压釜内。用前接种的 500 ul 给他们接种疫苗。同样重要的是要考虑发酵生长控制 (YP 培养基与 1%, 2% 或10% 葡萄糖) 和呼吸生长控制 (YP 培养基与2% 甘油或乙醇)。 - 采取 100 ul 的动摇锥形瓶养殖和稀释它在 900 ul 的蒸馏水在1毫升分光光度计试管, 并轻轻混合吹打。每2小时用分光光度计测量 600 nm 的 OD。要获得真正的 OD, 将结果乘以十。
4. 数据处理和动力学参数计算
-
在统计软件包软件中创建一个新的项目文件。在"新表和图形"部分中, 选择"XY"选项。
- 选择 "示例数据"部分中的选项: "从空数据表开始" 。
- 选择"点和连接线"图形类型。将 " X"部分保留在 "Subcolumns 用于复制或错误值" 部分中, 并在"Y"部分选择选项: "输入 (10) 并排复制值 Subcolumns 和绘制平均值和错误 SD"。单击 "创建" 按钮。
注意: 表格格式有一个 X 列和几个 Y 列, 每个都有 10 subcolumns 以前选择的。
- 写下 X 柱 (例如0、30、60、90分钟或0、1、1.5、2 h) 的 OD 测量时间。在 Y 列中, 写出从区域性获取的 OD 值。
- 确定将 Y 列数据转换成对数的指数增长阶段。单击"分析"按钮, 选择"转换"分析, 使用 y = 日志 (y) 选择 y 值。转到"结果库", 选择"变换"数据表, 点击"分析"按钮, 选择"线性回归"分析。排除不遵循线性行为的 OD 值。若要排除值, 请在数据表中选择它们, 然后键入"ctrl+ E"。
注意: 重要的是要排除不跟随指数相位的值, 因为指数增长方程与指数相很吻合。 - 在"数据表库"中, 选择数据表"数据 1"。单击 "分析"按钮, 然后选择 " XY 分析" 中的 "非线性回归 (曲线拟合)" 分析。
- 选择要分析的数据集, 然后单击"确定"按钮。在"适合"选项卡选择"指数方程"部分, 并选择"指数增长方程" (, 其中x是细胞浓度, x0 是细胞浓度在零时间, μ是特定的增长率, t是时间)。使用"最小二乘匹配"作为拟合方法, 并保留未选定的插值部分。单击"确定"按钮。
注: 具有非线性拟合结果的制表符位于"结果库"中。该软件计算加倍时间 (Dt) 和特定增长率 (μ)。软件在 "结果" 选项卡中显示μ为K 。 - 打开一个新的项目文件, 在"新建表和图形"部分中, 选择列选项。选择"从空数据表开始"选项, 然后选择所需的图表。选择用 SD 绘制平均值. 选择"创建"按钮。
- 从"结果库"中的 "非线性拟合结果" 选项卡中复制μ或Dt值, 并将其粘贴到列中。最后, 选取 "分析"按钮, 在"柱分析"部分选取所需分析, 比较不同营养条件下的动力学参数。
注: 从发酵生长控制 (YP 培养基与1%、2% 或10% 葡萄糖) 和呼吸生长控制 (YP 培养基与2% 甘油或乙醇) 获得的动力学参数有助于建立发酵和线粒体呼吸的门槛,分别。从营养状况和物质/化合物测定与呼吸和发酵生长的动力学参数进行比较有助于确定可能对呼吸或发酵代谢的影响。
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Representative Results
生长曲线可用于对酵母菌的呼吸和发酵表型进行初步判别。因此, 我们进行了不同的葡萄糖浓度的酵母(BY4742) 的批次培养, 这些都被报告为诱导发酵生长: 1%, 2% 和 10% (瓦特/v)9。显示发酵表型的文化有一个小的滞后阶段和一个指数阶段以高增长率 (图 1)。乙醇、甘油和乳酸是一种只有通过呼吸才能代谢的碳源;因此, 我们使用这些碳源来进行酵母的培养。主要通过氧化磷酸化获得能量的文化在指数阶段表现出较长的滞后阶段和缓慢的生长速率 (图 2)。
分析增长曲线只提供定性信息;因此, 计算动力学参数以获得定量信息是很重要的。我们用指数增长方程计算了Dt和μ (图 3)。我们设定了一个阈值的呼吸生长值在Dt ≥11.5 h 和μ ≤0.059/小时。发酵生长的阈值设置在Dt ≤6.5 h 和μ ≥0.149 (图 3)。
为了证明这个筛查工具的用处, 我们设计了三项实验, 第一次评估不同的白藜芦醇 (呼吸道合胞菌) 浓度对不同能量状态下的酵母BY4742 细胞的影响 (图 4) 在动摇的烧瓶。第二个实验旨在检测不同硫酸铵 (NH4+) 浓度对微板块酵母BY4742 (图 5) 能量代谢的影响。最后, 第三个目的是说明碳源的变化如何影响两种不同的酵母菌的发酵生长 (W303 和用于啤酒发酵的工业 WLP530) (图 6).在实验中采用胞内合病毒, 改变葡萄糖浓度, 改变细胞的能量状态。在10% 葡萄糖, 所有的呼吸道合胞病毒浓度测试没有改变酵母的 respiro 发酵阶段, 但确实减少了呼吸阶段 (在 diauxic 转移, S. 酵母代谢在指数阶段产生的乙醇氧化磷酸化)。μ值证实, 在所有的条件下测试, S. 酵母显示发酵行为, 与它的表型相比, 当生长在2% 甘油 (条件作为一个呼吸控制) (图 4a)。当细胞以1% 葡萄糖为动力时, μ值证实, 在0.1、1、10和100µM 合胞病毒中, respiro 发酵阶段的发酵行为不受影响。然而, 观察到 diauxic 移位期间呼吸期的减少。此外, 在浓度为1000µM, 合胞病毒完全抑制细胞生长。
在第二个实验中, 细胞补充10% 葡萄糖, 这一浓度被认为足以诱发 Crabtree 效应的酵母.因此, 我们可以观察补充不同浓度的 NH4+在发酵代谢中所促进的作用。Dt 值建议0.13、0.66 和 1.99% NH4+有利于发酵代谢, 并可以观察到生长曲线, 这些浓度延长了文化的指数阶段。然而, 在3.31% 毫米 NH4+, Dt 值的增量表明, 这种浓度诱导 respiro 发酵代谢。该表型显示在生长曲线上有一个延长的滞后阶段, 指数阶段的生长速度较慢 (图 5)。
在第三个实验中, 两种不同的酵母菌 (W303 和 WLP530) 的细胞生长在不同浓度的蔗糖或半乳糖中, 以检验碳源对d-t 值的影响是否应变依赖性。作为发酵控制, 两种菌株均生长在2% 葡萄糖中, 而Dt 值则被计算为发酵生长的阈值。菌株的发酵Dt 值不同, W303 菌株的≤3.25 h 和 WLP530 菌株的≤6.84 h。因此, 重要的是要强调验证的Dt 阈值的不同菌株使用。此外, 当蔗糖被用作碳源时, 在两种菌株中都观察到2% 和10% 的发酵表型。然而, 当使用半乳糖时, 菌株 W303 在测试的任何浓度中都没有表现出发酵行为, 而 WLP530 菌株则表现为2% 半乳糖的发酵表型。有趣的是, W303 菌株在所有浓度的碳源测试中都有增长。然而, WLP530 菌株并没有以最低的碳浓度 (0.01%) 显示生长。这可能是因为 WLP530 在啤酒行业中被使用, 而它所暴露的碳浓度通常要高得多 (图 6)。
从这三项实验中得到的数据证明, 生长曲线和动力学参数对酵母菌的呼吸和发酵生长的初步判别是有用的。此外, 重要的是要强调, 这是一个多才多艺的工具, 可用于不同方面的能量代谢研究。
图 1: 不同葡萄糖浓度对酵母生长表型的影响。生长曲线是通过测量 600 nm 每30分钟48小时的光学密度来构造的。当酵母细胞发酵时, 培养物在指数阶段呈现短滞后期和快速生长速率。respiro-发酵阶段可以其次是生长减速阶段 (呼吸阶段), 在那里发酵生产的乙醇用氧化磷酸化途径新陈代谢, 然后到达固定的阶段。数据显示为 "平均" 标准错误。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 可吸入碳源对酵母生长表型的影响。生长曲线是通过测量 600 nm 每30分钟的光密度为48小时的.酵母细胞在指数阶段表现出长期的滞后期和缓慢的生长速度, 一般没有表现出 diauxic 的变化。数据显示为 "平均" 标准错误。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 碳源的作用及其浓度对酵母动力学参数的影响。(a) 不同碳源下的酵母BY4742 生长的Dt 值;(b) BY4742酵母在不同碳源浓度下生长的μ值。数据显示为平均标准偏差。采用单向方差分析法 (p < 0.01 与2% 葡萄糖) 进行了统计学研究, 并进行了 Dunnett 试验。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 添加白藜芦醇对不同细胞能量状态的影响.(a) 使用10% 葡萄糖的生长表型和μ值;(b) 使用1% 葡萄糖的生长表型和μ值。将生长曲线中的数据作为平均标准误差, 并将μ值作为平均标准差进行了说明。对μ值的统计分析是使用单向方差法进行的, 其次是 Dunnett 的测试 [p < 0.01 与呼吸控制与2% 甘油 (RC)]。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 硫酸铵补充剂对酵母能量代谢的影响.生长曲线是通过测量每30分钟 600 nm 的光学密度为48小时的数据而建立的. 以生长曲线为平均值的标准误差, 以μ值为平均值的标准差。对Dt 值进行统计分析的方法是, 采用单向方差法, 其次是 Dunnett 的测试 [p < 0.01 与呼吸控制与2% 甘油 (RC)]。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 半乳糖和蔗糖浓度对酿酒酵母发酵代谢的影响.(a) W303 实验室应变的dt 值和 (b) WLP530 工业菌株的dt 值。数据显示为平均标准偏差。对Dt 值的统计分析是使用单向方差法进行的, 其次是 Dunnett 的测试 [p < 0.01与2% 葡萄糖 (发酵控制)]。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
自从 j. Monod10表示, 对细菌培养的研究是微生物学的基本方法, 已经过去了很长一段时间。分子工具的出现延缓了生长作为一种技术的使用和研究。尽管增长的复杂性涉及许多相互关联的过程, 但它的基本机制可以用数学模型11来描述。这是一个健壮的方法, 可作为一个补充工具, 以阐明最复杂的分子机制12。
要获得此方法的可靠结果, 必须考虑以下关键步骤。250转每分钟的搅动对实现呼吸生长的低碳源的良好生长至关重要, 因为当使用较低的搅拌速度 (150–180 rpm) 时, 我们观察到呼吸条件的增长减少。重要的是启动该协议使用一个新鲜的股票, 这也是必要的保持一个统一的表型在化验。生长动力学阈值变化在菌株之间, 必须根据所用的条件进行验证。GraphPad 棱镜软件的提出是因为指数增长方程已经预加载;然而, 任何其他软件是适当的, 只要它允许编程的指数增长方程。在微板块, 建议包括三井与 150 ul 的增长媒体没有接种-这是一个控制, 表明, 如果微板块井已遭受污染。
必须指出, 在线性尺度上绘制 OD 数据可能很难确定对数生长阶段。这一问题可以通过在对数表中绘制 OD 数据来克服, 从而使滞后相位和对数生长阶段清晰可见。
该协议仅用于筛选表型, 因此必须确认对发酵和线粒体呼吸的具体影响。我们建议通过氧消耗量测定13,14, 而发酵可由乙酸、琥珀酸、甘油和乙醇等副产品的积累来确定线粒体呼吸量的量化..
酵母的生长已经成为理解分子机制和表型的一种手段, 从筛选到测试化验的方法.然而, 许多实验设计在文学使用酵母增长仅作为定性参量 (例如,板材稀释或成长曲线), 因此这些技术的就业忽略有价值的证据。例如, 用于计数微生物种群或制稀释的琼脂板中的氧气有限, 在呼吸系统条件下使生长测量复杂化。此外, 当两个或更多的细胞保持连接, 只有一个群体被观察到。另一个限制是使用增长曲线作为视觉结果来突出增长的差异, 这可能会撇开关于微妙差异的事实。因此, 将生长信息转化为定量参数, 就可以取得关于所施加表型的精确数据。然而, 增长的数学表示是一个复杂的科学企业。大多数研究都检查微生物的完全生长 (滞后、对数和固定相), 获得只提供一个环境条件的高阶多项式方程。尽管用线性回归法计算这些方程的系数相对简单, 但很难将它们赋给固有的生物意义15。分离生长阶段对生长的分析是数学上可靠和直接的。一个例子是指数增长方程, 它是基于一阶动力学的, 适合于短滞后相和指数相。
最后, 利用指数生长方程研究测井阶段, 是了解线粒体呼吸或发酵对特定化合物或环境影响的一致方法。作为概念的证明, 指数阶段的增长量化表明, 呼吸道合胞病毒特别影响呼吸增长13,14。在这里, 增长是一个宝贵的工具, 以确定RIM15删除可能改善发酵代谢的部分抑制呼吸能力的9。这些数据证实观察生长允许研究发酵和呼吸代谢, 是一个简单和可靠的方法。因此, 这种方法可以筛选特定物质对线粒体呼吸或发酵的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这一项目得到了委员会 Ciencia y Tecnología (赠款号 293940) 和基金会 TELMEX-TELCEL (赠款号 162005585) 的赠款的支助, 两者都是 IKOM。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
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