Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Atemwege und fermentativen Stoffwechsel durch den Einbau des exponentiellen Wachstums von Saccharomyces Cerevisiae exponentielles Wachstum Gleichung zu schätzen. Berechnung der kinetischen Parameter kann für das Screening der Einflüsse der Stoffe/Verbindungen auf Gärung oder mitochondriale Atmung.
Abstract
Saccharomyces Cerevisiae Zellen in der exponentiellen Phase unterstützen ihr Wachstum durch die Produktion von ATP durch Gärung und/oder mitochondriale Atmung. Der vergärbaren Kohlenstoffgehalt regelt vor allem, wie die Hefezellen ATP erzeugen; so treibt die Variation in vergärbare Kohlenhydrate Ebenen den Energiestoffwechsel von S. Cerevisiae. Dieses Whitepaper beschreibt eine Hochdurchsatz-Methode basiert auf exponentielle Hefe Wachstum, die Auswirkungen von Änderungen der Konzentration und Art der Kohlenstoffquelle auf Atemwege und fermentativen Stoffwechsel zu schätzen. Das Wachstum von S. Cerevisiae ist in einer Mikrotestplatte gemessen oder geschüttelt konischen Kolben durch die Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm. Dann baut eine Wachstumskurve durch Plotten OD im Vergleich zur Zeit, was ermöglicht die Erkennung und Auswahl der exponentiellen Phase und ist ausgestattet mit der exponentiellen Wachstums-Gleichung, kinetische Parameter zu erhalten. Geringen spezifischen Wachstumsraten mit höheren Verdoppelung Zeit repräsentieren in der Regel eine respiratorische Wachstum. Im Gegensatz dazu zeigen höhere spezifische Wachstumsraten mit niedrigeren Verdoppelung Mal fermentative Wachstum. Grenzwerte der Verdoppelung der Zeit und spezifischen Wachstumsrate sind anhand der bekannteste Atem- oder fermentative Bedingungen wie nicht vergärbaren Kohlenstoffquellen oder höhere Konzentrationen an vergärbaren Zucker geschätzt. Dies ist für jede spezifische Belastung erreicht. Schließlich sind die berechneten kinetischen Parameter gegenüber der Schwellenwerte um festzustellen, ob die Hefe fermentative und/oder Atemwege Wachstum zeigt. Der Vorteil dieser Methode ist die relative Einfachheit für das Verständnis der Auswirkungen einer Substanz/Verbindung auf fermentative oder respiratorischen Stoffwechsel. Es ist wichtig, hervorzuheben, dass das Wachstum eines komplizierten und komplexen biologischen Verfahrens; vorläufige Daten aus dieser Methode müssen daher durch die Quantifizierung der Sauerstoffverbrauch und Akkumulation von Gärreste erhärtet werden. Dabei kann diese Technik als eine Vorauswahl von Verbindungen/Substanzen verwendet werden, die möglicherweise stören oder fermentativer oder respiratorischen Stoffwechsel.
Introduction
Saccharomyces Cerevisiae Wachstum diente als ein wertvolles Werkzeug, Dutzende von physiologischen und molekularen Mechanismen zu identifizieren. Wachstum wird hauptsächlich durch drei Methoden gemessen: Verdünnungsreihen für Stichproben, koloniebildenden Stückzählen und Wachstumskurven. Diese Techniken können allein oder in Kombination mit einer Vielzahl von Substraten, Umweltbedingungen, Mutanten und Chemikalien verwendet werden, um konkrete Antworten oder Phänotypen zu untersuchen.
Mitochondriale Atmung ist ein biologischer Prozess, in dem Wachstum Kinetik erfolgreich angewendet wurde für die Entdeckung unbekannter Mechanismen. In diesem Fall die Supplementierung von Wachstumsmedien mit nicht vergärbaren Carbon Quellen wie z. B. Glycerin, Lactat oder Ethanol (die ausschließlich durch die mitochondriale Atmung metabolisiert werden), denn die einzige Quelle für Kohlenstoff und Energie ermöglicht eine Bewertung der Atemwege Wachstum, das ist wichtig, um Störungen in Oxidative Phosphorylierung Aktivität1zu erkennen. Auf der anderen Seite ist es kompliziert, kinetische Wachstumsmodelle als eine Methode für die Entschlüsselung der Mechanismen hinter Gärung zu verwenden.
Das Studium der Gärung und die mitochondriale Atmung ist wichtig, die molekularen Mechanismen hinter bestimmten Phänotypen wie der Crabtree und Warburg Effekte2,3aufzuklären. Die Crabtree-Effekt zeichnet sich durch eine Steigerung der glykolytischen Flussmittel, Unterdrückung der mitochondrialen Atmung und Einrichtung der Gärung als der primäre Weg zum ATP in Gegenwart von hohen Konzentrationen von vergärbare Kohlenhydrate generieren (> 0,8 mM)4,5. Die Warburg-Effekt ist metabolisch analog zu der Crabtree-Effekt, mit dem Unterschied, dass in Säugerzellen, das Hauptprodukt der Gärung Laktat6ist. In der Tat ist der Warburg-Effekt durch eine Vielzahl von Krebszellen auslösen Glukoseaufnahme und Verbrauch auch in Gegenwart von Sauerstoff7ausgestellt. Dabei hat untersuchen die Molekulare Grundlagen der die Umstellung von Atmung auf Gärung in der Crabtree-Effekt biotechnologische folgen (für Ethanol-Produktion) und mögliche Auswirkungen in der Krebsforschung.
S. Cerevisiae Wachstum möglicherweise ein geeignetes Instrument zur Untersuchung der Auswirkungen von Crabtree und Warburg. Diese Idee ist, dass in der Hefe exponentielle Phase, die zentrale Wege verwendet, um ATP zu produzieren sind mitochondriale Atmung und Gärung, die wesentlich für nachhaltiges Wachstum. Zum Beispiel ist das Wachstum von S. Cerevisiae die Funktion der ATP-Erzeugung Bahnen eng verwandt. In S. Cerevisiae, die mitochondriale Atmung produziert ca. 18 ATP-Moleküle pro Glucose-Molekül während der Gärung nur 2 ATP-Moleküle erzeugt wird daher erwartet, dass die Wachstumsrate enge Verbindungen mit der Stoffwechselwege hat Herstellung von ATP8. In diesem Zusammenhang bei der Gärung ist der Hauptweg, ATP zu generieren, kompensiert die Hefe die geringe ATP-Produktion durch Erhöhung der Glukoseaufnahme. Im Gegenteil, ist der Glukose-Verbrauch von Hefezellen, die mitochondriale Atmung als die Hauptquelle der ATP zu verwenden gering. Dies bedeutet, dass es wichtig für die Hefe zu Sinn Kohlenhydrat Verfügbarkeit vor der Entscheidung, wie ATP generiert wird. Daher Glukose Verfügbarkeit spielt eine wichtige Rolle in der Wechsel zwischen Gärung und die mitochondriale Atmung in S. Cerevisiae. In Anwesenheit von hohen Mengen an Glukose bevorzugt die Hefe Gärung als die zentrale Route um ATP zu erzeugen. Interessant ist, wenn die Hefe Gärung ist, bleibt der spezifischen Wachstumsrate maximal. Auf der anderen Seite unter den niedrigen Niveaus von Glukose produziert S. Cerevisiae ATP mitochondriale Atmung mit geringere Wachstumsraten beibehalten. Dabei Unterschiede in der Konzentration von Glukose und die Verwendung von anderen Kohlenstoffquellen induzieren Veränderungen in der Hefe Präferenz zwischen fermentative und Atemwege Wachstum. Unter Berücksichtigung dieser Tatsache mit der exponentiellen Wachstums-Gleichung kann man die biologische Bedeutung der kinetischen Parameter wie die Verdoppelung der Zeit (Dt) und spezifischen Wachstumsrate (µ) erhalten. Zum Beispiel wurden niedrigere µ -Werte gefunden, wenn die Hefe mitochondriale Atmung als primäre Pfad verwendet. Im Gegenteil, fanden sich unter Bedingungen, die Gärung zu begünstigen, höhere µ -Werte. Diese Methode kann verwendet werden, um die wahrscheinlichen Mechanismen von Chemikalien die Gärung und mitochondriale Atmung in Messen S. Cerevisiae.
Das Ziel dieses Papiers ist es, eine Methode basierend auf Wachstum Kinetik für das screening der Auswirkungen einer bestimmten Substanz/Verbindung auf mitochondriale Atmung oder Gärung.
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Protocol
(1) Kultur, Medien und Inokulum Vorbereitung
- 100 mL 2 % Hefe-Extrakt-Pepton-Traubenzucker (YPD) flüssigen Medium vorbereiten (1 g Hefe-Extrakt, Kasein Pepton, 2 g und 2 g Glucose in 100 mL destilliertem Wasser hinzufügen). 3 mL der Medien in 15 mL sterilisierbare konische Rohre zu verzichten. Autoklaven der Medien für 15 min bei 121 ° C und 1,5 Psi.
Hinweis: Der Datenträger kann bis zu einem Monat bei 4 – 8 ° c aufbewahrt werden - Impfen Sie eine konische Rohr gefüllt mit 3 mL cool steril 2 % YPD Brühe mit 250 μL von S. Cerevisiae Zellen erhalten in Glycerin bei-20 ° C. Über Nacht in einem Orbitalschüttler bei 30 ° C unter Rühren bei 200 u/min inkubieren.
- Streifen einer Petrischale (60 x 15 mm2) mit sterilen 2 % YPD Agar gefüllt (10 g Hefe-Extrakt, 20 g Casein Pepton, 20 g Glukose, und 20 g bakteriologische Agar auf 1.000 mL destilliertem Wasser hinzufügen) mit den Zellen in das konische Rohr mit einer sterilen Schleife angebaut. Inkubieren Sie die Petrischale bei 30 ° C, bis die isolierte Kolonien Wachstum zeigen.
- Bereiten Sie das Pre-Inokulum durch impfen eine einzelne isolierte Kolonie in einem konischen Rohr gefüllt mit 10 mL cool steril 2 % YPD Brühe und inkubieren Sie es über Nacht bei 30 ° C mit kontinuierliche Agitation bei 200 u/min.
(2) Kultur, Medien und Wachstumskurven in Mikrotestplatte
- 10 mL von 1 % YPD Brühe vorbereiten (0,1 g Hefe-Extrakt, 0,2 g Pepton, und 0,1 g Glukose auf 10 mL destilliertem Wasser hinzufügen), 10 mL 2 % YPD Brühe (0,1 g Hefe-Extrakt, 0,2 g Pepton, und 0,2 g Glukose auf 10 mL destilliertem Wasser hinzufügen) , und 10 mL 10 % YPD Brühe (0,1 g Hefe-Extrakt, 0,2 g Pepton, und 1 g Glukose zu 10 mL destilliertem Wasser hinzufügen). Autoklaven diese Wachstum Medien für 15 min bei 121 ° C und 1,5 Psi.
Hinweis: Die Nährmedien dient zur Kontrolle der fermentativen Wachstum. - 2 % Hefe-Extrakt-Pepton-Ethanol (YP) Brühe 10 mL und 10 mL 2 % Hefe-Extrakt-Pepton-Glycerin (YPG) Brühe vorbereiten. 2 % YPE: 0,1 g Hefe-Extrakt, 0,2 g Pepton, und 0,2 mL Ethanol, 10 mL destilliertem Wasser hinzufügen. 2 % YPG: 0,1 g Hefe-Extrakt, 0,2 g Pepton, und 0,2 mL Glycerin zu 10 mL destilliertem Wasser hinzufügen. Autoklaven diese Wachstum Medien für 15 min bei 121 ° C und 1,5 Psi.
Hinweis: Glycerin und Ethanol sind nicht vergärbaren Kohlenstoffquellen, die ausschließlich durch die mitochondriale Atmung metabolisiert werden. Aus diesem Grund werden sie als eine respiratorische Wachstum-Steuerelemente verwendet. In diesem Schritt können die Art und Konzentration der Kohlenstoffquelle in den Kulturmedien geändert werden, um die Auswirkungen auf Wachstum Phänotyp mit Hefe-Extrakt-Pepton (YP) Brühe (10 g Hefeextrakt und 20 g Casein Pepton in 1.000 mL destilliertem Wasser) als Basis zu testen. Um die Effekte von anderen Nährstoffen neben Kohlenstoff zu testen, wird synthetisches komplettes (SC) Medium nach dem Ziel des Experiments ergänzt. Die Basis für SC-Medium ist 1,8 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren, 5 g Ammoniumsulfat [(NH4)2SO4], Mononatrium-Phosphat (NaH2PO4) 1,4 g und 2 g Drop-Out in 1.000 mL destilliertem Wasser mischen. Die Medien mit einer Kohlenstoffquelle und zusätzliche Stickstoffquelle in den erforderlichen Konzentrationen zu ergänzen. - Fügen Sie 145 μL der geeignete Kulturmedien für experimentelles Design in jede Vertiefung eine sterile Mikrotestplatte (10 x 10-Well) mit Deckel und mit 5 μL des Inokulums Pre zu impfen.
Hinweis: Wenn das Ziel ist den Einfluss der Stoffe/Verbindungen auf den Energiestoffwechsel der Hefe auf den Bildschirm, sollte diese Substanz/Verbindung während dieses Schritts hinzugefügt werden. Darüber hinaus sollte jede Art von Mikrotestplatte mit Deckel nützlich sein. - Inkubieren Sie die Multi-well-Platte in einem Mikrotestplatte Reader bei 30 ° C mit ständiger Bewegung bei 200 u/min für 48 h Maßnahme die optische Dichte (OD) bei 600 nm alle 30 oder 60 Minuten.
Hinweis: Die Mikrotestplatte Leser die Möglichkeit, die Mikrotestplatte inkubieren nicht kennt, kann in einem Orbitalschüttler zu den gleichen Konditionen zwischen jeder Messung der OD inkubiert werden.
(3) Wachstumskurven in erschüttert konische Flaschen
- 20 mL konische Flaschen und Autoklaven 4,8 mL geeignete Kulturmedien hinzufügen. Jede Flasche mit 200 μL der Pre-Inokulum Kultur an OD600nm ~ 2 in kühlen, sterile 2 % YPD Brühe zu impfen. Inkubieren sie bei 30 ° C mit ständiger Bewegung bei 250 u/min für 24 h.
Hinweis: Ist die Inkubationszeit höher als 24 h, fügen Sie 12 mL geeignete Kulturmedien zu 50 mL konische Flaschen und Autoklaven hinzu. Mit 500 μL des Inokulums Pre zu impfen. Es ist auch wichtig, die fermentative Wachstum (YP-Medien mit 1 %, 2 % oder 10 % Glukose) und Atemwege Wachstum (YP-Medien mit 2 % Glycerin oder Ethanol) zu berücksichtigen. - Nehmen Sie 100 μL der erschüttert konischen Kolben Kultur in 900 μl destilliertes Wasser in einem Spektrophotometer Küvette 1 mL verdünnen und vorsichtig mischen durch pipettieren. Messen Sie die OD bei 600 nm mit einem Spektralphotometer alle 2 h. Um die echte OD zu erhalten, Multiplizieren Sie das Ergebnis durch 10.
(4) die Verarbeitung der Daten und Berechnung der kinetischen Parameter
-
Erstellen Sie eine neue Projektdatei in der Statistik-Paket-Software. Im Abschnitt "neue Tabelleund Diagramm" die Option "XY" .
- Wählen Sie die Option: "Beginnen Sie mit einer leeren Tabelle" im Abschnitt "Sample-Daten" .
- Wählen Sie den Diagrammtyp "Punkte und Verbindungsleitung" . Abschnitt "X" im Segment "Abschnittshäufigkeit für Replikate oder Fehlerwerte" deaktiviert lassen, und in der "Y" Abschnitt wählen Sie die Option: "Geben Sie (10) replizieren Werte in nebeneinander abschnittshäufigkeit und des Grundstückes bedeuten und Fehler SD". Klicken Sie auf die Schaltfläche "erstellen".
Hinweis: Das Tabellenformat hat eine X-Spalte und mehrere Y-Spalten, jeweils mit 10 abschnittshäufigkeit, die zuvor ausgewählt.
- Schreiben Sie das Mal auf welche OD Messungen in der X-Spalte durchgeführt wurden (z. B. 0, 30, 60, 90 min. oder 0, 1, 1,5, 2 h). Schreiben Sie in den Spalten Y die OD-Werte aus den Kulturen gewonnen.
- Identifizieren der exponentiellen Wachstumsphase Y Spaltendaten in Logarithmen zu verwandeln. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" , wählen die "Transform" Analyse, Y-Werte mit Y = Log(Y). Gehen Sie in die "Galerie der Ergebnisse", wählen Sie "Transform" Datentabelle, klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" , und wählen Sie "lineare Regressionsanalyse". Schließen Sie die OD-Werte, die kein lineares Verhalten folgen. Um Werte auszuschließen, wählen sie in der Datentabelle und geben Sie "STRG + E".
Hinweis: Es ist wichtig, um Werte auszuschließen, die nicht die exponentielle Phase folgen, da die exponentielle Wachstum Gleichung gut zu der exponentiellen Phase passt. - In der "Galerie Datentabellen"wählen Sie die Datentabelle "Data 1". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Analysieren" und wählen Sie die "Nicht-lineare (Fit Kurve)" Regressionsanalyse unter "XY-Analysen".
- Wählen Sie die Datensätze zu analysieren, und klicken Sie auf die Schaltfläche "OK" . Wählen Sie im Register "Fit" Abschnitt "Exponentielle Gleichung" und dann "exponentielles Wachstum Gleichung" (, wo X Zellkonzentration, X0 ist Zellkonzentration Zeitpunkt Null μ ist der spezifischen Wachstumsrate, und t ist Zeit). Verwenden Sie der "kleinsten Quadrate passen" , als eine passende Methode und lassen Sie nicht ausgewählten Abschnitt "interpolieren". Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK" .
Hinweis: Die Registerkarte mit den nicht-linearen Fit Ergebnissen ist in der "Galerie der Ergebnisse". Die Software berechnet die doppelte Zeit (Dt) und spezifische Wachstumsrate (μ). Die Software zeigt μ als K in der Registerkarte "Ergebnisse". - Öffnen Sie eine neue Projektdatei enthält, und wählen Sie im Abschnitt "neue Tabelle und Diagramm" die Spalte Auswahl. Wählen Sie die Option "Beginnen Sie mit einer leeren Tabelle" und wählen Sie die gewünschte Grafik. Wählen Sie den Mittelwert mit der SD. Wählen Sie die Schaltfläche "Erstellen" Plotten.
- Kopieren Sie μ oder Dt -Werte aus der Registerkarte nichtlineare Fit Ergebnisse, die in der "Galerie der Ergebnisse" ist und fügen Sie sie in einer Spalte. Schließlich wählen Sie die Schaltfläche "Analysieren" und wählen Sie die gewünschte Analyse im Abschnitt "Spalte Analysen" , die kinetischen Parameter der verschiedenen nutrimental Bedingungen zu vergleichen.
Hinweis: Die kinetischen Parameter aus der fermentativen Wachstum Steuerelemente (YP-Medien mit 1 %, 2 % oder 10 % Glukose) und Atemwege Wachstum Steuerelemente (YP-Medien mit 2 % Glycerin oder Ethanol) hilft die Schwelle der fermentativen und mitochondriale Atmung zu etablieren, bzw.. Vergleich der kinetischen Parameter vom Ernährungszustand und Substanz/Verbindung mit dem Atmungs- und fermentative Wachstum untersucht identifizieren die möglichen Auswirkungen auf die Atemwege oder fermentativer Stoffwechsel.
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Representative Results
Wachstumskurven lässt sich vorläufig zwischen Atem- und fermentative Phänotypen in der Hefe S. Cerevisiae zu unterscheiden. Daher führten wir Batch Kulturen von S. Cerevisiae (BY4742) mit verschiedenen Glukosekonzentration, die fermentative Wachstum induzieren gemeldet wurden: 1 %, 2 % und 10 % (w/V)9. Zeigt einen fermentativen Phänotyp Kulturen haben eine kleine Verzögerung und eine exponentielle Phase mit einer hohen Wachstumsrate (Abbildung 1). Ethanol, Glyzerin und Laktat sind die Kohlenstoffquellen, die nur durch Atmung metabolisiert werden können; So führten wir Kulturen der Hefe verwenden diese Kohlenstoffquellen. Kulturen, die vor allem durch Oxidative Phosphorylierung Energiegewinnung zeigten eine längere Verzögerung Phase und langsame Wachstumsrate in der exponentiellen Phase (Abbildung 2).
Analyse von der Wachstumskurven liefert nur qualitative Informationen; Daher ist es wichtig, die kinetischen Parameter für quantitative Informationen zu berechnen. Wir berechnen die Dt und μ unter Verwendung der Gleichung exponentielles Wachstum (Abbildung 3). Wir setzen einen Schwellenwert für die Atemwege Wachstumswerte auf Dt ≥11.5 h und μ ≤0.059 / h. Den Schwellenwert für die fermentative Wachstum war bei Dt ≤6.5 h und μ ≥0.149 / h (Abbildung 3).
Um zu beweisen, die Nützlichkeit dieses Screening-Tools haben wir entwickelt drei Experimente mit dem ersten für die Bewertung der Auswirkungen der verschiedenen Resveratrol (RSV) Konzentrationen auf S. Cerevisiae BY4742 Zellen mit verschiedenen energetischen Status (Abbildung 4) in Fläschchen geschüttelt. Das zweite Experiment zielte darauf ab, die Auswirkungen der verschiedenen Ammoniumsulfat (NH4+) Konzentrationen auf den Energiestoffwechsel von S. Cerevisiae BY4742 erkennen (Abbildung 5) in einer Mikrotestplatte. Schließlich die dritte soll veranschaulichen, wie Veränderungen in Kohlenstoffquelle fermentative Wachstum in zwei verschiedenen beeinflussen S. Cerevisiae -Stämmen (W303 und dem industriellen WLP530 für Bier Gärung verwendet) (Abbildung 6). Im Experiment mit RSV wurde energetischen Status der Zelle durch Glukosekonzentration Variation geändert. Bei 10 % Glukose, alle RSV-Konzentrationen getestet Respiro fermentative Phase der Hefe nicht ändern aber verringerte die Atemwege Phase (während der Diauxic Schicht, S. Cerevisiae metabolisiert das Ethanol produziert in der exponentiellen Phase durch Oxidative Phosphorylierung). Die μ -Werte bestätigt, dass unter allen Bedingungen getestet, S. Cerevisiae fermentative Verhalten, im Gegensatz zu seinen Phänotyp wenn in 2 % Glycerin (Bedingung als eine Atmungskontrolle) gewachsen zeigte (Abb. 4a). Wenn Zellen mit 1 % Glukose nur erregt wurden, bestätigt die μ -Werte von 0,1, 1, 10 und 100 µM RSV fermentative Verhalten in der Respiro fermentative Phase nicht beeinträchtigt wurde. Jedoch wurde eine Abnahme in der Atemwege Phase während der Diauxic Schicht beobachtet. Darüber hinaus in einer Konzentration von 1.000 µM, RSV vollständig gehemmt Zellwachstum.
Im zweiten Experiment wurden Zellen ergänzt mit 10 % Glucose, eine Konzentration ausreichend induzieren die Crabtree-Effekt in S. Cerevisiae. Daher konnten wir beobachten, die Wirkung durch die Ergänzung der verschiedenen Konzentrationen von NH4+ in fermentativen Stoffwechsel gefördert. Dt -Werte vorgeschlagen, dass 0,13, 0,66 und 1,99 % NH4+ Gunst fermentativen Stoffwechsel, und es kann in der Wachstumskurven geachtet werden, dass diese Konzentrationen der Kultur exponentielle Phase erweitert. Dennoch eine Änderung der Zahl der D-t -Wert bei 3,31 % mM NH4+, hat gezeigt, dass diese Konzentration einen Respiro fermentativen Stoffwechsel induziert. Dieser Phänotyp zeigte eine längere Verzögerung-Phase in den Wachstumskurven und langsamere Wachstumsrate in der exponentiellen Phase (Abbildung 5).
Im dritten Versuch, Zellen von zwei verschiedenen S. Cerevisiae -Stämmen (W303 und WLP530) wurden in verschiedenen Konzentrationen von Saccharose oder Galaktose zu testen, ob die Auswirkungen der Kohlenstoffquelle auf Dt -Werte wurden angebaut Belastung abhängig. Als fermentative Kontrolle wurden beider Stämme in 2 % Glukose, und Dt -Werte wurden berechnet, um eine Schwelle für die fermentative Wachstum gesetzt. Die fermentative Dt -Werte für verschiedene, die Stämme wurden mit ≤3.25 h für die Belastung von W303 und ≤6.84 h für die WLP530 belasten. Daher ist es wichtig, hervorzuheben, die Notwendigkeit für die Validierung des Dt Schwellenwerts für die verschiedenen Stämmen verwendet. Darüber hinaus als Saccharose als die Kohlenstoffquelle verwendet wurde, wurde ein fermentativer Phänotyp bei 2 % und 10 % in beiden Stämmen beobachtet. Jedoch wenn Galaktose verwendet wurde, zeigte die Belastung von W303 nicht fermentative Verhalten in keinem der Konzentrationen getestet, während die WLP530 Belastung einen fermentativen Phänotyp bei 2 % Galaktose zeigte. Interessanterweise nahm die Belastung von W303 alle Konzentrationen der beiden Kohlenstoffquellen getestet. Allerdings zeigte die WLP530 Belastung nicht Wachstum auf die niedrigste Konzentration von Kohlenstoff verwendet (0,01 %). Möglicherweise WLP530 in der Bierindustrie verwendet wird und die CO2-Konzentrationen, die es ausgesetzt ist, sind in der Regel viel höher (Abbildung 6).
Insgesamt belegen die Daten aus diesen drei Experimenten, dass Wachstumskurven und kinetische Parameter für die vorläufige Unterscheidung zwischen Atem- und fermentative Wachstum in S. Cerevisiaenützlich sind. Darüber hinaus ist es wichtig hervorzuheben, dass dies ist ein vielseitiges Werkzeug, das in verschiedene Aspekte der Energieforschung Stoffwechsel verwendet werden kann.
Abbildung 1: Wirkung von verschiedenen Glukosekonzentration auf S. Cerevisiae Wachstum Phänotyp. Wachstumskurven entstanden durch die Messung der optischen Dichte bei 600 nm alle 30 min. für 48 h. Als S. Cerevisiae Zellen gären, Kulturen zeigte eine kurze Verzögerung Phase und schnelle Wachstumsrate in der exponentiellen Phase. Respiro fermentative Phase konnte folgte ein Wachstum Verzögerungsphase (Atemwege Phase), wo das Ethanol durch Fermentation hergestellt wird metabolisiert über die Oxidative Phosphorylierung Weg, dann die stationäre Phase erreicht. Daten werden als der Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Wirkung von lungengängigen Kohlenstoffquellen S. Cerevisiae Wachstum Phänotyp. Wachstumskurven entstanden durch die Messung der optischen Dichte bei 600 nm alle 30 min. für 48 h. Zellen von S. Cerevisiae zeigten eine längere Verzögerung Phase und langsame Wachstumsrate in der exponentiellen Phase und in der Regel nicht zeigen eine Diauxic Verschiebung. Daten werden als der Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Wirkung von Kohlenstoffquelle und seine Konzentration auf S. Cerevisiae kinetische Parameter. (ein) Dt Werte von S. Cerevisiae BY4742 Wachstum unter verschiedenen Kohlenstoffquellen; (b) μ -Werte von S. Cerevisiae BY4742 Wachstum unter verschiedenen Konzentrationen der verschiedenen Kohlenstoffquellen. Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen wurden mit eine einfache ANOVA, gefolgt von einem Dunnett Test durchgeführt (*p < 0,01 vs. 2 % Glukose). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Wirkung von Resveratrol-Supplementation auf andere Zelle Energie Status. (ein) Wachstum Phänotyp und μ Werte mit 10 % Glukose; (b) Phänotyp und μ Wachstumswerte mit 1 % Glukose. Daten von Wachstumskurven sind als der Mittelwert ± Standardfehler und μ -Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen für μ -Werte wurden mit eine einfache ANOVA, gefolgt von einem Dunnett Test durchgeführt [*p < 0,01 Vs. Atmungskontrolle mit 2 % Glycerin (RC)]. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Wirkung von Ammoniumsulfat-Supplementation auf S. Cerevisiae Energiestoffwechsel. Wachstumskurven entstanden durch die Messung der optischen Dichte bei 600 nm alle 30 min. für 48 h Daten von Wachstumskurven sind als der Mittelwert ± Standardfehler, und μ -Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen für Dt -Werte wurden mit eine einfache ANOVA, gefolgt von einem Dunnett Test durchgeführt [* p < 0,01 Vs. Atmungskontrolle mit 2 % Glycerin (RC)]. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Wirkung der Galactose und Saccharose-Konzentration in der fermentativen Stoffwechsel der Saccharomyces Cerevisiae. (ein) Dt Werte für die W303 Lab Belastung und (b) Dt -Werte für die WLP530 Industrie Belastung. Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen für Dt -Werte wurden mit eine einfache ANOVA, gefolgt von einem Dunnett Test durchgeführt [* p < 0,01 vs. 2 % Glukose (fermentative Kontrolle)]. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Eine lange Zeit ist vergangen, seit J. Monod10 zum Ausdruck gebracht, dass die Untersuchung des Wachstums von Bakterienkulturen die grundlegende Methode der Mikrobiologie. Das Aufkommen der Molekulare Werkzeuge verzögert die Nutzung und das Studium des Wachstums als eine Technik. Trotz der Komplexität des Wachstums die zahlreichen miteinander verbundenen Prozesse umfasst, können die zugrunde liegenden Mechanismen mithilfe mathematischer Modelle11beschrieben werden. Dies ist eine robuste Ansatz, der als ergänzendes Instrument genutzt werden kann, die meisten komplizierten molekularen Mechanismen12aufzuklären.
Um zuverlässige Ergebnisse von dieser Methode zu erhalten, ist es wichtig, die folgenden kritischen Schritte zu berücksichtigen. Unruhe bei 250 u/min ist entscheidend für ein gutes Wachstum in CO2-armen Quellen, die Atemwege Wachstum ausüben, da bei niedrigeren Erregung Geschwindigkeiten (150 – 180 u/min) Wir beobachteten Zunahme der Atemwegserkrankungen reduziert. Es ist wichtig, das Protokoll mit frischer Vorrat zu initiieren, und es ist auch wesentlich, einen einheitlichen Phänotyp in die Assays beizubehalten. Wachstum Kinetik Schwellenwerte variieren zwischen den Stämmen und validiert werden müssen, nach den Zustand in den Tests verwendet werden. GraphPad Prism Software wird vorgeschlagen, weil die exponentielle Gleichung bereits vorinstalliert ist; keine andere Software ist jedoch geeignet, vorausgesetzt, es ermöglicht die Programmierung der exponentiellen Wachstums-Gleichung. In der Mikrotestplatte, es wird empfohlen, drei Brunnen mit 150 μL Wachstum Medien ohne Inokulum – Dies ist ein Steuerelement, das angibt, ob die Mikrotestplatte Brunnen Verseuchung gelitten haben.
Es ist wichtig, um anzugeben, dass zeichnen die OD-Daten auf einer linearen Skala schwer zu bestimmen, die logarithmischen Wachstumsphase kann es machen. Dieses Problem kann überwunden werden durch Auftragen der OD-Daten in eine logarithmische Skalierung, so dass Lag-Phase und logarithmischen Wachstumsphase deutlich sichtbar sind.
Dieses Protokoll dient nur einen Phänotyp, Bildschirm, so dass die spezifischen Auswirkungen auf die Gärung und die mitochondriale Atmung bestätigt werden müssen. Wir empfehlen die Quantifizierung der mitochondrialen Atmung Sauerstoff Verbrauch Assays13,14, während der Gärung durch die Anhäufung von Nebenprodukten wie Acetat, Succinat, Glycerin und Ethanol9 bestimmt werden kann .
S. Cerevisiae Wachstum hat diente als Mittel zum Verständnis der molekularer Mechanismen und Phänotypen, mit Methoden aus Screening Tests assays. Dennoch verwenden zahlreiche experimentelle Designs in der Literatur Hefe Wachstum nur als qualitative Parameter (z. B. Platte Verdünnungen oder Wachstumskurven), so dass der Einsatz dieser Techniken wertvolle Anhaltspunkte vernachlässigt. Zum Beispiel beschränkt sich der Sauerstoff in Agarplatten verwendet für mikrobielle Bevölkerung Zählung oder serielle Verdünnungen, Wachstum Messung unter Atemwegserkrankungen zu verkomplizieren. Außerdem, wenn zwei oder mehr Zellen miteinander verbunden bleiben, wird nur eine Kolonie beobachtet. Eine weitere Einschränkung ist die Verwendung von Wachstumskurven als ein sichtbares Ergebnis, Unterschiede im Wachstum, markieren Sie die Fakten über feine Unterschiede beiseite lassen können. Daher ermöglicht die Übersetzung von Wachstum Informationen zu quantitativen Parametern die Erreichung der genaue Daten über die ausgeübte Phänotyp. Dennoch ist die mathematische Darstellung des Wachstums ein kompliziertes wissenschaftliches Unternehmen. Die meisten Studien untersuchen vollem Wachstum (Verzögerung, Protokoll- und stationäre Phasen) der Mikroorganismen, höchstwertige polynomiale Gleichungen, die nur dazu, einen ökologischen Zustand dienen erhalten. Trotz der relativen Einfachheit bei der Berechnung der Koeffizienten dieser Gleichungen durch lineare Regression ist es schwierig eine inhärente biologische Bedeutung15zuzuordnen. Die Analyse des Wachstums durch die Trennung von Wachstumsphasen ist mathematisch zuverlässig und unkompliziert. Ein Beispiel hierfür ist die exponentielle Wachstum-Gleichung, die basiert auf Kinetik erster Ordnung und passt gut zu einer kurzen Verzögerung und exponentielle Phase.
Zu guter Letzt ist das Studium der Log-Phase unter Verwendung der Gleichung exponentielles Wachstum eine einheitliche Methode, den Einfluss der mitochondrialen Atmung oder Gärung auf einer bestimmten Verbindung oder Umwelt zu verstehen. Als ein Proof of Concept nachweislich Quantifizierung des Wachstums in der exponentiellen Phase RSV speziell Atemwege Wachstum13,14betrifft. Hier serviert Wachstum als ein wertvolles Instrument um zu identifizieren, dass RIM15 Löschung wahrscheinlich durch partielle Hemmung der Atmung Kapazität in S. Cerevisiae9fermentativen Stoffwechsel verbessert. Diese Daten bestätigen, dass Wachstum beobachten die Untersuchung der fermentativen und respiratorischen Stoffwechsel ermöglicht und eine einfache und zuverlässige Methode ist. Daher können auf diese Weise für das screening der Auswirkungen eines bestimmten Stoffes auf die mitochondriale Atmung oder Gärung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde unterstützt durch Zuschüsse des Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Grant-Nummer 293940) und Fundación TELMEX-TELCEL (Grant-Nummer 162005585), beide IKOM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
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