Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את חילוף החומרים בדרכי הנשימה, fermentative על-ידי התאמת הגידול האקספוננציאלי של האפייה למשוואה צמיחה אקספוננציאלית. חישוב הפרמטרים קינטי מאפשר להקרנה של השפעות של חומרים/תרכובות תסיסה או מיטוכונדריאלי נשימה.
Abstract
שמר האפייה תאים בשלב מעריכי לקיים את הצמיחה שלהם על-ידי הפקת ATP באמצעות תסיסה ו/או מיטוכונדריאלי נשימה. ריכוז פחמן בהתססה של מושל בעיקר איך תאי השמרים מייצרים ATP; לפיכך, הוריאציה ברמות פחמימות בהתססה של כוננים חילוף החומרים האנרגטי של cerevisiae ס. מאמר זה מתאר שיטה תפוקה גבוהה המבוססת על צמיחת שמרים מעריכי כדי להעריך את ההשפעות של שינויי ריכוז והטבע של מקור פחמן על חילוף החומרים הנשימה ואת fermentative. הצמיחה של cerevisiae נמדד microplate או מנוער חרוט הבקבוק על-ידי קביעת הצפיפות האופטית (OD)-600 ננומטר. לאחר מכן, עקומת גדילה זה נבנה על ידי OD ההתוויה נגד הזמן, אשר מאפשרת זיהוי ובחירה של שלב מעריכית, והוא מצויד עם המשוואה הגידול האקספוננציאלי לקבל פרמטרים קינטי. שיעורי צמיחה ספציפיים נמוך עם גבוה יותר פעמים ההכפלה בדרך כלל מייצגים גידול בדרכי הנשימה. לעומת זאת, שיעור צמיחה ספציפיים גבוה עם התחתון פעמים ההכפלה מצביעים על צמיחה fermentative. ערכי הסף של הכפלת זמן ושיעור צמיחה ספציפיים מוערך באמצעות מחלות בדרכי הנשימה או fermentative ידועים, כמו פחמן בהתססה של מקורות או ריכוז גבוה של סוכרים בהתססה. זה מתקבל עבור כל זן ספציפי. לבסוף, הפרמטרים קינטי מחושב מושווים עם ערכי סף כדי לקבוע אם השמרים מציגה צמיחה fermentative ו/או בדרכי הנשימה. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות היחסית להבנת השפעת תרכובת/חומר על חילוף החומרים fermentative או בדרכי הנשימה. חשוב להדגיש כי הצמיחה היא תהליך ביולוגי מסובכים ומורכבים; לכן, המידע הראשוני של שיטה זו חייבת להיות שחלקית כימות של צריכת החמצן והצטברות תוצרי לוואי תסיסה. ובכך, טכניקה זו יכולה לשמש הקרנה ראשוני של תרכובות/חומרים אשר עשויים להפריע או לשפר את חילוף החומרים fermentative או בדרכי הנשימה.
Introduction
שמר האפייה צמיחה שימש כלי חשוב כדי לזהות עשרות מנגנונים פיזיולוגיים ומולקולרית. צמיחה נמדד בעיקר על ידי שלוש שיטות: טורי דילולים בדיקות ספוט, המושבה יוצרי יחידת ספירה של עקומות גדילה. שיטות אלה ניתן להשתמש לבד או בשילוב עם מגוון רחב של סובסטרטים, תנאים סביבתיים, מוטציות, כימיקלים לחקור תגובות ספציפיות או פנוטיפים.
נשימה מיטוכונדריאלי היא תהליך ביולוגי שבו קינטיקה גידול יושם בהצלחה על גילוי מנגנוני לא ידוע. במקרה זה, תוספת של צמיחה מדיה עם פחמן בהתססה של מקורות כגון גליצרול, לקטאט או אתנול (אשר הם מטבוליזם באופן בלעדי על ידי נשימה מיטוכונדריאלי), כמו המקור פחמן ואנרגיה הבלעדי מאפשר להעריך הצמיחה בדרכי הנשימה, וזה חשוב. לזהות לפליטת זרחון חמצוני פעילות1. מצד שני, זה מסובך להשתמש גידול קינטית מודלים כשיטה עבור פיענוח המנגנון מאחורי תסיסה.
המחקר של תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי חיונית כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים מאחורי פנוטיפים מסוימים כגון קרבטרי, ורבורג אפקטים2,3. האפקט קרבטרי מאופיין על ידי גידול של שטף glycolytic, דיכוי של הנשימה מיטוכונדריאלי, ואת הקמתה של תסיסה כנתיב העיקרי ליצירת ATP בנוכחות ריכוזים גבוהים של בהתססה של פחמימות (> 4,0.8 מ מ)5. ורבורג הוא אנלוגי סמויה על אפקט קרבטרי, כאשר ההבדל בכך בתרבית של תאים, המוצר העיקרי של תסיסה הוא לקטט6. אכן, ורבורג מוצגת על ידי מגוון של תאים סרטניים, מפעילה ספיגת הגלוקוז וצריכת אפילו בנוכחות חמצן7. ובכך, ללמוד את הבסיס המולקולרי של המתג של נשימה כדי תסיסה האפקט קרבטרי יש גם השלכות ביוטכנולוגי (לייצור אתנול) וגם השפעות אפשריות בחקר הסרטן.
Cerevisiae ס הצמיחה עשויה להיות כלי מתאים כדי לחקור את ההשפעות קרבטרי, ורבורג. הרעיון זה מבוסס על העובדה כי בשלב מעריכי שמרים, משעולים המרכזי שימוש להפקת ATP הם נשימה מיטוכונדריאלי, תסיסה, המהווה מרכיב חיוני כדי לקיים את הצמיחה. למשל, הצמיחה של cerevisiae בצורה אינטימית קשורה הפונקציה של מסלולים ליצירת ATP. במולקולות cerevisiae ס, מ- ATP מייצרת כ 18 מיטוכונדריאלי נשימה לכל מולקולת גלוקוז, ואילו תסיסה יחולל רק 2 מולקולות ATP, ומכאן הוא צפוי כי קצב הגידול יש קישורים הדוקים עם משעולים חילוף החומרים הפקת ATP8. בהקשר זה, כאשר המסלול העיקרי ליצירת ATP תסיסה, השמרים מפצה על ייצור ATP נמוכה על-ידי הגברת קצב ספיגת הגלוקוז. להפך, צריכת הסוכר על ידי תאי שמרים להשתמש נשימה מיטוכונדריאלי כמקור ATP העיקרי הוא נמוך. אפשרות זו מציינת כי חשוב עבור השמרים ל הגיוני פחמימות זמינות לפני קביעת איך ייווצר ATP. לכן, זמינות גלוקוז ממלא תפקיד חשוב ב הבורר בין תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי ב cerevisiae ס. בנוכחות כמויות גבוהות של גלוקוז, מעדיף השמרים תסיסה כמו הנתיב המרכזי ליצירת ATP. מעניין, השמרים הוא החימוץ, קצב הגידול הספציפי נשמר מקסימום שלה. מצד שני, תחת רמות נמוכות של גלוקוז, cerevisiae ס מייצרת ATP באמצעות נשימה מיטוכונדריאלי, שמירה על שיעורי הצמיחה נמוכה. ובכך, וריאציה בריכוז של גלוקוז ושימוש של מקורות פחמן אחרים לגרום שינויים בהעדפות של השמרים בין צמיחה fermentative, מערכת הנשימה. מאת לוקח בחשבון את העובדה הזו עם המשוואה גידול אקספוננציאלי, הוא יכול להשיג את המשמעות הביולוגית של קינטי פרמטרים כגון הכפלת זמן (Dt) ושיעור צמיחה ספציפיים (ממוצע). לדוגמה, ערכים נמוכים יותר ממוצע נמצאו כאשר השמרים משתמש נשימה מיטוכונדריאלי כנתיב העיקרי. להפך, בתנאים טובה תסיסה, נמצאו ערכים ממוצע גבוהים יותר. מתודולוגיה זו עשוי לשמש כדי למדוד את המנגנונים סביר של כל כימיקלים המשפיעים על תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי ב cerevisiae ס.
מטרת מאמר זה היא להציע שיטה המבוססת על צמיחה קינטיקה לסינון את ההשפעות של תרכובת/חומר נתון על נשימה מיטוכונדריאלי או תסיסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות המדיה והכנות Inoculum
- להכין 100 מ של 2% תמצית-peptone-dextrose (YPD) שמרים בינוני נוזלי (להוסיף תמצית 1 גר' שמרים, 2 גר' קזאין peptone, ו- 2 גר' גלוקוז ל 100 מ של מים מזוקקים). לוותר על 3 מ"ל של המדיה לתוך צינורות חרוט sterilizable 15 mL. אוטוקלב התקשורת למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ו 1.5 psi.
הערה: המדיה ניתן לאחסן עד לחודש ב 4 – 8 ° c - לחסן צינור חרוטי מלא עם 3 מ ל מרק YPD 2% סטרילי מגניב עם μL 250 תאים cerevisiae ס המשומרים גליצרול ב-20 ° C. דגירה בין לילה שייקר מסלולית ב 30 ° C עם עצבנות-200 סל ד.
- פס צלחת פטרי (60 x 15 מ מ2) מלא עם אגר YPD 2% סטרילי (להוסיף 10 גרם של שמרים לחלץ, 20 גר' קזאין peptone, 20 גר' גלוקוז, ו- 20 גרם של אגר בקטריולוגית 1,000 מ של מים מזוקקים) עם תאי גדל בצינור חרוט באמצעות לולאה סטרילי. דגירה הפטרי ב 30 ° C עד מושבות המבודד מראים צמיחה.
- להכין את inoculum מראש על-ידי מזריקים מושבה מבודד יחיד לתוך צינור חרוטי מלא עם 10 מ ל מרק YPD 2% סטרילי מגניב, דגירה אותו בן לילה ב 30 ° C עם עצבנות רציפה ב 200 סל ד.
2. תרבות ומדיה עקומות גדילה ב- Microplate
- הכינו 10 מ ל מרק YPD 1% (להוסיף תמצית 0.1 גר' שמרים, 0.2 גר' peptone, ו- 0.1 גר' גלוקוז 10 מ של מים מזוקקים), 10 מ ל מרק YPD 2% (להוסיף תמצית 0.1 גר' שמרים, 0.2 גר' peptone, ו- 0.2 גר' גלוקוז 10 מ של מים מזוקקים) , ו- 10 מ ל 10% YPD מרק (להוסיף תמצית 0.1 גר' שמרים, 0.2 גר' peptone, ו 1 גר' גלוקוז 10 מ של מים מזוקקים). אוטוקלב אלה מדיומים צמיחה למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ו 1.5 psi.
הערה: המדיה תרבות משמש פקד של צמיחה fermentative. - להכין 10 מ ל 2% שמרים תמצית-peptone-אתנול (לסוג) מרק 10 מ ל 2% שמרים תמצית-peptone-גליצרול (YPG) מרק. 2% לסוג: להוסיף 0.1 גר' שמרים לחלץ, 0.2 גר' peptone, ו- 0.2 מ"ל אתנול ל 10 מ ל מים מזוקקים. 2% YPG: להוסיף תמצית 0.1 גר' שמרים, 0.2 גר' peptone, ו- 0.2 מ"ל של גליצרול 10 מ של מים מזוקקים. אוטוקלב אלה מדיומים צמיחה למשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס ו 1.5 psi.
הערה: גליצרול ואתנול הם מקורות פחמן בהתססה של זה הן מטבוליזם באופן בלעדי על ידי נשימה מיטוכונדריאלי. מסיבה זו, הם משמשים כפקדי גידול בדרכי הנשימה. בשלב זה, ניתן לשנות את סוג ואת ריכוז פחמן מקור של תרבות המדיה כדי לבחון את ההשפעה על פנוטיפ צמיחה באמצעות שמרים תמצית-peptone (YP) מרק (10 גרם של תמצית שמרים וכ 20 גר' קזאין peptone ב 1,000 מ ל מים מזוקקים) כבסיס. כדי לבדוק את ההשפעות של מזינים אחרים מלבד פחמן, סינתטי מלא בינוני (SC) הוא בתוספת לפי מטרת הניסוי. הבסיס SC בינוני הוא 1.8 גרם שמרים חנקן הבסיס ללא חומצות אמינו, 5 g של אמוניום סולפט [(NH4)2אז4], 1.4 גרם מונוסודיום פוספט (NaH2PO4), 2 גר' הנשירה לערבב 1,000 מ ל מים מזוקקים. תוספת התקשורת עם מקור פחמן, חנקן נוספים מקור בבית הריכוזים הדרוש. - להוסיף μL 145 מתאימים תרבות התקשורת על עיצוב ניסיוני כל טוב של microplate סטרילי (10 x 10-טוב) עם מכסה, לחסן אותם עם μL 5 של inoculum מראש.
הערה: אם המטרה היא למסך את השפעת חומרים/תרכובות על חילוף החומרים האנרגטי של השמרים, החומר/המתחם צריך להוסיף במהלך שלב זה. בנוסף, כל סוג של microplate עם מכסה צריך להיות שימושי. - דגירה את הצלחת רב טוב בקורא microplate ב 30 ° C עם עצבנות מתמדת על סל ד 200 עבור 48 ה מדד הצפיפות האופטית (OD)-600 nm כל 30 או 60 דקות.
הערה: אם הקורא microplate אין אפשרות דגירה של microplate, זה עשוי להיות מודגרות ב שייקר מסלולית-באותם התנאים בין כל מדידה של OD.
3. עקומות גדילה מזועזעת מבחנות חרוט
- להוסיף 4.8 מ של התקשורת תרבות מתאימים מבחנות חרוט 20 מ"ל של החיטוי. לחסן כל הבקבוק עם 200 μL של התרבות inoculum טרום-OD600nm ~ 2 במרק YPD 2% מגניב, סטרילי. דגירה אותם ב 30 ° C עם עצבנות מתמדת-250 סל"ד במשך 24 שעות ביממה.
הערה: אם תקופת הדגירה הוא גבוה יותר מאשר 24 שעות ביממה, להוסיף 12 מ של התקשורת תרבות מתאימים מבחנות חרוט 50 מ ל, תא לחץ. לחסן אותם עם 500 μL של inoculum מראש. חשוב גם לקחת בחשבון פקדי צמיחה fermentative (מדיה YP עם 1%, 2% או 10% גלוקוז) ופקדי צמיחה הנשימה (YP מדיה עם 2% גליצרול או אתנול). - קח 100 μL של התרבות הבקבוק חרוט מזועזעת למהול אותו ב- 900 μL של מים מזוקקים ב cuvette ספקטרופוטומטרים 1 מ"ל ו לערבב בעדינות על ידי pipetting. למדוד את יתר על 600 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים כל שעתיים. כדי לקבל את יתר אמיתית, הכפל את התוצאה ב-10.
4. עיבוד נתונים וחישוב פרמטרים קינטי
-
צור קובץ פרוייקט חדש בתוכנה סטטיסטית החבילה. בסעיף של "טבלה חדשה, גרף", בחר באפשרות "XY" .
- בחר באפשרות: "התחל עם טבלת נתונים ריק" במדור "נתונים לדוגמה" .
- בחר את סוג הגרף "נקודות, קו מחבר" . להשאיר את הסעיף "X" נבחר בקטע של "Subcolumns משכפל או ערכי שגיאה" ובחרו ב- "Y" סעיף האפשרות: "הזן ערכים שכפל (10) לצד subcolumns, עלילה Mean ו SD שגיאה". לחץ על לחצן צור.
הערה: עיצוב הטבלה יש עמודה אחת X ו Y מספר עמודות, ולכל אחד יש subcolumns 10 שבחרת בעבר.
- כתיבה הזמן-OD אשר נלקחו מידות בעמודה X (למשל, 0, 30, 60, 90 דקות או 0, 1, 1.5, 2 h). בעמודות Y, לכתוב את הערכים OD המתקבל התרבויות.
- לזהות את שלב הגידול המעריכי להפוך הנתונים של עמודת Y לוגריתמים. לחץ על לחצן 'נתח' , בחר את הניתוח "להמיר" , בחר ערכי Y באמצעות Y = Log(Y). ללכת "גלריה של תוצאות", בחר "להמיר" טבלת נתונים, לחץ על לחצן 'נתח' , ובחרו את הניתוח "רגרסיה לינארית" . לא לכלול את הערכים OD אחרי התנהגות ליניארי. כדי לא לכלול ערכים, בחר אותם בטבלה נתונים והקלד "Ctrl + E.
הערה: חשוב לא לכלול את הערכים אחרי השלב מעריכי מאז המשוואה הגידול האקספוננציאלי משתלב היטב שלב מעריכית. - 'גלריית טבלאות נתונים', בחר את טבלת הנתונים "נתונים 1". לחץ על לחצן 'נתח' ובחרו את ניתוח "רגרסיה לא ליניארית (עקומת התאמה)" בין הניתוחים"XY".
- בחר ערכות הנתונים כדי לנתח, ולחץ על הלחצן "אישור" . בכרטיסיה "מתאים" בחר בסעיף "משוואה מעריכית" ובחר "צמיחה אקספוננציאלית משוואה" (, כאשר X הוא ריכוז תא, X0 הוא התא ריכוז בזמן אפס, μ הוא שיעור צמיחה ספציפיים ו- t הוא הזמן). להשתמש את "שיטת הריבועים הפחותים מתאים" כשיטה התאמה ולהשאיר שלא נבחרו בסעיף interpolate. לחץ על הלחצן "אישור" .
הערה: הכרטיסיה עם התוצאות בכושר לא לינארית היא "גלריה של תוצאות". התוכנה מחשבת ההכפלה (Dt) וזמן ספציפי שיעור הצמיחה (μ). התוכנה מציגה μ כמו K בכרטיסיה ' תוצאות '. - פתח קובץ פרוייקט חדש, ובחר במקטע "טבלה חדשה, גרף" , הבחירה עמודה. בחר את האפשרות "התחל עם טבלת נתונים ריק" , בחר את התרשים הרצוי. לבחור מגרש הממוצע עם SD. בחר לחצן "צור" .
- העתק את μ או ערכים Dt מהכרטיסיה תוצאות בכושר לא לינארית כי הוא "גלריה של תוצאות" ולהדביק אותם בעמודה. לבסוף, בחר בלחצן ' 'נתח' ' ובחרו ' הניתוח הרצוי בסעיף "טור ניתוחים" כדי להשוות את הפרמטרים קינטי של התנאים nutrimental שונים.
הערה: הפרמטרים קינטי המתקבל הפקדים צמיחה fermentative (מדיה YP עם 1%, 2% או 10% גלוקוז) ומסייע צמיחה הנשימה פקדים (YP מדיה עם 2% גליצרול או אתנול) להקים את הסף של fermentative ו מיטוכונדריאלי הנשימה בהתאמה. השוואת קינטי את הפרמטרים מצב תזונתי, חומר/מתחם לבדיקה עם הגידול בדרכי הנשימה, fermentative לסייע בזיהוי להשפעה אפשרית על חילוף החומרים בדרכי הנשימה או fermentative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עקומות גדילה יכול לשמש preliminarily להפלות בין פנוטיפים הנשימה ו fermentative ב ס cerevisiae השמרים. לכן, ביצענו תרבויות אצווה של cerevisiae ס (BY4742) עם ריכוזי גלוקוז שונים דווח כי כדי לגרום לצמיחה fermentative: 1%, 2% ו- 10% (w/v)9. תרבויות מציג הפנוטיפ fermentative שלב פיגור קטן ויש שלב מעריכית עם שיעור צמיחה גבוה (איור 1). אתנול, גליצרול ו לקטט הן מקורות פחמן יכול להיות מטבוליזם רק דרך נשימה; לפיכך, אנו לבצע תרביות של השמרים באמצעות אותם מקורות פחמן. תרבויות להשיג אנרגיה בעיקר על ידי זרחון חמצוני הראה עוד שלב ההשהיה וקצב איטי של צמיחה במהלך שלב מעריכית (איור 2).
ניתוח של עקומות גדילה מספקת מידע איכותי בלבד; לפיכך, חשוב לחשב את הפרמטרים קינטי להשיג מידע כמותי. נוכל לחשב את Dt ואת μ באמצעות המשוואה הגידול המעריכי (איור 3). קבענו סף עבור ערכים צמיחה הנשימה ב Dt ≥11.5 μ ו h ≤0.059 קמ. הסף לצמיחה fermentative הוגדר ב Dt ≤6.5 μ ו h ≥0.149 / h (איור 3).
כדי להוכיח את התועלת של כלי סינון זה עיצבנו 3 ניסויים, עם הראשון להערכת השפעת ריכוזים שונים רזברטרול (RSV) על תאים BY4742 cerevisiae ס עם מצב אנרגטי שונה (איור 4) ב מבחנות מזועזעת. הניסוי השני שמטרתו לזהות את השפעת ריכוזים שונים אמוניום סולפט (NH4+) על חילוף החומרים האנרגיה של cerevisiae ס BY4742 (איור 5) ב microplate. לבסוף, השלישי שמטרתם להמחיש כמה שינויים במקור פחמן משפיעים על הצמיחה fermentative לשניים שונים זנים cerevisiae ס (W303 ותעשייתיות WLP530 שימשו התסיסה הבירה) (איור 6). בניסוי באמצעות RSV, המצב האנרגטי תא שונתה על ידי משתנה ריכוז הגלוקוז. גלוקוז 10%, ריכוז RSV כל נבדק לא שינתה את השלב respiro-fermentative של השמרים אך להקטין את שלב הנשימה (במהלך משמרת diauxic, cerevisiae ס מטבוליזם של אתנול שהופק במהלך שלב מעריכי על ידי זרחון חמצוני). ערכי μ אישר כי בתנאים כל נבדק, cerevisiae ס הראו התנהגות fermentative, בניגוד שלה פנוטיפ כאשר גדל ב- 2% גליצרול (תנאי שימוש בפקד הנשימה) (איור 4a). כאשר התאים היו אנרגיה עם גלוקוז 1% בלבד, ערכי μ אישר כי ב 0.1 1, 10, 100 מיקרומטר RSV, התנהגות fermentative בשלב respiro-fermentative לא הושפע. עם זאת, נצפתה ירידה בשלב הנשימה במהלך משמרת diauxic. יתר על כן, על ריכוז של 1,000 מיקרומטר, RSV עכבות לחלוטין צמיחת תאים.
בניסוי השני, היו תאים בתוספת 10% גלוקוז, ריכוז נחשב מספיק כדי לגרום את אפקט קרבטרי cerevisiae ס. לפיכך, אנחנו יכולים לצפות באפקט קידמו את תוספת של ריכוזים שונים של NH4+ fermentative חילוף החומרים. ערכי Dt הציע את 0.13 0.66, 1.99% NH4+ טובה fermentative חילוף החומרים, זה יכול להיות שנצפו בעקומות גדילה ריכוזים אלה מורחב שלב מעריכית של התרבות. בכל זאת, מ"מ 3.31% NH4+, תוספת קבועה בערך Dt הראו כי ריכוז זה המניע של חילוף החומרים respiro-fermentative. פנוטיפ זה הראה שלב השהיה ממושכת עקומות גדילה, קצב צמיחה איטי בשלב מעריכית (איור 5).
בניסוי השלישי, תאים של שניים שונים זנים cerevisiae ס (W303 ו- WLP530) גדלו בריכוזים שונים של סוכרוז או גלקטוז כדי לבדוק אם ההשפעות של מקור פחמן על הערכים Dt תלויי-מתח. כפקד fermentative, שני זנים גדלו ב- 2% גלוקוז, חושבו הערכים Dt כדי לקבוע סף לצמיחה fermentative. Fermentative Dt ערכים עבור הזנים היו שונים, עם ≤3.25 h עבור זן W303 ו≤6.84 h עבור WLP530 המתח. לכן, חשוב להדגיש את הצורך אימות הסף Dt עבור זנים שונים בשימוש. יתר על כן, כאשר סוכרוז שימש כמקור פחמן, הפנוטיפ fermentative נצפתה על 2%-10% לשני הזנים. עם זאת, כאשר שימש גלקטוז, המתח W303 לא הופיע התנהגות fermentative בכל אחד הריכוזים נבדק, בעוד המתח WLP530 הראה הפנוטיפ fermentative ב 2% גלקטוז מעניין, המתח W303 גדלו כל הריכוזים של שני מקורות פחמן נבדק. למרות המתח WLP530 לא הראה צמיחה-הריכוז הנמוך ביותר של פחמן בשימוש (0.01%). זה עשוי להיות מכיוון WLP530 משמש בתעשיית הבירה ריכוזי הפחמן שאליו הוא נחשף הם בדרך כלל הרבה יותר גבוה (איור 6).
בסך הכל, הנתונים מכל אלה 3 ניסויים להוכיח כי עקומות גדילה ופרמטרים קינטי שימושיים האפליה ראשונית בדרכי הנשימה של fermentative צמיחה ב cerevisiae ס. כמו כן, חשוב להדגיש שזהו כלי רב-תכליתי עשוי לשמש בהיבטים שונים של מחקר חילוף החומרים אנרגיה.
איור 1: השפעת ריכוז גלוקוז שונים על פנוטיפ צמיחה cerevisiae ס . עקומות גדילה נבנו על ידי מדידת צפיפות אופטית על 600 nm כל 30 דקות במשך 48 שעות. כאשר תאים cerevisiae ס תסיסה, תרבויות הראה שלב השהיה קצרה בעלת קצב צמיחה מהיר במהלך שלב מעריכית. השלב respiro-fermentative יכול להיות בעקבות צמיחה ההאטה שלב (שלב הנשימה), שבו האתנול המיוצר על ידי התססה עובר מטבוליזם באמצעות מסלול זרחון חמצוני, ואז הגיע השלב נייח. הנתונים מוצגים כמו השגיאה הסטנדרטית זאת אומרת ±. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השפעת מקורות פחמן respirable על פנוטיפ צמיחה cerevisiae ס . עקומות גדילה נבנו על ידי מדידת צפיפות אופטית על 600 ננומטר בכל 30 דקות עבור ה 48 תאים של cerevisiae ס הראה השהיה ממושכת שלב בעלת קצב צמיחה איטי במהלך שלב מעריכית, בדרך כלל לא הראתה שינוי diauxic. הנתונים מוצגים כמו השגיאה הסטנדרטית זאת אומרת ±. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: השפעת המקור פחמן, הריכוז שלו על פרמטרים קינטי cerevisiae ס . () Dt ערכים של cerevisiae ס BY4742 צמיחה תחת מקורות פחמן שונות; (b) ערכי μ צמיחת BY4742 cerevisiae ס תחת ריכוזים שונים של מקורות פחמן מגוונות. הנתונים מוצגים כמו הממוצע ± סטיית התקן. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו המבחן של Dunnett (*p < 0.01 לעומת 2% גלוקוז). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: השפעת תוספי resveratrol על מצבי אנרגיה שונים תא. () צמיחה פנוטיפ וערכי μ באמצעות גלוקוז 10%; (b) צמיחה פנוטיפ μ וערכי בגלוקוזה 1%. נתונים עקומות גדילה מוצגים כמו השגיאה הסטנדרטית זאת אומרת ±, ערכי μ מוצגים כמו הממוצע ± סטיית התקן. ניתוחים סטטיסטיים עבור ערכי μ בוצעו באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו המבחן של Dunnett [*p < 0.01 vs. בקרת הנשימה עם 2% גליצרול (RC)]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: השפעת תוספי אמוניום סולפט על חילוף החומרים של אנרגיה cerevisiae ס . עקומות גדילה נבנו על ידי מדידת צפיפות אופטית על 600 nm כל 30 דקות במשך 48 ה נתונים עקומות גדילה מוצגים כמו השגיאה הסטנדרטית זאת אומרת ±, ואת ערכי μ מוצגים כמו הממוצע ± סטיית התקן. ניתוחים סטטיסטיים עבור ערכים Dt בוצעו באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו המבחן של Dunnett [* p < 0.01 vs. בקרת הנשימה עם 2% גליצרול (RC)]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: השפעת ריכוז גלקטוז וסוכרוז בחילוף החומרים fermentative של האפייה. () Dt ערכים עבור W303 זן ו- (b) Dt בערכי lab לזן תעשייתי של WLP530. הנתונים מוצגים כמו הממוצע ± סטיית התקן. ניתוחים סטטיסטיים עבור ערכים Dt בוצעו באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו המבחן של Dunnett [* p < 0.01 לעומת 2% גלוקוז (פקד fermentative)]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זמן רב עבר מאז ומונו ג'10 הביעו כי המחקר של הצמיחה של חיידקים תרבויות היא השיטה הבסיסית של מיקרוביולוגיה. כניסתו של הכלים מולקולרית מעכב את השימוש והלימוד של הגידול כמו טכניקה. למרות המורכבות של צמיחה אשר מערבת תהליכים לתקצב רבים, מנגנוני הבסיסית שלה יכולה להיות מתוארת באמצעות מודלים מתמטיים11. זה בגישה חזקים יכול לשמש ככלי משלים התירי את המנגנונים המולקולריים הסבוך ביותר12.
כדי להשיג תוצאות אמינות של שיטה זו, חשוב לקחת בחשבון את השלבים הקריטיים הבאים. עצבנות-250 סל"ד חיוני להשגת צמיחה טובה מקורות פחמן נמוכה להפעיל גידול בדרכי הנשימה, שכן בעת שימוש נמוך עצבנות מהירויות (150-180 סל ד) הבחנו מופחתת צמיחת מערכת הנשימה תנאים. חשוב ליזום את פרוטוקול העסקת מניה טריים, וזה גם חיוני כדי לשמור על הפנוטיפ אחיד ב מבחני. ערכי הסף קינטיקה גידול משתנים בין זנים, יש לאמת לפי מצב כדי לשמש את מבחני. התוכנה GraphPad מנסרה מוצע כי המשוואה הגידול האקספוננציאלי כבר מראש; עם זאת, כל תוכנה אחרת מתאימה, בתנאי זה מאפשר תכנות של המשוואה צמיחה אקספוננציאלית. ב microplate, מומלץ לכלול משלוש בארות עם 150 μL של צמיחה מדיה ללא inoculum — זה פקד המציין אם הבארות microplate סבלו זיהום.
חשוב לציין כי התוויית הנתונים OD בקנה מידה ליניארי יכול לעשות את זה קשה לקבוע את שלב הצמיחה לוגריתמי. בעיה זו ניתן להתגבר על ידי התוויית הנתונים יתר מידה יומן כך לג שלב ושלב הצמיחה לוגריתמי הם נראים בבירור.
פרוטוקול זה משמש רק למסך פנוטיפ, אז השפעות ספציפיות על תסיסה ונשימה מיטוכונדריאלי וחייבות להיות מאושרות. אנו ממליצים כימות של נשימה מיטוכונדריאלי על ידי חמצן צריכת מבחני13,14, בזמן התסיסה יכול להיקבע על ידי ההצטברות של תוצרי לוואי כגון אצטט, succinate, גליצרול, אתנול9 .
צמיחה cerevisiae ס שימש כאמצעי להבנת המנגנונים המולקולריים של הפנוטיפים, עם שיטות ההקרנה בדיקות מבחני. למרות זאת, עיצובים מוטוריים רבים בספרות להשתמש צמיחת שמרים רק כפרמטר איכותי (למשל, צלחת דילולים או עקומות גדילה), אז התעסוקה של טכניקות אלה מזניח ראיה יקרי ערך. לדוגמה, החמצן הזמינים בפלטות אגר המשמש עבור ספירת אוכלוסיית חיידקים או ביצוע דילולים סדרתי הוא מוגבל, שמסבך צמיחה מדידה בתנאים בדרכי הנשימה. חוץ מזה, כאשר שני תאים או יותר יישארו מחוברים אחד לשני, הוא ציין מושבה אחת בלבד. מגבלה נוספת היא השימוש של עקומות גדילה כתוצאה מכך חזותי כדי להדגיש הבדלים צמיחה, אשר עלולה להשאיר בצד עובדות על ההבדלים הדקים. לכן, התרגום של צמיחה מידע פרמטרים כמותיים מתיר את ההישג של נתונים מדויקים על פנוטיפ מחמת. למרות זאת, ייצוג מתמטי של צמיחה הוא ארגון מדעי מסובך. רוב המחקרים לבחון צמיחה מלאה (לג, יומן, ויש שלבים נייח) של המיקרואורגניזמים, קבלת משוואות פולינומיאלי מסדר גבוה רק לשרת תנאי הסביבה אחד. למרות הפשטות היחסית בעת חישוב המקדמים של המשוואות האלה באמצעות רגרסיה ליניארית, שקשה להקצות להם משמעות ביולוגית אינהרנטית15. הניתוח של צמיחה על-ידי הפרדת שלבי גידול הוא אמין מבחינה מתמטית פשוטה. דוגמה לכך היא המשוואה גידול אקספוננציאלי, אשר מבוססת על קינטיקה מסדר ראשון, משתלב היטב השהיה קצרה שלב ושלב מעריכית.
לבסוף, לימוד השלב יומן באמצעות המשוואה הגידול האקספוננציאלי היא שיטה עקבית כדי להבין את השפעת מיטוכונדריאלי נשימה או תסיסה על מתחם מסוים או הסביבה. מהווה הוכחה של המושג, כימות של צמיחה בשלב מעריכי הוכיח כי RSV משפיע במיוחד על צמיחה הנשימה13,14. . הנה, צמיחה שימש כלי חשוב כדי לזהות כי RIM15 מחיקה סביר משפר את חילוף החומרים fermentative על ידי עיכוב חלקית של יכולת הנשימה cerevisiae ס9. נתונים אלה לאמת כי התבוננות צמיחה מאפשר חקר שיטות ההזנה fermentative, מערכת הנשימה, היא שיטה פשוטה ואמינה. לפיכך, גישה זו מאפשרת הקרנת את ההשפעות של חומר מסוים על נשימה מיטוכונדריאלי או תסיסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
פרויקט זה נתמך על ידי מענקים של Consejo נאסיונאל דה Ciencia y Tecnología (מענק מס ' 293940) ושל Fundación TELMEX-TELCEL (גרנט מספר 162005585), שניהם IKOM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction? Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
