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Biology

Saccharomyces cerevisiae श्वसन और Fermentative चयापचय का विश्लेषण करने के लिए बैच संस्कृति में घातीय वृद्धि कैनेटीक्स

Published: September 30, 2018 doi: 10.3791/58192
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

Summary

यहां हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान घातीय वृद्धि समीकरण को Saccharomyces cerevisiae की घातीय वृद्धि फिटिंग द्वारा श्वसन और fermentative चयापचय का अनुमान है । काइनेटिक मापदंडों की गणना किण्वन या mitochondrial श्वसन पर पदार्थों/यौगिकों के प्रभाव की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

घातीय चरण में Saccharomyces cerevisiae कोशिकाओं किण्वन और/या mitochondrial श्वसन के माध्यम से एटीपी उत्पादन द्वारा उनके विकास को बनाए रखने । किण्वन कार्बन एकाग्रता मुख्य रूप से नियंत्रित करता है कि कैसे खमीर कोशिकाओं एटीपी उत्पंन; इस प्रकार, किण्वन कार्बोहाइड्रेट के स्तर में भिंनता एस cerevisiaeके ऊर्जावान चयापचय ड्राइव । यह कागज एक उच्च प्रवाह घातीय खमीर विकास के आधार पर विधि का वर्णन करने के लिए एकाग्रता में परिवर्तन और श्वसन और fermentative चयापचय पर कार्बन स्रोत की प्रकृति के प्रभाव का अनुमान है । एस cerevisiae की वृद्धि एक microplate में मापा जाता है या ६०० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) का निर्धारण करके एक शंकु कुप्पी हिल । फिर, एक वृद्धि वक्र आयुध डिपो बनाम समय है, जो पहचान और घातीय चरण के चयन की अनुमति देता है की साजिश रचने के द्वारा बनाया गया है, और काइनेटिक मापदंडों प्राप्त करने के लिए घातीय वृद्धि समीकरण के साथ फिट है । उच्च दोहरीकरण समय के साथ कम विशिष्ट विकास दर आम तौर पर एक श्वसन विकास का प्रतिनिधित्व करते हैं । इसके विपरीत, कम दोहरीकरण समय के साथ उच्च विशिष्ट विकास दर fermentative वृद्धि का संकेत है । समय और विशिष्ट वृद्धि दर दोहरीकरण के दहलीज मूल्यों इस तरह के गैर-किण्वित कार्बन स्रोतों या किण्वित शर्करा की उच्च सांद्रता के रूप में अच्छी तरह से ज्ञात श्वसन या fermentative शर्तों, का उपयोग कर का अनुमान है । यह प्रत्येक विशिष्ट तनाव के लिए प्राप्त की है । अंत में, परिकलित काइनेटिक मापदंडों दहलीज मूल्यों के साथ तुलना कर रहे हैं स्थापित करने के लिए कि क्या खमीर से पता चलता है fermentative और/या श्वसन विकास. इस विधि का लाभ एक पदार्थ के प्रभाव को समझने के लिए अपने रिश्तेदार सादगी fermentative या श्वसन चयापचय पर यौगिक/ यह महत्वपूर्ण है कि विकास को उजागर करने के लिए एक जटिल और जटिल जैविक प्रक्रिया है; इसलिए, इस विधि से प्रारंभिक डेटा ऑक्सीजन की खपत और किण्वन शोधकार्य के संचय के ठहराव द्वारा पुष्टि किया जाना चाहिए । इस तरह, इस तकनीक यौगिकों की एक प्रारंभिक स्क्रीनिंग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता/पदार्थ है कि परेशान या fermentative या श्वसन चयापचय में वृद्धि हो सकती है ।

Introduction

Saccharomyces cerevisiae वृद्धि शारीरिक और आणविक तंत्र के दर्जनों की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा की है । विकास मुख्य रूप से तीन तरीकों से मापा जाता है: स्पॉट परीक्षण के लिए सीरियल कमजोर पड़ने, कॉलोनी बनाने इकाई गिनती, और विकास घटता. इन तकनीकों को अकेले या संयोजन में सब्सट्रेट, पर्यावरणीय स्थितियों, म्यूटेंट, और रसायनों की एक किस्म के साथ विशिष्ट प्रतिक्रियाओं या phenotypes की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Mitochondrial श्वसन एक जैविक प्रक्रिया है जिसमें वृद्धि कैनेटीक्स सफलतापूर्वक अज्ञात तंत्र की खोज के लिए लागू किया गया है । इस मामले में, ग्लिसरॉल, स्तनपान, या इथेनॉल के रूप में गैर-किण्वन कार्बन स्रोतों के साथ विकास मीडिया की पूरकता (जो विशेष रूप से mitochondrial श्वसन द्वारा metabolized हैं), एकमात्र कार्बन और ऊर्जा स्रोत के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है के रूप में श्वसन विकास, जो ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण गतिविधि में perturbations का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है1. दूसरी ओर, यह किण्वन के पीछे तंत्र को समझने के लिए एक विधि के रूप में वृद्धि काइनेटिक मॉडल का उपयोग करने के लिए जटिल है ।

किण्वन और mitochondrial श्वसन का अध्ययन Crabtree और Warburg प्रभाव2,3के रूप में कुछ phenotypes के पीछे आणविक तंत्र स्पष्ट करने के लिए आवश्यक है । Crabtree प्रभाव glycolytic फ्लक्स, mitochondrial श्वसन के दमन की वृद्धि की विशेषता है, और प्राथमिक मार्ग के रूप में किण्वन की स्थापना के लिए किण्वन कार्बोहाइड्रेट की उच्च सांद्रता की उपस्थिति में एटीपी उत्पंन (> ०.८ मिमी)4,5. Warburg प्रभाव चयापचय Crabtree प्रभाव के अनुरूप है, अंतर के साथ किया जा रहा है कि स्तनधारी कोशिकाओं में, किण्वन के मुख्य उत्पाद6स्तनपान कराने वाली है । दरअसल, Warburg प्रभाव कैंसर की कोशिकाओं की एक किस्म द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, ग्लूकोज को ट्रिगर और खपत भी ऑक्सीजन7की उपस्थिति में । इस प्रकार, Crabtree प्रभाव में किण्वन के लिए श्वसन से स्विच के आणविक आधार का अध्ययन दोनों (इथेनॉल उत्पादन के लिए) और कैंसर अनुसंधान में संभावित प्रभावों के लिए तकनीकी नतीजों है ।

एस cerevisiae वृद्धि Crabtree और Warburg प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त उपकरण हो सकता है । यह विचार इस तथ्य पर आधारित है कि खमीर घातीय चरण में, केंद्रीय मार्ग एटीपी का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया mitochondrial श्वसन और किण्वन हैं, जो विकास को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं । उदाहरण के लिए, एस cerevisiae के विकास से परिचित एटीपी के समारोह के रास्ते से संबंधित है । एस cerevisiae में, mitochondrial श्वसन लगभग 18 ग्लूकोज अणु प्रति एटीपी अणुओं का उत्पादन, जबकि किण्वन केवल 2 एटीपी अणुओं उत्पंन करता है, इसलिए यह उंमीद है कि विकास दर चयापचय रास्ते के साथ तंग संबंध है एटीपी8उत्पादन । इस संबंध में, जब किण्वन प्रमुख मार्ग एटीपी उत्पन्न करने के लिए है, खमीर कम एटीपी उत्पादन के लिए ग्लूकोज तेज की दर में वृद्धि के लिए क्षतिपूर्ति. इसके विपरीत, खमीर कोशिकाओं द्वारा ग्लूकोज की खपत है कि मुख्य एटीपी स्रोत के रूप में mitochondrial श्वसन का उपयोग कम है । यह इंगित करता है कि यह खमीर के लिए महत्वपूर्ण है निर्धारित कैसे एटीपी उत्पंन किया जाएगा पहले कार्बोहाइड्रेट उपलब्धता भावना । इसलिए, ग्लूकोज उपलब्धता cerevisiae में किण्वन और mitochondrial श्वसन के बीच स्विच में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । ग्लूकोज की उच्च मात्रा की उपस्थिति में, खमीर केंद्रीय मार्ग एटीपी उत्पंन करने के रूप में किण्वन पसंद करते हैं । दिलचस्प है, जब खमीर किण्वन है, विशिष्ट विकास दर अपनी अधिकतम पर बनाए रखा है । दूसरी ओर, ग्लूकोज के निम्न स्तर के तहत, एस cerevisiae mitochondrial श्वसन का उपयोग एटीपी का उत्पादन, कम विकास दर को बनाए रखने. इस प्रकार, ग्लूकोज की एकाग्रता में भिन्नता और अन्य कार्बन स्रोतों का उपयोग fermentative और श्वसन विकास के बीच खमीर की पसंद में परिवर्तन प्रेरित. खाते में घातीय वृद्धि समीकरण के साथ इस तथ्य को लेकर, एक ऐसे दोहरीकरण समय (डीटी) और विशिष्ट विकास दर (µ) के रूप में काइनेटिक मापदंडों के जैविक अर्थ प्राप्त कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, कम µ मूल्यों जब खमीर प्राथमिक मार्ग के रूप में mitochondrial श्वसन का उपयोग करता पाया गया । इसके विपरीत, शर्तों के तहत है कि एहसान किण्वन, उच्च µ मूल्यों पाया गया । यह पद्धति किसी भी रसायनों के संभावित तंत्र को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है किण्वन और एस cerevisiae में mitochondrial श्वसन को प्रभावित ।

इस पत्र का उद्देश्य एक mitochondrial श्वसन या किण्वन पर एक दिया पदार्थ के प्रभाव को परखने के लिए कैनेटीक्स वृद्धि के आधार पर एक विधि का प्रस्ताव है/

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Protocol

1. कल्चरल मीडिया आणि इनोक्युलम तयारी

  1. 2% खमीर निकालने के १०० मिलीलीटर तैयार-peptone-डेक्सट्रोज (YPD) तरल मध्यम (खमीर निकालने के 1 जी जोड़ें, कैसिइन peptone के 2 जी, और आसुत जल के १०० मिलीलीटर के लिए ग्लूकोज की 2 जी) । 15 मिलीलीटर निष्फल शंकु ट्यूबों में मीडिया के 3 मिलीलीटर वितरण । 15 मिनट के लिए १२१ डिग्री सेल्सियस और १.५ साई में मीडिया आटोक्लेव ।
    नोट: मीडिया को 4-8 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. Inoculate-20 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरॉल में संरक्षित एस cerevisiae कोशिकाओं के २५० μL के साथ शांत बाँझ 2% YPD शोरबा के 3 मिलीलीटर के साथ भरा एक शंकु ट्यूब । २०० rpm पर आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर में रात भर गर्मी ।
  3. एक पेट्री डिश लकीर (६० x 15 मिमी2) बाँझ 2% YPD आगर के साथ भरा (खमीर निकालने के 10 जी जोड़ें, कैसिइन peptone के 20 ग्राम, ग्लूकोज के 20 ग्राम, और आसुत जल के १,००० मिलीलीटर के लिए जीवाणु आगार के 20 ग्राम) एक बाँझ पाश का उपयोग कर शंकु ट्यूब में उगाई कोशिकाओं के साथ । अलग कॉलोनियों वृद्धि दिखाने जब तक 30 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश मशीन ।
  4. एक शंकु ट्यूब शांत बाँझ 2% YPD शोरबा के 10 मिलीलीटर के साथ भर में एक एकल पृथक कॉलोनी inoculating द्वारा पूर्व इनोक्युलम तैयार है और यह २०० rpm पर निरंतर आंदोलन के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।

2. संस्कृति मीडिया और Microplate में विकास घटता

  1. 1% YPD शोरबा के 10 मिलीलीटर तैयार (खमीर निकालने के ०.१ ग्राम जोड़ें, peptone के ०.२ जी, और ग्लूकोज के ०.१ ग्राम आसुत जल के 10 मिलीलीटर), 2% YPD शोरबा के 10 मिलीलीटर (खमीर निकालने के ०.१ ग्राम जोड़ें, peptone के ०.२ जी, और आसुत जल के 10 मिलीलीटर के लिए ग्लूकोज की ०.२ जी) , और 10% YPD शोरबा के 10 मिलीलीटर (खमीर निकालने के ०.१ ग्राम जोड़ें, ०.२ peptone के जी, और 1 ग्लूकोज की जी आसुत पानी की 10 मिलीलीटर के लिए) । १२१ ° c और १.५ psi पर 15 मिनट के लिए इन विकास माध्यमों को आटोक्लेव ।
    नोट: संस्कृति मीडिया fermentative विकास के नियंत्रण के रूप में कार्य करता है ।
  2. तैयार 2% खमीर निकालने के 10 मिलीलीटर-peptone-इथेनॉल (यप्) शोरबा और 2% खमीर निकालने के 10 मिलीलीटर-peptone-ग्लिसरॉल (YPG) शोरबा । 2% यप् के लिए: खमीर निकालने के ०.१ जी जोड़ें, peptone के ०.२ जी, और इथेनॉल के ०.२ मिलीलीटर आसुत पानी की 10 मिलीलीटर के लिए । 2% YPG के लिए: खमीर निकालने के ०.१ जी जोड़ें, peptone के ०.२ ग्राम, और ग्लिसरॉल के ०.२ मिलीलीटर आसुत पानी की 10 मिलीलीटर । १२१ ° c और १.५ psi पर 15 मिनट के लिए इन विकास माध्यमों को आटोक्लेव ।
    नोट: ग्लिसरॉल और इथेनॉल गैर किण्वित कार्बन स्रोत है कि विशेष रूप से mitochondrial श्वसन द्वारा metabolized हैं । इस कारण से, वे एक श्वसन वृद्धि नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है । इस चरण में, प्रकार और संस्कृति मीडिया में कार्बन स्रोत की एकाग्रता के लिए विकास phenotype पर प्रभाव का परीक्षण खमीर निकालने का उपयोग कर बदला जा सकता है-peptone (YP) शोरबा (खमीर निकालने के 10 जी और आसुत जल के १,००० मिलीलीटर में कैसिइन peptone के 20 ग्राम) एक आधार के रूप में । कार्बन के अलावा अंय पोषक तत्वों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, सिंथेटिक पूरा (अनुसूचित जाति) मध्यम प्रयोग के उद्देश्य के अनुसार पूरक है । अनुसूचित जाति माध्यम के लिए आधार एमिनो एसिड के बिना खमीर नाइट्रोजन आधार के १.८ ग्राम है, अमोनियम सल्फेट के 5 जी [(NH4)2तो4], १.४ ग्राम के मोनोसोडियम फॉस्फेट (2पीओ4), और आसुत जल के १,००० मिलीलीटर में ड्रॉप आउट मिश्रण के 2 जी । एक कार्बन स्रोत और जरूरत सांद्रता में अतिरिक्त नाइट्रोजन स्रोत के साथ मीडिया के पूरक ।
  3. एक ढक्कन के साथ एक अच्छी तरह से एक बाँझ microplate (10 एक्स 10-अच्छी तरह से) के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए उपयुक्त संस्कृति मीडिया के १४५ μL जोड़ें और उंहें पूर्व इनोक्युलम के 5 μL के साथ inoculate ।
    नोट: यदि उद्देश्य खमीर के ऊर्जावान चयापचय पर पदार्थ/यौगिकों के प्रभाव को स्क्रीन करने के लिए है, इस चरण के दौरान कि पदार्थ/यौगिक जोड़ा जाना चाहिए । इसके अलावा, एक ढक्कन के साथ microplate के किसी भी प्रकार उपयोगी होना चाहिए ।
  4. 30 डिग्री सेल्सियस पर एक microplate रीडर में बहु-अच्छी तरह से थाली गर्मी २०० rpm पर ४८ एच के लिए निरंतर आंदोलन के साथ ६०० एनएम हर 30 या ६० मिनट में ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) को मापने ।
    नोट: microplate पाठक microplate मशीन के लिए विकल्प नहीं है, तो यह आयुध डिपो के हर माप के बीच एक ही स्थिति में एक कक्षीय शेखर में हो सकता है ।

3. हिल शंकु कुप्पी में विकास घटता

  1. 20 मिलीलीटर शंकु कुप्पी और आटोक्लेव के लिए उपयुक्त संस्कृति मीडिया के ४.८ मिलीलीटर जोड़ें । Inoculate पूर्व के २०० μL के साथ प्रत्येक कुप्पी-इनोक्युलम संस्कृति के आयुध डिपो में600nm ~ 2 में शांत, बाँझ 2% YPD शोरबा । उंहें 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए २५० rpm पर लगातार आंदोलन के साथ मशीन ।
    नोट: यदि मशीन की अवधि 24 घंटे से अधिक है, तो ५० मिलीलीटर शंकु कुप्पी और आटोक्लेव के लिए उपयुक्त संस्कृति मीडिया के 12 मिलीलीटर जोड़ें । उन्हें प्री-इनोक्युलम के ५०० μL के साथ Inoculate. यह भी fermentative वृद्धि नियंत्रण पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है (YP मीडिया के साथ 1%, 2%, या 10% ग्लूकोज) और श्वसन विकास नियंत्रण (YP मीडिया के साथ 2% ग्लिसरॉल या इथेनॉल).
  2. हिल शंकु कुप्पी संस्कृति के १०० μL लो और एक 1 मिलीलीटर spectrophotometer cuvette में आसुत जल के ९०० μL में यह पतला है, और धीरे pipetting द्वारा मिश्रण । ६०० एनएम में एक spectrophotometer हर 2 एच का उपयोग कर आयुध डिपो को मापने । असली आयुध डिपो प्राप्त करने के लिए, दस से परिणाम गुणा ।

4. डाटा प्रोसेसिंग और काइनेटिक मापदंडों गणना

  1. सांख्यिकीय पैकेज सॉफ़्टवेयर में कोई नई प्रोजेक्ट फ़ाइल बनाएँ । " नई तालिका और ग्राफ़"के अनुभाग में, "XY" विकल्प चुनें ।
    1. विकल्प का चयन करें: " नमूना डेटा" खंड में " एक रिक्त डेटा तालिका के साथ प्रारंभ करें" ।
    2. "अंक और कनेक्ट लाइन" ग्राफ प्रकार का चयन करें । " X" खंड के खंड में अचयनित छोड़ "प्रतिकृति या त्रुटि मान के लिए उपस्तंभ", और "Y" खंड में विकल्प चुनें: "दर्ज करें (10) साइड में उप-स्तंभ और साजिश का मतलब है और त्रुटि एसडी की ओर से मूल्यों को दोहराने"। बनाएं बटन क्लिक करें ।
      नोट: तालिका स्वरूप में एक X स्तंभ और कई Y स्तंभ, प्रत्येक 10 उपस्तंभ पहले से चुने गए हैं ।
  2. जिस पर ओडी माप X कॉलम (जैसे, 0, 30, ६०, ९० मिनट या 0, 1, १.५, 2 ज) में ले जाया गया समय लिखें । Y स्तंभों में, संस्कृतियों से प्राप्त आयुध डिपो मान लिखें ।
  3. Y स्तंभ डेटा को लघुगणक में रूपांतरित करने वाले घातांक विकास चरण की पहचान करें । " विश्लेषण" बटन पर क्लिक करें, "रूपांतरण" विश्लेषण चुनें, y का उपयोग कर मान y = लॉग (y) का चयन । "परिणामों की गैलरी"पर जाएं, " ट्रांस्फ़ॉर्म" डेटा तालिका का चयन करें, "विश्लेषण" बटन क्लिक करे, और "रेखीय प्रतीपगमन" विश्लेषण चुनें । एक रेखीय व्यवहार का पालन नहीं करते जो आयुध डिपो मान छोड़ें । मानों को छोड़ने के लिए, डेटा तालिका में उनका चयन करें और "Ctrl + E"लिखें.
    नोट: घातीय वृद्धि समीकरण घातीय चरण के साथ अच्छी तरह से फिट बैठता है के बाद से घातांक चरण का पालन नहीं मानों कि बाहर करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  4. "डेटा तालिकाओं गैलरी"में, डेटा तालिका "डेटा 1"का चयन करें. " विश्लेषण" बटन पर क्लिक करें और " XY विश्लेषण" के बीच "रेखीय प्रतीपगमन (वक्र फ़िट)" विश्लेषणचुनें ।
  5. विश्लेषण और "ठीक" बटन पर क्लिक करने के लिए डेटा सेट का चयन करें । " फ़िट" टैब में " घातीय समीकरण" अनुभाग चुनें और "घातीय वृद्धि समीकरण का चयन करें" (, जहां एक्स सेल एकाग्रता है, x0 शूंय समय में सेल एकाग्रता है, μ विशिष्ट विकास दर है, और टी समय है) । का प्रयोग करें "ंयूनतम चौकों फ़िट" एक फिटिंग विधि के रूप में और लगाना अनुभाग अचयनित छोड़ दें । "ठीक" बटन पर क्लिक करें ।
    नोट: रेखीय फ़िट परिणामों के साथ टैब "परिणामों की गैलरी"में है । सॉफ्टवेयर दोहरीकरण समय (डीटी) और विशिष्ट वृद्धि दर (μ) की गणना करता है । सॉफ़्टवेयर परिणाम टैब में K के रूप में μ दिखाता है ।
  6. कोई नया प्रोजेक्ट फ़ाइल खोलें, और "नई तालिका और ग्राफ़" अनुभाग में, स्तंभ विकल्प का चयन करें । विकल्प चुनें "एक खाली डेटा तालिका के साथ शुरू" और वांछित ग्राफ का चयन करें । एसडी के साथ मतलब साजिश करने के लिए चुनें. "बनाएँ" बटन का चयन करें.
  7. "परिणामों की गैलरी" में है जो रेखीय फ़िट परिणाम टैब से μ या Dt मान की प्रतिलिपि बनाएँ और उन्हें किसी स्तंभ में चिपकाएँ । अंत में, "विश्लेषण" बटन का चयन करें और "कॉलम विश्लेषण" अनुभाग में वांछित विश्लेषण चुनने के लिए विभिंन nutrimental शर्तों के काइनेटिक मापदंडों की तुलना ।
    नोट: fermentative वृद्धि नियंत्रण से प्राप्त काइनेटिक मापदंडों (YP मीडिया के साथ 1%, 2%, या 10% ग्लूकोज) और श्वसन विकास नियंत्रण (2% ग्लिसरॉल या इथेनॉल के साथ YP मीडिया) fermentative और mitochondrial श्वसन की दहलीज की स्थापना में मदद करता है, क्रमशः. पोषण की स्थिति और पदार्थ से काइनेटिक मापदंडों की तुलना/श्वसन और fermentative विकास मदद श्वसन या fermentative चयापचय पर संभावित प्रभाव की पहचान के साथ परख ।

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Representative Results

ग्रोथ घटता है तो एस cerevisiae यीस्ट में श्वसन और fermentative phenotypes के बीच भेदभाव preliminarily किया जा सकता है. इसलिए, हम विभिंन ग्लूकोज सांद्रता कि fermentative वृद्धि के लिए प्रेरित करने के लिए सूचित किया गया है के साथ एस cerevisiae (BY4742) के बैच संस्कृतियों प्रदर्शन: 1%, 2%, और 10% (डब्ल्यू/ एक fermentative phenotype दिखा संस्कृतियों एक छोटे अंतराल चरण और एक उच्च विकास दर (चित्रा 1) के साथ एक घातीय चरण है । इथेनॉल, ग्लिसरॉल, और स्तनपान कार्बन स्रोत है कि केवल श्वसन के माध्यम से metabolized जा सकता है; इस प्रकार, हम उन कार्बन स्रोतों का उपयोग कर खमीर की संस्कृतियों का प्रदर्शन किया । संस्कृतियों है कि मुख्य रूप से ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण द्वारा ऊर्जा प्राप्त एक लंबा अंतराल चरण और घातीय चरण (चित्रा 2) के दौरान विकास की धीमी दर से पता चला ।

विकास curves के विश्लेषण केवल गुणात्मक जानकारी प्रदान करता है; इसलिए, यह मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए काइनेटिक मापदंडों की गणना करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम और डीटी की गणना की घातीय वृद्धि समीकरण (चित्रा 3) का उपयोग कर μ । हम डीटी ≥ ११.५ ज पर श्वसन विकास मूल्यों के लिए एक दहलीज सेट और μ ≤ 0.059/ fermentative वृद्धि के लिए दहलीज डीटी ≤ ६.५ एच और μ ≥ 0.149/एच (चित्रा 3) पर सेट किया गया था ।

इस स्क्रीनिंग उपकरण हम तीन प्रयोग डिजाइन की उपयोगिता साबित करने के लिए, विभिंन ऊर्जावान स्थिति (चित्रा 4) के साथ एस cerevisiae BY4742 कोशिकाओं पर अलग resveratrol (RSV) सांद्रता के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए पहले के साथ कुप्पी हिल । दूसरा प्रयोग एस cerevisiae BY4742 के ऊर्जा चयापचय पर विभिन्न अमोनियम सल्फेट (NH4+) सांद्रता के प्रभाव का पता लगाने के उद्देश्य से एक microplate में (चित्रा 5) । अंत में, तीसरे को वर्णन कैसे कार्बन स्रोत में परिवर्तन दो अलग एस cerevisiae उपभेदों में fermentative विकास प्रभावित (W303 और औद्योगिक बियर किण्वन के लिए इस्तेमाल किया WLP530) (चित्रा 6) के उद्देश्य से। RSV का उपयोग करते हुए प्रयोग में, कोशिका ऊर्जावान स्थिति ग्लूकोज एकाग्रता बदलती द्वारा संशोधित किया गया था. पर 10% ग्लूकोज, सभी RSV सांद्रता का परीक्षण खमीर के respiro-fermentative चरण में परिवर्तन नहीं किया था, लेकिन श्वसन चरण कम किया (diauxic शिफ्ट के दौरान, एस cerevisiae metabolized द्वारा घातीय चरण के दौरान उत्पादित इथेनॉल ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण) । μ मान की पुष्टि की है कि सभी शर्तों का परीक्षण के तहत, एस cerevisiae fermentative व्यवहार दिखाया, इसके विपरीत जब 2% ग्लिसरॉल (एक श्वसन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया हालत) में हो phenotype (4a आंकड़ा) । जब कक्ष केवल 1% ग्लूकोज के साथ सक्रिय किए गए थे, तो μ मान ०.१, 1, 10 और १०० µ m RSV पर, fermentative व्यवहार respiro-fermentative चरण में प्रभावित नहीं था की पुष्टि की । हालांकि, diauxic शिफ्ट के दौरान श्वसन चरण में कमी देखी गई । इसके अलावा, १,००० µ मीटर की एकाग्रता पर, RSV पूरी तरह से कोशिका विकास को बाधित ।

दूसरा प्रयोग में, कोशिकाओं को 10% ग्लूकोज के साथ पूरक थे, एक एकाग्रता एस cerevisiae में Crabtree प्रभाव पैदा करने के लिए पर्याप्त माना जाता है. इसलिए, हम fermentative चयापचय में एनएच4 के विभिन्न सांद्रता की पूरकता द्वारा पदोन्नत प्रभाव का पालन कर सकता है. डीटी मूल्यों का सुझाव दिया है कि ०.१३, ०.६६, और १.९९% NH4+ एहसान fermentative चयापचय, और यह विकास घटता है कि इन सांद्रता संस्कृति के घातीय चरण बढ़ाया में मनाया जा सकता है । फिर भी, पर ३.३१% मिमी एनएच4+, डीटी मूल्य में एक वृद्धि से पता चला है कि यह एकाग्रता एक respiro-fermentative चयापचय लाती है । इस phenotype में वृद्धि curves और घातीय चरण (चित्रा 5) में धीमी वृद्धि दर में एक विस्तारित अंतराल चरण दिखाया ।

तीसरे प्रयोग में, दो अलग एस cerevisiae उपभेदों की कोशिकाओं (W303 और WLP530) सुक्रोज या गैलेक्टोज के विभिंन सांद्रता में उगाया गया परीक्षण के लिए अगर डीटी मूल्यों पर कार्बन स्रोत के प्रभाव थे तनाव पर निर्भर है । एक fermentative नियंत्रण के रूप में, दोनों उपभेदों 2% ग्लूकोज में बड़े थे, और डीटी मूल्यों fermentative वृद्धि के लिए एक दहलीज सेट करने के लिए गणना की गई । उपभेदों के लिए fermentative डीटी मूल्यों, WLP530 तनाव के लिए W303 तनाव और ≤ ६.८४ एच के लिए ≤ ३.२५ एच के साथ अलग थे । इसलिए, उपयोग किए गए विभिन्न उपभेदों के लिए डीटी थ्रेशोल्ड मान्य करने के लिए आवश्यकता को हाइलाइट करने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, जब सुक्रोज कार्बन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया था, एक fermentative phenotype 2% और दोनों उपभेदों में 10% पर मनाया गया । हालांकि, जब गैलेक्टोज इस्तेमाल किया गया था, तनाव W303 सांद्रता के किसी भी परीक्षण में fermentative व्यवहार नहीं दिखा था, जबकि WLP530 तनाव 2% fermentative पर एक phenotype गैलेक्टोज दिखाया । दिलचस्प है, W303 तनाव दोनों कार्बन स्रोतों का परीक्षण सभी सांद्रता में वृद्धि हुई । हालांकि, WLP530 तनाव का उपयोग कार्बन की सबसे कम एकाग्रता में वृद्धि नहीं दिखा था (०.०१%) । यह हो सकता है क्योंकि WLP530 बियर उद्योग में प्रयोग किया जाता है और कार्बन सांद्रता जो यह उजागर होता है आम तौर पर बहुत अधिक (चित्रा 6) ।

कुल मिलाकर, इन तीन प्रयोगों से डेटा साबित होता है कि विकास घटता है और काइनेटिक पैरामीटर एस cerevisiaeमें श्वसन और fermentative विकास के बीच प्रारंभिक भेदभाव के लिए उपयोगी होते हैं । इसके अलावा, यह प्रकाश डाला है कि यह एक बहुमुखी उपकरण है कि ऊर्जा चयापचय अनुसंधान के विभिंन पहलुओं में इस्तेमाल किया जा सकता है महत्वपूर्ण है ।

Figure 1
चित्रा 1: एस cerevisiae वृद्धि phenotype पर विभिन्न ग्लूकोज सांद्रता का प्रभाव. विकास curves ६०० एनएम में ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा निर्माण किया गया ४८ एच के लिए हर 30 मिनट । जब एस cerevisiae कोशिकाओं को उबाल, संस्कृतियों एक छोटे अंतराल चरण और घातीय चरण के दौरान तेजी से विकास दर दिखाया । respiro-fermentative चरण वृद्धि मंदी चरण (श्वसन चरण) के बाद किया जा सकता है, जहां किण्वन द्वारा उत्पादित इथेनॉल ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण मार्ग का उपयोग कर metabolized है, तो स्थिर चरण पहुंच गया है । डेटा मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एस cerevisiae वृद्धि phenotype पर respirable कार्बन स्रोतों का प्रभाव । वृद्धि curves ६०० एनएम में ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा निर्माण किया गया ४८ एच के लिए हर 30 मिनट एस cerevisiae की कोशिकाओं के एक लंबे समय तक अंतराल चरण और घातीय चरण के दौरान धीमी गति से विकास दर दिखाया और आम तौर पर एक diauxic बदलाव नहीं दिखा था । डेटा मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: कार्बन स्रोत के प्रभाव और एस cerevisiae काइनेटिक मापदंडों पर अपनी एकाग्रता । (क) विभिन्न कार्बन स्रोतों के अंतर्गत एस. cerevisiae BY4742 वृद्धि का डीटी मान; (ख) विविध कार्बन स्रोतों के विभिन्न सांद्रता के अंतर्गत एस cerevisiae BY4742 वृद्धि के μ मान. डेटा मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । सांख्यिकीय विश्लेषण एक Dunnett का परीक्षण (*p < 0.01 बनाम 2% ग्लूकोज) के बाद एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग कर किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: अलग सेल ऊर्जा की स्थिति पर resveratrol पूरकता का प्रभाव । (क) वृद्धि phenotype और μ 10% ग्लूकोज का उपयोग कर मान; (ख) 1% ग्लूकोज का उपयोग करते हुए वृद्धि phenotype और μ मान । वृद्धि curves से डेटा मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, और μ मूल्यों मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । Dunnett का परीक्षण [*p < 0.01 बनाम श्वसन नियंत्रण के साथ 2% ग्लिसरॉल (RC)] के बाद एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग करते हुए, μ मानों के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एस cerevisiae ऊर्जा चयापचय पर अमोनियम सल्फेट पूरकता का प्रभाव । वृद्धि curves ६०० एनएम में ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा निर्माण किया गया ४८ एच के लिए हर 30 मिनट वृद्धि curves से डेटा मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं, और μ मूल्यों मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । डीटी मानों के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण एक Dunnett के परीक्षण के बाद एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग कर किया गया था [ * p < 0.01 बनाम श्वसन नियंत्रण 2% ग्लिसरॉल (RC)] के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: Saccharomyces cerevisiae के fermentative चयापचय में गैलेक्टोज और सुक्रोज एकाग्रता का प्रभाव । (क) W303 लैब तनाव के लिए डीटी मान और (ख) WLP530 औद्योगिक तनाव के लिए डीटी मूल्यों । डेटा मतलब ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । डीटी मानों के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण एक Dunnett के परीक्षण के बाद एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग कर किया गया [* p < 0.01 बनाम 2% ग्लूकोज़ (fermentative control)] । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एक लंबे समय के बाद से पारित कर दिया है जे मोनो10 व्यक्त की है कि बैक्टीरियल संस्कृतियों के विकास के अध्ययन के सूक्ष्म जीव विज्ञान की बुनियादी विधि है. आणविक उपकरणों के आगमन के उपयोग और एक तकनीक के रूप में विकास के अध्ययन में देरी । विकास की जटिलता है जो कई संबंधित प्रक्रियाओं शामिल है के बावजूद, इसके अंतर्निहित तंत्र गणितीय मॉडल11का उपयोग करके वर्णित किया जा सकता है । यह एक मजबूत दृष्टिकोण है कि एक पूरक के लिए सबसे जटिल आणविक तंत्र12स्पष्ट उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस विधि से विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, निम्न महत्वपूर्ण चरणों पर विचार करना महत्वपूर्ण है. २५० rpm पर आंदोलन कम कार्बन स्रोत है कि सांस की वृद्धि डालती में अच्छी वृद्धि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, जब से कम आंदोलन गति का उपयोग कर (150-180 rpm) हम श्वसन स्थितियों में कम वृद्धि मनाया । यह एक नए सिरे से शेयर रोजगार प्रोटोकॉल शुरू महत्वपूर्ण है, और यह भी परख में एक समान phenotype बनाए रखने के लिए आवश्यक है । वृद्धि कैनेटीक्स थ्रेशोल्ड मान उपभेदों के बीच बदलती हैं और परख में उपयोग करने के लिए शर्त के अनुसार मान्य किया जाना चाहिए. GraphPad चश्मे सॉफ्टवेयर का प्रस्ताव है क्योंकि घातीय वृद्धि समीकरण पहले से ही लोड है; हालांकि, किसी भी अंय सॉफ्टवेयर उपयुक्त है, बशर्ते यह घातीय वृद्धि समीकरण के प्रोग्रामिंग की अनुमति देता है । microplate में, यह इनोक्युलम के बिना विकास मीडिया के १५० μL के साथ तीन कुओं को शामिल करने की सिफारिश की है-यह एक नियंत्रण है कि अगर microplate कुओं संदूषण का सामना करना पड़ा है इंगित करता है ।

यह इंगित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि किसी रेखीय स्केल पर आयुध डिपो की प्लॉट करना लघुगणकीय विकास चरण को निर्धारित करना कठिन बना सकता है । इस समस्या को एक लॉग स्केल में आयुध डिपो की साजिश रचने से दूर किया जा सकता है ताकि अंतराल चरण और लघुगणकीय विकास चरण स्पष्ट दिखाई दे ।

इस प्रोटोकॉल केवल एक phenotype स्क्रीन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इसलिए किण्वन और mitochondrial श्वसन पर विशिष्ट प्रभाव की पुष्टि की जानी चाहिए । हम ऑक्सीजन की खपत परख13,14द्वारा mitochondrial श्वसन के ठहराव की सिफारिश, जबकि किण्वन ऐसे एसीटेट, succinate, ग्लिसरॉल, और 9 इथेनॉल के रूप में शोधकार्य के संचय द्वारा निर्धारित किया जा सकता है .

एस cerevisiae विकास आणविक तंत्र और phenotypes को समझने के लिए एक साधन के रूप में कार्य किया है, स्क्रीनिंग से परख परीक्षण के तरीकों के साथ। बहरहाल, साहित्य में कई प्रयोगात्मक डिजाइन केवल एक गुणात्मक पैरामीटर (जैसे, प्लेट कमजोर पड़ने या विकास घटता) के रूप में खमीर विकास का उपयोग करें, तो इन तकनीकों के रोजगार मूल्यवान सबूत उपेक्षा । उदाहरण के लिए, एक माइक्रोबियल आबादी गिनती या बनाने धारावाहिक-कमजोर पड़ने के लिए इस्तेमाल किया प्लेटों में उपलब्ध ऑक्सीजन सीमित है, श्वसन शर्तों के तहत उलझी हुई वृद्धि माप । इसके अलावा, जब दो या अधिक कोशिकाओं को एक दूसरे से जुड़े रहते हैं, केवल एक कॉलोनी मनाया जाता है । एक और सीमा एक दृश्य परिणाम के रूप में विकास घटता का उपयोग करने के लिए विकास में अंतर को उजागर है, जो एक तरफ सूक्ष्म मतभेदों के बारे में तथ्यों को छोड़ सकते हैं । इसलिए, मात्रात्मक मापदंडों के लिए वृद्धि की जानकारी का अनुवाद लागू phenotype के बारे में सटीक डेटा की उपलब्धि परमिट । फिर भी, विकास के गणितीय प्रतिनिधित्व एक जटिल वैज्ञानिक उद्यम है । सबसे अध्ययन पूर्ण विकास की जांच (अंतराल, प्रवेश, और सूक्ष्म जीवाणुओं के स्थिर चरणों), उच्च आदेश बहुपद समीकरण है कि केवल एक पर्यावरणीय स्थिति की सेवा प्राप्त करने । रैखिक प्रतिगमन द्वारा इन समीकरणों के गुणांक की गणना करते समय रिश्तेदार सादगी के बावजूद, यह एक अंतर्निहित जैविक अर्थ15के लिए उन्हें आवंटित करने के लिए मुश्किल है. विकास के चरणों को अलग करके विकास का विश्लेषण गणितीय रूप से विश्वसनीय और सीधा है. इस का एक उदाहरण घातीय वृद्धि समीकरण है, जो पहली आदेश कैनेटीक्स पर आधारित है और एक छोटे अंतराल चरण और घातीय चरण के साथ अच्छी तरह से फिट बैठता है ।

अंत में, घातीय वृद्धि समीकरण का उपयोग कर लॉग चरण का अध्ययन एक सुसंगत तरीका है एक विशिष्ट यौगिक या पर्यावरण पर mitochondrial श्वसन या किण्वन के प्रभाव को समझते हैं । अवधारणा का एक सबूत के रूप में, घातीय चरण में वृद्धि की ठहराव प्रदर्शन किया है कि RSV विशेष रूप से श्वसन विकास13,14को प्रभावित करता है । यहां, विकास की पहचान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा की है कि RIM15 हटाने की संभावना एस cerevisiae9में श्वसन क्षमता के आंशिक निषेध द्वारा fermentative चयापचय में सुधार । इन आंकड़ों पुष्ट है कि देख विकास fermentative और श्वसन चयापचय के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और एक सरल और विश्वसनीय तरीका है । इसलिए, इस दृष्टिकोण mitochondrial श्वसन या किण्वन पर एक विशिष्ट पदार्थ के प्रभाव को परखने के लिए अनुमति देता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना को Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (अनुदान संख्या २९३९४०) और Fundación TELMEX-TELCEL (अनुदान संख्या १६२००५५८५), दोनों को IKOM के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Orbital Shaker Thermo Scientific 4353 For inoculum incubation or conical fask cultures
Bioscreen  Growth curves C MBR For batch cultures in microplates
Glucose Sigma  G7021 For YPD broth preparation
Peptone from casein, enzymatic digest Sigma  82303 For YPD broth preparation
Yeast extract Sigma  09182-1KG-F For YPD broth preparation
Bacteriological Agar Sigma  A5306 For YPD agar preparation
NaH2PO4 Sigma  S8282 For SC broth preparation
(NH4)2SO4 Sigma  A4418 For SC broth preparation
Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate Sigma  Y1251 For SC broth preparation
Yeast synthetic drop-Out medium supplements Sigma  Y1501 For SC broth preparation
Ammonium sulfate granular J.T. Baker 0792-R For medium supplementation example
Resveratrol Sigma  R5010 For medium supplementation example
Galactose Sigma  G8270 For medium supplementation example
Sucrose Sigma  S7903 For medium supplementation example
Absolut ethanol Merck 107017 For medium supplementation example
Glycerol J.T. Baker 2136-01 For medium supplementation example
GraphPad Prism GraphPad Software For data analysis
Honeycomb microplates Thermo Scientific 9502550 For microplate cultures

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References

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जीव विज्ञान अंक १३९ Saccharomyces cerevisiae विकास कैनेटीक्स घातीय चरण बैच संस्कृतियों घातीय वृद्धि समीकरण mitochondrial श्वसन किण्वन
<em>Saccharomyces cerevisiae</em> श्वसन और Fermentative चयापचय का विश्लेषण करने के लिए बैच संस्कृति में घातीय वृद्धि कैनेटीक्स
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Olivares-Marin, I. K., González-Hernández, J. C., Regalado-Gonzalez, C., Madrigal-Perez, L. A. Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism. J. Vis. Exp. (139), e58192, doi:10.3791/58192 (2018).

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