Summary
ここで指数方程式に酵母の急激な成長をあてはめによる呼吸と発酵の代謝を推定するためのプロトコルを提案する.速度論的パラメーターの計算は、発酵やミトコンドリア呼吸に及ぼす物質・化合物のスクリーニングが可能です。
Abstract
指数段階の酵母細胞が発酵やミトコンドリアの呼吸によって ATP を生産することによって成長を支えます。発酵性の炭素濃度は主に酵母細胞が ATP; を生成する方法を制御します。したがって、発酵性炭水化物含量の変化は、出芽酵母のエネルギー代謝を駆動します。本稿では、濃度の変化の影響と呼吸と発酵の代謝に炭素源の性質を推定する指数の酵母の増殖に基づく高スループット方法について説明します。出芽酵母の成長はマイクロ プレートで測定または円錐動揺 600 の光学濃度 (OD) を決定することによってフラスコ nm。その後、成長曲線は、対指数段階の特定および選定し装備は指数関数的成長方程式運動パラメーターを取得する時間のプロットの OD で組み込まれています。2 倍時間が高い低固有成長率は一般に呼吸成長を表します。逆に、下方の 2 倍の時間で特定の成長率は、発酵の成長を示します。倍加時間と特定の成長率のしきい値は、非発酵性の炭素源や発酵性の糖の高濃度など、よく知られている呼吸または発酵条件を使用して推定されます。これは、各特定の緊張に取得されます。最後に、計算の速度論的パラメーターは、酵母が発酵および/または呼吸の成長を示すかどうかを確立するしきい値と比較されます。この方法の利点は、発酵や呼吸代謝に及ぼす物質/化合物を理解するための相対的なシンプルさです。成長が、複雑な複雑な生物学的プロセスであることを強調することが重要です。したがって、このメソッドからの予備的なデータは、酸素消費量の定量化と発酵副産物の蓄積によって確証する必要があります。これにより、この手法は、邪魔されたり、発酵や呼吸代謝を高める化合物/物質のスクリーニングとして使用できます。
Introduction
酵母の生育生理・分子機構の多数を識別するために貴重なツールとして務めています。成長は主に 3 つの方法によって測定: スポット テスト、コロニー形成単位のカウントは、成長曲線のシリアル希薄。これらの手法は、特定の応答または表現型を調査する単独または様々 な基板、環境条件、変異体、および化学薬品との組み合わせで使用できます。
ミトコンドリアの呼吸は、成長カイネティクスを未知のメカニズムを発見するため正常に適用されている生物学的プロセスです。この場合、非発酵性の炭素の成長媒体の補充源 (ミトコンドリア呼吸により代謝されて排他的) エタノールや乳酸、グリセロールなどの評価により、カーボンおよびエネルギー源として、呼吸器の成長、酸化的リン酸化アクティビティ1の摂動を検出することが重要であります。その一方で、発酵の背後にあるメカニズムを解読するための方法として成長速度論的モデルを使用する複雑です。
クラブツリーとウォーバーグの効果2,3などの特定の表現型の背後にある分子メカニズムを明らかにする発酵とミトコンドリアの呼吸の研究が欠かせません。Crabtree の効果は解糖系フラックスの増加、ミトコンドリア呼吸の抑制、発酵、発酵性炭水化物高濃度の存在下で ATP を生成するための主要な道の確立によって特徴付けられる (>0.8 mM)4,5。Warburg 効果は、発酵の主な製品は、哺乳類細胞、乳酸6されて代謝アナログ違い Crabtree の効果です。確かに、Warburg 効果は、さまざまな癌細胞の糖代謝と酸素7存在下でも消費トリガーによって展示されます。これにより、呼吸から発酵 Crabtree の効果への切り替えの分子基盤を勉強 (エタノール生産) のためのバイオ テクノロジーの影響と潜在的な影響の両方にいるがん研究
出芽酵母成長クラブツリーと Warburg 効果を研究する適切なツールがあります。このアイデアは酵母指数段階の ATP を生成するために使用する中央の経路がミトコンドリアの呼吸と発酵が成長を維持するために不可欠であるという事実に基づいています。例えば、酵母の成長は ATP 生成経路の機能に密接に関連しています。出芽酵母は、ミトコンドリア呼吸生成約 18 ATP 分子グルコース分子あたりの発酵だけ 2 ATP 分子を生成するのに対しそれ故にそれは期待成長率が新陳代謝の細道の緊密なリンクを持っていることATP8を生産します。この点で、発酵が ATP を生成する主要ルートと、酵母は低 ATP 生産のための糖取り込み率を増加を補正します。逆に、ミトコンドリア呼吸を使用して、ATP の主要な源として酵母細胞でブドウ糖の消費は低いです。これは ATP の生成方法を決定する前に感覚の炭水化物の可用性には、酵母にとって重要だを示します。発酵とミトコンドリア呼吸に切り替えるグルコース可用性が重要な役割を果たしているため、酵母。血糖値の高い量の存在下では、酵母は、ATP 生成に中央ルートとして発酵を好みます。興味深いことに、酵母を発酵すると、比増殖速度は最大限に維持されます。その一方で、ブドウ糖の低レベルで出芽酵母は低い成長率を維持するミトコンドリア呼吸を使用して ATP を生成します。それによって、グルコースと他の炭素源の利用の濃度の変化は発酵と呼吸成長間酵母の嗜好の変化を誘発します。指数方程式のこの事実を考慮して、1 つは倍加時間 (Dt) と特定の成長率 (μ) などの速度論的パラメーターの生物学的意義を取得できます。たとえば、酵母の主要な道としてミトコンドリア呼吸を使用する場合、低いμ値が発見されました。逆に、発酵を支持する条件の下で高いμの値が見つかりました。発酵とミトコンドリア呼吸に影響を与えるすべての化学物質の考えられるメカニズムを測定するこの手法を使用することがあります酵母。
本稿の目的は、ミトコンドリアの呼吸または発酵に及ぼす特定物質/化合物をスクリーニングするための成長速度論に基づく方法を提案することです。
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Protocol
1. 文化メディアと接種材料の準備
- 2% 酵母エキス ペプトン右旋糖 (YPD) 液体培地の 100 ml (1 グラム酵母エキス、ペプトン、カゼインの 2 g と 2 g のブドウ糖 100 mL に蒸留水を追加)。メディアの 3 mL を 15 mL 滅菌の円錐管に分配します。オートクレーブ 121 ° C および 1.5 psi で 15 分メディア。
注意: メディアが 4-8 ° C で最大 1 ヶ月間保存できます。 - グリセロール-20 ° C で保存酵母細胞の 250 μ L とクールな滅菌 2 %ypd スープの 3 ml コニカル チューブに接種します。200 rpm で攪拌と 30 ° C で軌道シェーカーで一晩インキュベートします。
- ペトリ皿 (60 × 15 mm2) 滅菌 2 %ypd 寒天でいっぱい連勝 (酵母 10 g を抽出、カゼイン ペプトン 20 g、ブドウ糖 20 g、20 g を 1,000 mL の細菌の寒天の蒸留水を追加) 滅菌ループを使って円錐管で育った細胞で。隔離されたコロニーは成長を示すまでは、30 ° C でシャーレを孵化させなさい。
- クールな滅菌 2 %ypd スープの 10 ml の円錐管に単一の隔離されたコロニーを接種前接種を準備し、200 rpm で連続攪拌 30 ° C で一晩それを孵化させなさい。
2. 文化メディアとマイクロ プレートの成長曲線
- 1 %ypd 液 10 mL を準備 (0.1 グラム酵母エキス、ペプトン、0.2 g と蒸留水 10 mL にブドウ糖の 0.1 g を追加)、2 %ypd スープ 10 mL (0.1 グラム酵母エキス、ペプトン、0.2 g と蒸留水 10 mL にブドウ糖の 0.2 g を追加)、10 %ypd スープ 10 ml (0.1 グラム酵母エキス、ペプトン、0.2 g と 1 g を 10 mL のブドウ糖の蒸留水を追加)。オートクレーブ 1.5 psi、121 ° C で 15 分間のこれらの成長媒体。
注: 文化メディア発酵成長のコントロールとして機能します。 - 2% の酵母エキス ペプトン エタノール (型) 液 10 mL と 2% の酵母エキス ペプトン グリセロール (YPG) 液 10 mL を準備します。2% のタイプ: 0.1 グラム酵母エキス、ペプトン、0.2 g と蒸留水 10 mL にエタノール 0.2 mL を追加。2% の YPG: 0.1 グラム酵母エキス、ペプトン、0.2 g と蒸留水 10 mL にグリセリン 0.2 mL を追加。オートクレーブ 1.5 psi、121 ° C で 15 分間のこれらの成長媒体。
注: グリセリンとエタノールは、ミトコンドリアの呼吸により代謝されて排他的非発酵性の炭素源です。このため、彼らは呼吸成長コントロールとして使用されます。このステップでは、酵母エキス ペプトン (YP) スープ (10 g 酵母エキスと 1,000 mL の蒸留水でカゼイン ペプトン 20 g) をベースとした成長の表現型に及ぼす影響をテストの種類と培地の炭素源の濃度を変更ことができます。炭素以外の他の栄養素の効果をテストするため、実験の目的によると合成完了 (SC) 培地は補われます。SC 中のベースはアミノ酸、硫酸アンモニウム 5 g なし基本酵母窒素の 1.8 g [(NH4)2など4]、リン酸二水素ナトリウム (NaH2PO4) の 1.4 g とドロップ アウトの 2 g を蒸留水 1,000 mL にミックスします。炭素源と必要な濃度の窒素ソース メディアを補足します。 - フタ付き滅菌マイクロ プレート (10 x 10 も) の各ウェルに実験的なデザインの適切な培地の 145 μ L を追加し、事前接種の 5 μ L とそれらを接種します。
注: 目的は、酵母のエネルギー代謝に及ぼす物質/化合物をスクリーニングするため、物質/化合物がこのステップの間に追加する必要があります。また、マイクロ プレート、ふた付きの任意の型は役に立つはず。 - 48 h. メジャー 600 の光学濃度 (OD) の 200 rpm で一定の攪拌と 30 ° C でマイクロ プレート リーダーのウェル プレートを孵化させなさい nm 30 分または 60 分毎。
注: マイクロ プレート リーダーにマイクロ プレートをインキュベートするオプションが設定されていない場合 OD のすべての測定の間同じ条件で軌道シェーカーで孵化する可能性があります。
3. 成長曲線の三角フラスコを振って
- 20 mL 三角フラスコとオートクレーブに適した培地の 4.8 mL を追加します。外径600 ナノメートルクールな滅菌の 2 %ypd スープ 〜 2 で事前接種文化 200 μ L を各フラスコを接種します。24 h の 250 rpm で一定の攪拌と 30 ° C でそれらを孵化させなさい。
注: 潜伏期間が 24 時間よりも高い場合は、50 mL 三角フラスコとオートクレーブに適した培地の 12 mL を追加します。事前接種の 500 μ L とそれらを接種します。また、発酵の成長コントロール (1%、2%、または 10% ブドウ糖と YP メディア) および呼吸成長コントロール (YP メディア 2% グリセロールまたはエタノール) を考慮することが重要です。 - 動揺円錐フラスコ培養の 100 μ L を取ると蒸留水 1 mL 分光光度計のキュベット、900 μ L で希釈して、軽くピペッティングで混ぜます。600 で外径を測定 nm の吸光度すべて 2 h。本当の OD を得るためには、結果を 10 倍します。
4. データ処理および速度論的パラメーターの計算
-
統計パッケージ ソフトウェアで新しいプロジェクト ファイルを作成します。「新しいテーブルとグラフ」のセクションでは、下の"XY"を選択してください。
- 選択: 「サンプル データ」セクションの"空のデータのテーブルを含むスタート"を。
- 「点と線」グラフの種類を選択します。「下位の列をレプリケートまたはエラー値」のセグメントで選択"X"セクションを残すと"Y"セクションを選択: 「並べてサブで (10) 複製値を入力し平均、SD エラー プロット」。[作成] ボタンをクリックします。
注意: 表形式、X 列が 1 つといくつかの Y 列をそれぞれ以前に選ばれた 10 のサブ。
- 書き込みが OD で測定された X 列の時間 (例えば0、30、60、90 分または 0, 1, 1.5, 2 h)。Y 列の文化から得られた値を記述します。
- Y 列データを対数変換指数的な成長フェーズを識別します。「分析」ボタンをクリックして、 「変換」分析を選択、選択 Y を使用して、Y 値 Log(Y) を =。移動「結果のギャラリー」、 「変換」データ テーブルを選択する「分析」ボタンをクリックし、 「線形回帰」の分析を選択します。線形行動に従っていない OD 値を除外します。値を除外するには、データ テーブルでそれらを選択し、 "Ctrl + E"を入力します。
注: 指数関数的成長方程式指数段階とよくフィットするので指数段階に従っていない値を除外することが重要です。 - 「データ テーブル ギャラリー」では、データ テーブルを選択"データ 1"。「分析」ボタンをクリックし、 「XY 分析」間「非線形回帰 (カーブ フィット)」の分析を選択します。
- データを分析し、 "OK"ボタンをクリックを選択します。「フィット」タブで「指数方程式」セクションを選択し、 「急激な成長方程式」を選択 ( Xはセル濃度、 X0がゼロの時は、 μ に細胞濃度は特定の成長率で、 tは時間)。継ぎ手方法として「最小二乗フィット」を使用し補間セクションを選択されていないまま。「OK」ボタンををクリックしてします。
注: 非線形フィット結果] タブは、 「結果のギャラリー」です。ソフトウェア計算して 2 倍の時間 (Dt) と固有成長率 (μ)。ソフトウェアは、[結果] タブに、 Kとしてμを示しています。 - 新しいプロジェクト ファイルを開き、 「新しいテーブルとグラフ」セクション列を選択します。「空のデータのテーブルを開始」オプションを選択し、目的のグラフを選択します。SD は「作成する」ボタン選択平均をプロットするを選択します。
- 「結果のギャラリー」は、非線形フィット結果] タブからμやDtの値をコピーし、列に貼り付けます。最後に、 「分析」ボタンを選択し、さまざまな nutrimental 条件の速度論的パラメーターを比較する「列解析」セクションで目的解析を選択します。
注: 速度論的パラメーター発酵成長コントロール (1%、2%、または 10% ブドウ糖と YP メディア) から入手し、呼吸成長コントロール (YP メディア 2% グリセロールまたはエタノール) は発酵とミトコンドリアの呼吸のしきい値を確立するのに役立ちますそれぞれ。運動の比較栄養状態と呼吸と発酵の成長の物質/化合物からのパラメーターは、呼吸または発酵代謝に影響の可能性を識別するのに役立ちます。
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Representative Results
成長曲線は、予め酵母酵母の呼吸と発酵の表現型の間で区別する使用できます。したがって、我々 は実行バッチ培養酵母(BY4742) の発酵の成長を誘導するために報告されている別グルコース濃度: 1%, 2%, 10% (w/v)9。発酵の表現型を示す文化には、小さな遅れ位相と高い成長率 (図 1) と指数段階があります。乳酸、グリセロール、エタノール、呼吸; を介してのみが代謝する炭素源したがって、それらの炭素源を使用して酵母の培養を行った。主に酸化的リン酸化によるエネルギーを得る文化は、長い遅れ位相と指数段階 (図 2) で成長の遅い速度を示した。
成長曲線の解析は、定性的な情報だけを提供しますしたがって、定量的な情報を入手する速度論的パラメーターを計算することが重要です。我々 は、 Dtとμ指数式 (図 3) を使用して計算されます。我々 はDt ≥11.5 h とμ ≤0.059 で呼吸成長値のしきい値を設定/h。発酵の成長のしきい値はDt ≤6.5 h とμ ≥0.149 で設定された/h (図 3)。
このスクリーニング ツールの有用性を証明するためにで異なった精力的な状態 (図 4) を持つ酵母BY4742 細胞に異なるレスベラ トロール (RSV) 濃度に及ぼす影響を評価するための最初の 3 つの実験を設計振盪フラスコ。出芽酵母BY4742 のエネルギー代謝の異なる硫酸アンモニウム (NH4+) 濃度に及ぼす影響を検出することを目的第 2 実験 (図 5) マイクロ プレートで。最後に、3 番目の 2 つの異なる発酵の成長に影響を与える炭素源の変化を説明するために目的とした酵母菌株 (W303 とビールの発酵に使用される WLP530 産業). (図 6)RSV を用いた実験、細胞のエネルギー状態は、グルコース濃度を変化させることにより変更されました。10% ブドウ糖のテストすべての RSV 濃度は酵母の呼吸発酵段階を変更していないが呼吸相を減少した (発酵から呼吸へシフト中に酵母代謝による指数の段階で生成するエタノール酸化的リン酸化)。Μ値は、テストすべての条件下で出芽酵母2% グリセロール (呼吸のコントロールとして使用する条件) で育てられたときその表現型に反して、発酵挙動を示したことを確認 (図 4 a)。セルは、1% ブドウ糖加のみ通電した、 μ値は 0.1、1、10、および 100 μ M RSV で呼吸発酵の段階で発酵現象は受けませんを確認しました。ただし、発酵から呼吸へシフト中に呼吸相の減少が観測されました。また、1,000 μ M の濃度で RSV は完全に細胞増殖を抑制します。
2 番目の実験では、細胞は考慮の Crabtree の効果を誘発するのに十分な濃度 10% ブドウ糖と補われた酵母。それ故に、異なった濃度 NH4発酵代謝+の補充によって促進される効果を観察できます。Dt値が 0.13、0.66、1.99% NH4+ ☆ 発酵代謝が示唆、これらの濃度が文化の指数段階を拡張成長曲線で観察できます。それにもかかわらず、3.31% mM NH4+でDt値の増加は、この濃度が呼吸発酵代謝を誘導することを示した。この表現型は、指数段階 (図 5) の成長曲線と遅い成長率で拡張遅延相を示した。
3 番目の実験では、2 つの異なる細胞酵母株(W303 と WLP530) ショ糖やDt値に及ぼす炭素源があった場合をテストするガラクトースの異なる濃度で栽培されました。ひずみに依存します。発酵コントロールとして両系統 2% ブドウ糖で栽培し、, Dtを算出した発酵成長のためのしきい値を設定します。発酵、 Dt値、異なる菌株の W303 ひずみ及び ≤6.84 h、WLP530 h ≤3.25 でひずみ。したがって、使用別系統のDtしきい値の検証の必要性を強調することが重要です。また、スクロースを炭素源として用いて、発酵の表現型が 2%、両系統は 10% で観察されました。ただし、ガラクトースが使用されたときひずみ W303 示さなかった発酵動作テスト、WLP530 歪 2% ガラクトースで発酵の表現型を示した濃度のいずれかで。興味深いことに、W303 ひずみテスト両方の炭素源の全ての濃度で育った。しかし、WLP530 ひずみは炭素 (0.01%) の最低濃度の成長を示さなかった。WLP530 はビール業界で使用され公開されます炭素濃度は一般に大いにより高い (図 6) 可能性があります。
全体で、これらの 3 つの実験からのデータは成長曲線と運動パラメーターが出芽酵母における呼吸と発酵成長の予備鑑別に便利証明します。また、これはエネルギー代謝研究のさまざまな側面で使用することができる多目的なツールであることを強調することが重要です。
図 1:出芽酵母成長表現型別グルコース濃度に及ぼす効果。成長曲線は 600 の光学濃度を測定することによって建設された nm 48 時間 30 分毎。酵母細胞が発酵すると、文化は指数段階でタイムラグが短い相と急速な成長率を示した。呼吸発酵の段階は、酸化的リン酸化経路を使用して発酵エタノールが代謝されその後、静止した段階に達する成長減速フェーズ (呼吸相)、続くことができます。データは、平均 ± 標準誤差として表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:出芽酵母成長表現型吸入炭素源の影響.成長曲線は 600 の光学濃度を測定することによって建設された nm 48 h. 細胞の出芽酵母の 30 分毎フェーズで指数長期遅れ位相と遅い成長率を示したし、一般的に発酵から呼吸へシフトを示さなかった。データは、平均 ± 標準誤差として表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 炭素源と出芽酵母の速度論的パラメーターの濃度の影響。種々 の炭素源の下で出芽酵母BY4742 成長の (、) Dt値(b) 濃度の異なる多様な炭素源の下で出芽酵母BY4742 成長のμ値。データは、平均 ± 標準偏差として掲載されています。Dunnett のテストが続く一方通行 ANOVA を使用して統計分析を行った (*p < 2% グルコースと 0.01)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 別の細胞のエネルギー状態にレスベラ トロール添加効果。10% ブドウ糖; を使用して (、) 成長の表現型とμ値(b) 1% グルコースを使用して成長表現型とμ値。成長曲線からのデータは、平均 ± 標準誤差として表示され、 μ値は平均 ± 標準偏差として表示されます。Dunnett のテストが続く一方通行 ANOVA を使用してμ値の統計的解析を行った [*p < 2% グリセロール (RC) と 0.01 対.呼吸コントロール]。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:出芽酵母のエネルギー代謝に硫酸アンモニウム添加効果。成長曲線は、600 の光学濃度を測定することによって建設された nm 48 のため 30 分ごと成長曲線からのデータは、平均 ± 標準誤差として表示され、 μ値は平均 ± 標準偏差として表示されます。Dunnett のテストが続く一方通行 ANOVA を使用してDt値の統計的解析を行った [* p < 2% グリセロール (RC) と 0.01 対.呼吸コントロール]。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: ガラクトースおよびショ糖濃度の発酵代謝に及ぼす酵母。WLP530 産業ひずみの W303 のラボのひずみおよび (b) Dtの値の値は (、) Dt 。データは、平均 ± 標準偏差として掲載されています。Dunnett のテストが続く一方通行 ANOVA を使用してDt値の統計的解析を行った [* p < 0.01対2% グルコース (発酵コントロール)]。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
J. モノー10細菌文化の成長の研究、微生物学の基本的な方法を表明した長い時間が経ちました。分子ツールの出現は、使用状況や技術として成長の研究を遅らせます。多数の相互に関連するプロセスを含む成長の複雑さにもかかわらず、内在するメカニズムを数理モデル11を使用して記述できます。これは最も複雑な分子メカニズム12を明らかにする補完的なツールとして使用できる堅牢なアプローチです。
このメソッドから信頼性の高い結果を得るには、次の重要な手順を考慮する重要です。250 rpm で攪拌は、呼吸器の条件で成長下を使用する場合撹拌速度 (150-180 rpm) 我々 は観察に減るので呼吸成長を発揮低炭素源で良好な成長を達成するために重要です。新鮮な株式を用いたプロトコルを開始することが重要だし、も法で統一された表現型を維持するために重要です。成長速度しきい値は系統によって異なります、試金で使用される条件に従って検証される必要があります。指数方程式は既にプリロードされている; ので、グラフパッド プリズム ソフトウェアを提案します。ただし、その他のソフトウェアは適して、それは指数関数的成長方程式のプログラミングをことができます提供です。マイクロ プレート、接種なし成長媒体の 150 μ L と 3 つの井戸が含まれてお勧め、これはマイクロ プレートのウェルが汚染を受けているかどうかを示すコントロール。
線形スケールで OD データのプロット可能性があることそれ対数増殖期を判断するは難しいを示すために重要です。この問題は誘導期、対数増殖期が明確に表示されるようにログ スケールの OD データをプロットすることによって克服することができます。
このプロトコルは、発酵とミトコンドリア呼吸に特定の効果を確認する必要がありますので、表現型を画面にのみ使用します。お勧めミトコンドリア呼吸の定量化による酸素消費の試金13,14発酵は酢酸、コハク酸、グリセリン、エタノール9 など副産物の蓄積によって決定することができます。.
出芽酵母成長の分子機構を理解するための手段と表現型スクリーニングからテスト方法を.の試金文献の多数の実験的デザインが (例えばプレートの希釈または成長曲線) 定性的パラメーターとしてのみ酵母の成長を使用するにもかかわらず、これらの技術の雇用が貴重な証拠を無視するようにします。たとえば、寒天版微生物人口をカウントまたはシリアル希薄を作るために利用可能な酸素は呼吸条件下で成長測定に合併するもの、限られました。その上、2 つ以上のセルは、互いに接続したまま、1 つだけのコロニーが観察されます。別の制限は、脇の微妙な違いについての事実を残すことの成長の差を強調する視覚的な結果として成長曲線の使用です。したがって、定量的なパラメーター成長情報の翻訳は、出された表現型に関する正確なデータの達成を許可します。それにもかかわらず、成長の数学的表現は複雑な科学的な企業です。ほとんどの研究では、のみ 1 つの環境条件を提供する高次の代数方程式を得る微生物の完全な成長 (遅れ、ログ、および固定相) を調べます。にもかかわらず、比較的単純な線形回帰によってこれらの方程式の係数を計算するとき、固有の生物学的意味15にそれらを割り当てることが困難です。成長段階を区切って成長の分析は数学的に信頼性の高い、簡単です。この例は、一次反応に基づいており、タイムラグが短い相と指数とよく合う指数方程式です。
ミトコンドリアの呼吸または発酵の特定の化合物または環境に及ぼす影響を理解するための一貫した方法が最後に、指数方程式を用いたログ相の勉強です。概念の証拠としては、指数段階の成長の定量化は、RSV が具体的には呼吸器の成長13,14に影響を与えることを示した。ここでは、成長はRIM15削除可能性が酵母9呼吸能力の部分的な抑制によって発酵代謝を向上することを識別する貴重なツールとして役立った。これらのデータを裏付ける、発酵・呼吸代謝の研究では、成長を観察し、シンプルで信頼性の高い方法です。したがって、このアプローチは、ミトコンドリアの呼吸または発酵に及ぼす特定物質をスクリーニングできます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトはサポートされているによって付与 y Consejo ナシオナル デ サイエンス テクノロジー (許可番号 293940)、フンダシオン テルメックス TELCEL (許可番号 162005585) の両方の IKOM。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
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