Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att uppskatta respiratoriska och fermentativa ämnesomsättningen genom att montera den exponentiella tillväxten av Saccharomyces cerevisiae till ekvationen exponentiell tillväxt. Beräkning av de kinetiska parametrarna tillåter för screening av påverkan av ämnen/föreningar på jäsning eller mitokondrie andning.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae celler i den exponentiella fasen upprätthålla sin tillväxt genom att producera ATP genom jäsning och/eller mitokondrie respiration. Jäsbara kolhalten reglerar främst hur jästceller generera ATP; Således driver variationen i jäsbara kolhydrater nivåer energisk metabolismen av S. cerevisiae. Detta dokument beskriver en hög genomströmning metod baserad på exponentiell jäst tillväxt att uppskatta effekterna av koncentrationen förändringar och naturen av kol källan på andningsorganen och fermentativa metabolism. Tillväxten av S. cerevisiae är mätt i en mikroplattan eller skakas koniska kolven genom bestämning av den optiska densiteten (OD) på 600 nm. Sedan byggs en tillväxtkurva genom plotting OD kontra tid, vilket gör att identifiering och val av den exponentiella fasen, och är utrustad med exponentiell ekvation att få kinetiska parametrar. Låg specifik tillväxt med högre fördubbling gånger representerar vanligtvis en respiratorisk tillväxt. Däremot indikerar högre specifik tillväxt med lägre fördubbling gånger fermentativa tillväxt. Tröskelvärden för fördubbling tid och tillväxthastighet är beräknat med välkända luftvägs- eller fermentativa villkor, såsom icke-jäsbara kolkällor eller högre koncentrationer av jäsbara sockerarter. Detta erhålls för varje specifik stam. Slutligen, de beräknade kinetiska parametrarna jämförs med tröskelvärdena att fastställa huruvida jästen visar fermentativa eller respiratorisk tillväxt. Fördelen med denna metod är dess relativa enkelhet för att förstå effekterna av en substans/förening på fermentativa eller respiratorisk metabolism. Det är viktigt att betona att tillväxt är en invecklad och komplicerad biologisk process. preliminära data från denna metod måste därför styrkas genom kvantifiering av syreförbrukning och ackumulering av jäsning biprodukter. Därmed, kan denna teknik användas som en preliminär genomgång av föreningar/ämnen som kan störa eller förbättra fermentativa eller respiratorisk metabolism.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae tillväxt har fungerat som ett värdefullt verktyg att identifiera dussintals fysiologiska och molekylära mekanismer. Tillväxt mäts primärt av tre metoder: seriespädningar för spot test, kolonibildande enhet räknar och tillväxtkurvor. Dessa tekniker kan användas ensamt eller i kombination med en mängd olika substrat, miljöförhållanden, mutanter och kemikalier för att undersöka specifika reaktioner eller fenotyper.
Mitokondriell andning är en biologisk process där tillväxt kinetik har tillämpats framgångsrikt för att upptäcka okända mekanismer. I detta fall komplettering tillväxt medier med icke-jäsbara kol källor såsom glycerol, laktat eller etanol (som metaboliseras uteslutande av mitokondriell respiration), som den enda källan för kol och energi tillåter för att utvärdera den respiratoriska tillväxt, vilket är viktigt att upptäcka störningar i oxidativ fosforylering aktivitet1. Däremot, är det komplicerat att använda tillväxt kinetiska modeller som en metod för att dechiffrera mekanismerna bakom jäsning.
Studien av jäsning och mitokondrie respiration är viktigt att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom vissa fenotyper av Crabtree och Warburg effekter2,3. Effekten Crabtree kännetecknas av en ökning av glycolytic flux, förtryck av mitokondriell andning, och inrättandet av jäsning som den primära vägen att generera ATP i närvaro av höga koncentrationer av jäsbara kolhydrater (> 0,8 mM)4,5. Warburg effekten är metaboliskt analoga Crabtree resonemang, med skillnaden att i däggdjursceller, den viktigaste produkten av jäsning är laktat6. Faktiskt, Warburg effekten ställs ut av en mängd olika cancerceller, utlöser glukosupptag och konsumtion även i närvaro av syre7. Därmed, har studera den molekylära basen för växeln från andning att jäsning i Crabtree effekt både biotekniska återverkningar (för etanolproduktion) och potentiella effekter i cancerforskning.
S. cerevisiae tillväxt kan vara ett lämpligt verktyg att studera Crabtree och Warburg effekterna. Denna idé är baserad på det faktum att den jäst exponentiella fasen, de centrala vägar som används för att producera ATP är mitokondriell respiration och jäsning, som är nödvändiga för att upprätthålla tillväxten. Till exempel är tillväxten av S. cerevisiae intimt förknippad med funktionen av ATP-genererande vägar. I S. cerevisiae, mitokondriell respiration producerar cirka 18 ATP molekyler per glukos molekyl, medan jäsning genererar endast 2 ATP molekyler, förväntas därav att tillväxttakten har snäva länkar med metaboliska vägar producera ATP8. I detta avseende när jäsningen är den främsta vägen att generera ATP, kompenserar jästen låg ATP produktionen genom att öka andelen glukosupptag. Tvärtom, är glukos förbrukning av jästceller som använder mitokondriell andning som ATP huvudkällan låg. Detta indikerar att det är viktigt för jästen att sense kolhydrat tillgänglighet innan man kan avgöra hur ATP kommer att genereras. Därför glukos tillgänglighet spelar en viktig roll i övergången mellan jäsning och mitokondrie respiration i S. cerevisiae. I närvaro av stora mängder glukos föredrar jästen jäsning som den centrala vägen att generera ATP. Intressant, när jästen jäsa, upprätthålls specifika tillväxttakten vid högsta. Däremot, under låga nivåer av glukos producerar S. cerevisiae ATP med hjälp av mitokondriell respiration, upprätthålla lägre tillväxttakt. Därmed, variation i koncentrationen av glukos och användning av andra kolkällor framkalla förändringar i jästens preferens mellan fermentativa och respiratoriska tillväxt. Genom att beakta detta faktum med ekvationen exponentiell tillväxt, kan man få biologiska innebörden av kinetiska parametrar såsom fördubbling tid (Dt) och tillväxthastighet (µ). Till exempel hittades lägre µ värden när jästen använder mitokondriell andning som den primära vägen. Tvärtom, under förhållanden som gynnar jäsningen, hittades högre µ värden. Denna metod kan användas för att mäta de sannolika mekanismerna av kemikalier som påverkar jäsning och mitokondrie respiration i S. cerevisiae.
Syftet med denna uppsats är att föreslå en metod baserad på tillväxt kinetik för screening effekterna av en viss substans/förening på mitokondriell andning eller jäsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kultur Media och inokulum förberedelse
- Bereda 100 mL 2% jäst extrakt-pepton-dextros (YPD) flytande medium (lägga 1 g jäst extrakt, kaseinpepton, 2 g och 2 g glukos till 100 mL destillerat vatten). Fördela 3 mL av media i 15 mL steriliserbar koniska rör. Autoklav media under 15 minuter vid 121 ° C och 1,5 psi.
Obs: Media kan förvaras i upp till en månad vid 4 – 8 ° C. - Inokulera ett koniskt rör fyllda med 3 mL cool steril 2% YPD buljong med 250 μL av S. cerevisiae celler bevaras i glycerol vid-20 ° C. Inkubera över natten i orbitalskak vid 30 ° C med agitation vid 200 rpm.
- Streak en petriskål (60 x 15 mm2) fylld med steril 2% YPD agar (Lägg 10 g jäst extrakt, 20 g kaseinpepton, 20 g glukos, och 20 g av bakteriologisk agar till 1 000 mL destillerat vatten) med celler odlas i koniska röret med hjälp av en steril ögla. Inkubera petriskål vid 30 ° C tills de isolera kolonierna Visa tillväxt.
- Förbereda det inför inokulatet genom att vaccinera en enda isolerad koloni i ett koniskt rör fyllda med 10 mL cool steril 2% YPD buljong och inkubera det över natten vid 30 ° C med kontinuerlig agitation vid 200 rpm.
2. kultur Media och tillväxtkurvorna i mikroplattan
- Förbereda 10 mL 1% YPD buljong (Lägg 0,1 g jäst extrakt, 0,2 g av pepton, och 0,1 g glukos till 10 mL destillerat vatten), 10 mL 2% YPD buljong (Lägg 0,1 g jäst extrakt, 0,2 g av pepton, och 0.2 g glukos till 10 mL destillerat vatten) , och 10 mL 10% YPD buljong (Lägg 0,1 g jäst extrakt, 0,2 g av pepton, och 1 g glukos till 10 mL destillerat vatten). Autoklav dessa wspomagaczy under 15 minuter vid 121 ° C och 1,5 psi.
Obs: Kultur media fungerar som en kontroll av fermentativa tillväxt. - Förbereda 10 mL 2% jäst extrakt-pepton-etanol (YP) buljong och 10 mL 2% jäst extrakt-pepton-glycerol (YPG) buljong. För 2% YP: Lägg 0,1 g jäst extrakt, 0,2 g av pepton, och 0,2 mL etanol till 10 mL destillerat vatten. För 2% YPG: Lägg 0,1 g jäst extrakt, 0,2 g av pepton, och 0,2 mL glycerol till 10 mL destillerat vatten. Autoklav dessa wspomagaczy under 15 minuter vid 121 ° C och 1,5 psi.
Obs: Glycerol och etanol är icke-jäsbara kolkällor som metaboliseras uteslutande av mitokondriell respiration. Av denna anledning används de som en respiratorisk tillväxt kontroller. I detta steg, kan typ och koncentration av kolkälla i kultur media ändras för att testa effekterna på tillväxten fenotyp med jäst extrakt-pepton (YP) buljong (10 g jästextrakt och 20 g kaseinpepton i 1 000 mL destillerat vatten) som bas. För att testa effekterna av andra näringsämnen förutom kol, kompletteras syntetiska komplett (SC) medium enligt syftet med experimentet. Basen för SC medium är 1,8 g jäst kväve bas utan aminosyror, 5 g ammoniumsulfat [(NH4)2SO4], 1.4 g av natriumglutamat fosfat (NaH2PO4), och 2 g av avhopp blanda i 1 000 mL destillerat vatten. Komplettera media med en kolkälla och kväveöverskott källa behövs koncentrationer. - Lägg till 145 μL av lämpliga Odlingsmedier för experimentell design till varje brunn av en steril mikroplattan (10 x 10-brunn) med lock och Inokulera dem med 5 μL av den före inokulatet.
Obs: Om syftet är att skärmen påverkan av ämnen/föreningar på energisk metabolismen av jäst, den ämne/föreningen ska läggas under detta steg. Någon typ av mikrotiterplattor med lock bör också vara användbar. - Inkubera flera plattan i en microplate reader vid 30 ° C med konstant agitation vid 200 rpm för 48 h. mått den optiska densiteten (OD) på 600 nm var 30 eller 60 min.
Obs: Om mikroplattan läsaren inte har alternativet att ruva mikroplattan, det kan inkuberas i orbitalskak på samma förhållanden mellan varje mätning av OD.
3. tillväxtkurvor i skakas koniska kolvar
- Lägga till 4,8 mL av den lämpliga odlingsmedier 20 mL koniska kolvar och autoklav. Inokulera varje kolv med 200 μL före inokulum kultur på OD600nm ~ 2 i sval, steril 2% YPD buljong. Inkubera dem vid 30 ° C med konstant agitation vid 250 rpm för 24 h.
Obs: Om inkubationstiden är högre än 24 h, lägga till 12 mL av den lämpliga odlingsmedier 50 mL koniska kolvar och autoklav. Inokulera dem med 500 μL av den före inokulatet. Det är också viktigt att beakta fermentativa tillväxt kontroller (YP media med 1%, 2% eller 10% glukos) och respiratoriska tillväxt kontroller (YP media med 2% glycerol eller etanol). - Ta 100 μL av skakas mottagarkärlet kultur och späd det i 900 μl destillerat vatten i en 1 mL spektrofotometer kyvetten och blanda försiktigt genom pipettering. Mäta OD på 600 nm med en spektrofotometer varje 2 h. För att få den riktiga OD, multiplicera resultatet med tio.
4. databearbetning och kinetiska parametrar beräkning
-
Skapa en ny projektfil i statistikpaketet programvaran. I avsnittet ”ny tabell och Graf”, Välj alternativet ”XY” .
- Välj alternativet: ”starta med en tom tabell” i avsnittet ”exempeldata” .
- Välj vilken ”punkter och anslutande linje” graph. Lämna avsnittet ”X” omarkerad i segmentet för ”Subcolumns för replikat eller felvärden” och i ”Y” avsnittet välja alternativet: ”Ange (10) replikerar värden i sida vid sida subcolumns och rita medelvärde och fel SD”. Klicka på knappen Skapa.
Obs: Tabellformatet har en X-kolumn och flera Y kolumner, alla med de 10 subcolumns valt tidigare.
- Skriv tiden som OD mätningar togs i kolumnen X (t.ex. 0, 30, 60, 90 min eller 0, 1, 1.5, 2 h). Skriva de OD-värden som erhålls från kulturerna i kolumnerna Y.
- Identifiera exponentiella tillväxtfasen omvandla Y kolumndata till logaritmer. Klicka på knappen ”analysera” , välja ”Transform” analys, Välj Y-värden med hjälp av Y = Log(Y). Gå till ”Galleri av resultat”, Välj ”Transform” datatabellen, klicka på knappen ”analysera” och välja ”linjära regressionsanalysen”. Utesluta OD-värdena som inte följer ett linjärt beteende. För att utesluta värden, markera dem i datatabellen och skriv ”Ctrl + E”.
Obs: Det är viktigt att utesluta värden som inte följer den exponentiella fasen eftersom ekvationen exponentiell tillväxt passar väl med den exponentiella fasen. - Välj tabellen i ”datatabeller gallery”, ”Data 1”. Klicka på knappen ”analysera” och välja ”Nonlinear (curve fit)” regressionsanalys bland de ”XY analyserna”.
- Välj datauppsättningarna för att analysera och klicka på knappen ”OK” . Välj avsnittet ”exponentiell ekvation” fliken ”Fit” och välj ”exponentiell ekvation” (där X är cellkoncentrationen, X0 är cellkoncentrationen på noll tid, μ är tillväxthastighet och t är tiden). Använda den ”minsta kvadrat fit” som en passande metod och lämna omarkerade avsnittet interpolate. Klicka på knappen ”OK” .
Obs: Fliken med ickelinjära fit resultaten är i ”Galleri av resultat”. Beräknar programvaran fördubbling tid (Dt) och specifika tillväxttakt (μ). Programvaran visar μ som K i fliken resultat. - Öppnar en ny projektfil och välj kolumn valet i avsnittet ”ny tabell och Graf” . Välj alternativet ”starta med en tom tabell” och välj önskad grafen. Välja att rita medelvärdet med SD. Välj knappen ”skapa” .
- Kopiera μ eller Dt värden från fliken ickelinjära fit resultat som i ”Galleri av resultat” och klistra in dem i en kolumn. Slutligen väljer du knappen ”analysera” och välja önskad analys i avsnittet ”kolumn analyser” att jämföra de kinetiska parametrarna av olika nutrimental villkor.
Obs: De kinetiska parametrarna erhålls från fermentativa tillväxt kontrollerna (YP media med 1%, 2% eller 10% glukos) och respiratoriska tillväxt kontroller (YP media med 2% glycerol eller etanol) hjälper upprätta tröskeln till fermentativa och mitokondrie respiration, respektive. Jämföra den kinetiska parametrar från näringsmässiga skick och ämnet/förening analyseras med andnings- och fermentativa tillväxten att identifiera möjliga effekt på luftvägs- eller fermentativa metabolism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillväxtkurvorna kan användas för att preliminärt diskriminera respiratoriska och fermentativa fenotyper i S. cerevisiae jästen. Därför vi utfört batch kulturer av S. cerevisiae (BY4742) med olika glukos koncentrationer som har rapporterats inducera fermentativa tillväxt: 1%, 2% och 10% (w/v)9. Kulturer visar en fermentativa fenotyp har en liten fördröjning och en exponentiell fas med en hög tillväxttakt (figur 1). Etanol, glycerol och laktat är de kolkällor som kan vara metaboliseras endast genom andning; således utfört vi kulturer av jäst använder dessa kolkällor. Kulturer som får energi främst genom oxidativ fosforylering visade en längre fördröjning fas och långsam ökningstakt under den exponentiella fasen (figur 2).
Analys av tillväxtkurvorna ger endast kvalitativ information; Därför är det viktigt att beräkna kinetiska parametrar för kvantitativ information. Vi beräknat de Dt och μ med hjälp av exponentiell ekvation (figur 3). Vi ange ett tröskelvärde för respiratoriska tillväxt värden på Dt ≥11.5 h och μ ≤0.059 / h. Tröskeln för fermentativa tillväxt var inställd på Dt ≤6.5 h och μ ≥0.149 / h (figur 3).
För att bevisa nyttan av denna screeningmetod utformat vi tre experiment, med först för att utvärdera effekterna av olika resveratrol (RSV) koncentrationer på S. cerevisiae BY4742 celler med olika energisk status (figur 4) i skakad kolvar. Det andra experimentet syftade till att identifiera effekterna av olika ammoniumsulfat (NH4+) koncentrationer på energiomsättningen av S. cerevisiae BY4742 (figur 5) i en mikroplattan. Slutligen tredje syftar till att illustrera hur förändringar i kolkälla påverka fermentativa tillväxt i två olika S. cerevisiae stammar (W303 och den industriella WLP530 används för öl jäsning) (figur 6),. I experimentet med RSV, ändrades cell energisk status genom att variera glukos koncentration. På 10% glukos, alla RSV koncentrationer testats inte ändrade den respiro-fermentativa fasen av jäst men minska den respiratoriska fas (under det diauxic skiftet, S. cerevisiae metaboliseras etanolen produceras under den exponentiella fasen av oxidativ fosforylering). Μ värdena bekräftade att under alla förhållanden testade, S. cerevisiae visade fermentativa beteende, tvärtemot dess fenotyp när den odlas i 2% glycerol (tillstånd används som en respiratorisk kontroll) (figur 4a). När celler var strömförande med 1% glukos bara, bekräftade μ värdena att på 0,1, 1, 10 och 100 µM RSV, fermentativa beteende i fasen respiro-fermentativa inte påverkades. Emellertid observerades en minskning av de respiratoriska fas under det diauxic skiftet. Dessutom med en koncentration på 1000 µM hämmad RSV helt celltillväxt.
I andra försöket, celler kompletterades med 10% glukos, en koncentration anses vara tillräckligt att inducera Crabtree effekten i S. cerevisiae. Vi därför kunde observera effekten främjas av komplettering av olika koncentrationer av NH4+ i fermentativa metabolism. Dt värden föreslog att 0,13 0,66 och 1,99% NH4+ gunst fermentativa metabolism, och det kan observeras i tillväxtkurvorna att dessa koncentrationer extended kulturens exponentiell fas. Dock på 3,31% mM NH4+visade en ökning i Dt -värdet att denna koncentration inducerar en respiro-fermentativa ämnesomsättning. Denna fenotyp visade en längre fördröjning fas i tillväxtkurvor och långsammare tillväxttakt i den exponentiella fasen (figur 5).
I tredje försöket, cellerna i två olika S. cerevisiae stammar (W303 och WLP530) odlades i olika koncentrationer av sackaros eller galaktos att testa om effekterna av kolkälla på Dt -värden var stam-beroende. Som en fermentativa kontroll, båda stammar odlades i 2% glukos och Dt -värdena beräknades för att fastställa ett tröskelvärde för fermentativa tillväxt. Den fermentativa Dt -värden för stammarna var annorlunda, med ≤3.25 h för W303 stam och ≤6.84 h för WLP530 stam. Därför är det viktigt att framhålla nödvändigheten för att validera Dt tröskeln för de olika stammar som används. Dessutom när sackaros användes som kolkälla, observerades en fermentativa fenotyp vid 2% och 10% i båda stammar. Men när galaktos användes, visade stam W303 inte fermentativa beteende i någon av de koncentrationer som testas, medan WLP530 stammen visade en fermentativa fenotyp vid 2% galaktos. Intressant, växte den W303 stammen i alla koncentrationer av både kolkällor som testas. WLP530 stammen visade dock inte tillväxt på den lägsta koncentrationen av kol används (0,01%). Detta kan bero på WLP530 används i öl branschen och de kol koncentrationer som det utsätts är generellt mycket högre (figur 6).
Data från dessa tre experiment bevisa sammantaget att tillväxtkurvor och kinetiska parametrar är användbara för den preliminära diskrimineringen mellan luftvägarna och fermentativa tillväxt i S. cerevisiae. Dessutom är det viktigt att framhålla att detta är ett mångsidigt verktyg som kan användas i olika aspekter av energi metabolism forskning.
Figur 1: Effekten av olika glukos koncentrationer på S. cerevisiae tillväxt fenotyp. Tillväxtkurvorna konstruerades genom att mäta optisk densitet vid 600 nm varje 30 min för 48 h. När S. cerevisiae celler jäsa, kulturer visade en kort fördröjning fas och snabb tillväxttakt under den exponentiella fasen. Den respiro-fermentativa fasen kunde följas av en retardation tillväxtfas respiratoriska fas, där den etanol som framställs genom jäsning metaboliseras med hjälp av oxidativ fosforylering vägen, då den stationära fasen är nådd. Data presenteras som medelvärde ± medelfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Effekt av respirabel kolkällor på S. cerevisiae tillväxt fenotyp. Tillväxtkurvorna konstruerades genom att mäta optisk densitet vid 600 nm varje 30 min för 48 h. celler av S. cerevisiae visade en långvarig eftersläpning fas och långsam tillväxttakt under den exponentiella fasen och allmänt inte visade en diauxic förskjutning. Data presenteras som medelvärde ± medelfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Effekt av kolkälla och dess koncentration på S. cerevisiae kinetiska parametrar. (en) Dt värden av S. cerevisiae BY4742 tillväxt under olika kolkällor; (b) μ värden för S. cerevisiae BY4742 tillväxt under olika koncentrationer av olika kolkällor. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelsen. Statistiska analyser utfördes med en envägs ANOVA följt av en Dunnetts test (*p < 0,01 vs. 2% glukos). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: effekten av resveratrol tillskott på annan cell energi statusar. (en) tillväxt fenotyp och μ värden med 10% glukos; (b) tillväxt fenotyp och μ värden med 1% glukos. Data från tillväxtkurvor presenteras som medelvärde ± medelfel och μ värden presenteras som medelvärde ± standardavvikelsen. Statistiska analyser för μ värden utfördes med en envägs ANOVA följt av en Dunnetts test [*p < 0,01 vs. respiratorisk kontroll med 2% glycerol (RC)]. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Effekten av ammoniumsulfat tillskott på S. cerevisiae energiomsättning. Tillväxtkurvorna konstruerades genom att mäta optisk densitet vid 600 nm varje 30 min för 48 h. Data från tillväxtkurvor presenteras som medelvärde ± medelfel, och μ värden presenteras som medelvärde ± standardavvikelsen. Statistiska analyser för Dt värden utfördes med en envägs ANOVA följt av en Dunnetts test [* p < 0,01 vs. respiratorisk kontroll med 2% glycerol (RC)]. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: effekten av galaktos och sackaros koncentration i fermentativa metabolismen av Saccharomyces cerevisiae. (en) Dt värden för W303 lab stam och (b) Dt -värden för den WLP530 industriella stammen. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelsen. Statistiska analyser för Dt värden utfördes med en envägs ANOVA följt av en Dunnetts test [* p < 0,01 vs. 2% glukos (fermentativa kontroll)]. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lång tid har gått sedan J. Monod10 uttryckt att studiet av tillväxten av bakteriekulturer är den grundläggande metoden för mikrobiologi. Tillkomsten av de molekylära verktyg förseningar-användning och studie av tillväxten som en teknik. Trots komplexiteten i tillväxt vilket innebär många inbördes relaterade processer, kan dess underliggande mekanismer beskrivas med hjälp av matematiska modeller11. Detta är en robust metod som kan användas som ett kompletterande verktyg för att belysa de mest intrikata molekylära mekanismer12.
För att få tillförlitliga resultat från denna metod, är det viktigt att överväga följande kritiska steg. Agitation vid 250 rpm är avgörande för att uppnå god tillväxt under koldioxidsnåla källor som utöva respiratoriska tillväxt, eftersom när du använder lägre agitation hastigheter (150 – 180 rpm) vi observerat minskad tillväxt i luftvägsbesvär. Det är viktigt att inleda protokollet anställa en fräsch lager, och det är också viktigt att upprätthålla en enhetlig fenotyp i analyserna. Tillväxt kinetik tröskelvärden variera bland stammar och måste valideras enligt villkoret att användas i analyserna. Programvaran GraphPad Prism föreslås eftersom ekvationen exponentiell tillväxt är redan förinläst; men är någon annan programvara lämplig, förutsatt att den tillåter programmering av ekvationen exponentiell tillväxt. I mikroplattan, det rekommenderas att inkludera tre brunnar med 150 μl av tillväxtmassmedia utan inokulum — detta är en kontroll som visar om mikroplattan brunnarna har lidit kontaminering.
Det är viktigt att ange att konspirera OD data på en linjär skala kan göra det svårt att avgöra den logaritmiska tillväxtfasen. Detta problem kan övervinnas genom att plotta OD data i en log-skala så att lag och logaritmisk tillväxtfas syns tydligt.
Detta protokoll används endast till skärmen en fenotyp, så de specifika effekterna på jäsning och mitokondrie respiration måste bekräftas. Vi rekommenderar kvantifiering av mitokondriell respiration av syre förbrukning analyser13,14, medan jäsning kan bestämmas genom ansamling av biprodukter såsom acetat, succinat, glycerol och etanol9 .
S. cerevisiae tillväxt har fungerat som ett medel för att förstå molekylära mekanismer och fenotyper, med metoder från screening test analyser. Trots talrika experimentella designer i litteraturen använder jäst tillväxt endast som en kvalitativ parameter (t.ex. plåt utspädningar eller tillväxtkurvorna), så anställningen av dessa tekniker försummar värdefulla bevis. Till exempel är syre tillgängligt i agarplattor används för räkna mikrobiella populationen eller följetong-utspädningar begränsad, komplicerande tillväxt mätning under luftvägsbesvär. När två eller fler celler förbli kopplade till varandra, observeras dessutom endast en koloni. En annan begränsning är användningen av tillväxtkurvor som ett visuella resultat att belysa skillnader i tillväxt, vilket kan utelämna fakta om subtila skillnader. Översättning av tillväxt information till kvantitativa parametrar tillåter därför uppnåendet av exakta uppgifter om den utövas fenotypen. En matematisk representation av tillväxt är dock ett komplicerade vetenskapliga företag. De flesta studier undersöka full tillväxt (eftersläpning, logg och stationära faser) av de mikroorganismer, att erhålla hög ordningens polynomekvationer som bara tjänar en miljö-villkorar. Trots den relativa enkelheten vid beräkning av koefficienter av dessa ekvationer av linjär regression, är det svårt att tilldela dem till en inneboende biologiska menande15. Analysen av tillväxt genom att separera tillväxtfaser är matematiskt pålitlig och uppriktig. Ett exempel på detta är ekvationen exponentiell tillväxt som bygger på första ordningens kinetik och passar bra med en kort fördröjning och exponentiell fas.
Slutligen är studerar fasen loggen med hjälp av exponentiell ekvation en konsekvent metod för att förstå inverkan av mitokondriell andning eller jäsning på en specifik förening eller miljön. Som ett proof of concept visat kvantifiering av tillväxt i den exponentiella fasen att RSV specifikt påverkar andningsorganen tillväxt13,14. Här serveras tillväxt som ett värdefullt verktyg för att identifiera att RIM15 radering sannolikt förbättrar fermentativa metabolism genom partiell hämning av respiration kapaciteten i S. cerevisiae9. Dessa uppgifter bekräftar att observera tillväxt möjliggör studiet av fermentativa och respiratoriska ämnesomsättning och är en enkel och pålitlig metod. Därför, detta tillvägagångssätt möjliggör screening effekterna av ett visst ämne på mitokondriell andning eller jäsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Projektet stöddes av bidrag av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (licensnummer 293940) och Fundación TELMEX-TELCEL (licensnummer 162005585), både till IKOM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction? Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
