Summary
Herpesvirus van kalkoenen (HVT) wordt veel gebruikt als een vector-platform voor de generatie van recombinante vaccins tegen een aantal aviaire ziekten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige en snelle aanpak voor de generatie van recombinante HVT-vectored vaccins met behulp van een geïntegreerde NHEJ-CRISPR/Cas9 en de Cre-Lox systeem.
Abstract
Herpesvirus van kalkoenen (HVT) is een ideale virale vector voor de generatie van recombinante vaccins tegen een aantal aviaire ziekten, zoals vogelgriep (AI), Newcastle disease (ND) en besmettelijke bursal ziekten (IBD), met behulp van bacteriële kunstmatig chromosoom) BAC) mutagenese of conventionele recombinatie methoden. De geclusterde regelmatig interspaced palindromische herhaalt (CRISPR) / Cas9 systeem is met succes gebruikt in veel instellingen voor het bewerken van het gen, met inbegrip van de manipulatie van verschillende grote DNA-virus genomen. Wij hebben een snelle en efficiënte CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerken pijpleiding voor het genereren van recombinant HVT ontwikkeld. Het maximaliseren van het mogelijke gebruik van deze methode, presenteren wij hier gedetailleerde informatie over de methodologie van het genereren van recombinante HVT uiten de VP2 proteïne van IBDV. De VP2 expressie cassette wordt ingevoegd in de HVT genoom via een NHEJ (nonhomologous einde-lid worden)-afhankelijke reparatie traject. Een groene fluorescentie cassette voor de expressie van de proteïne (GFP) eerst aan de invoegen voor eenvoudige visualisatie is gekoppeld en vervolgens verwijderd via de Cre-LoxP systeem. Deze aanpak biedt een efficiënte manier om andere virale antigenen in het genoom van de HVT voor de snelle ontwikkeling van recombinante vaccins.
Introduction
Marek van is (MD) een ziekte van de proliferatieve van kippen geïnduceerd door serotype 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]) van het geslacht Mardivirus uit de onderfamilie van Alphaherpesvirinae. Mardivirus bevat ook twee nonpathogenic serotypen: serotype 2 (GaHV-3) en serotype 3 (MeHV-1, historisch HVT genoemd) die worden gebruikt als vaccins tegen MD. Levend HVT vaccin (FC-126-stam) zijn de eerste generatie van MD vaccin gebruikt in de vroege jaren 1970 en nog steeds wordt gebruikt algemeen in tweewaardige en polyvalente vaccin formuleringen te bieden een verbeterde bescherming tegen MD. HVT is het ook op grote schaal gebruikt als een vaccin vector voor het opwekken van de bescherming tegen een aantal aviaire ziekten als gevolg van zijn veelzijdigheid en veiligheid voor zowel in ovo en subcutane broederij beheer en de mogelijkheid te bieden een levenslange immuniteit. De strategie voor het genereren van recombinante vaccins van de HVT is gebaseerd op een conventionele homologe recombinatie bij virus-geïnfecteerde cellen, overlappende cosmide ANI of BAC mutagenese2. Deze methoden zijn echter over het algemeen tijdrovend en arbeidsintensief, waarvoor de bouw van overdracht vectoren, het onderhoud van het virale genoom bij Escherichia coli, plaque zuivering en de verwijdering van de BAC sequentie en selectie markering van de bewerkte virussen3,4.
CRISPR/geassocieerd (Cas9) is het meest populaire gen bewerkgereedschap in de afgelopen jaren als gevolg van zijn veelzijdigheid en specificiteit. De CRISPR/Cas9-systeem is met succes gebruikt in de efficiënte productie van genetisch gemodificeerde cellen en diermodellen5,6,7,8,9,10, als evenals in de manipulatie van verschillende grote DNA-virus genoom11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Na de rapportage van een eenvoudige en efficiënte methode met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem voor het bewerken van de HVT genoom21, ontwikkelde we een pijpleiding voor de snelle en efficiënte generatie recombinant HVT22.
Oog op de uitbreiding van de mogelijke toepassing van deze methode, beschrijven we de gedetailleerde methodologie voor de generatie van recombinant vaccin van de HVT die het gen uitdrukt VP2 van IBDV op de UL45/46 locus in dit verslag. De aanpak combineert NHEJ-CRISPR/Cas9 als u wilt invoegen het VP2 gen gelabeld met verslaggever GFP-gen en een systeem van de Cre-LoxP de GFP expressie cassette later verwijderen. In vergelijking met traditionele recombinatie en BAC recombineering technieken, we laten zien dat NHEJ-CRISPR/Cas9 samen met een systeem van Cre-Lox een snelle en efficiënte aanpak is voor het genereren van recombinante HVT vaccin.
Protocol
1. bereiding van Cas9/gRNA meningsuiting en Donor construeert
-
Bouw van Cas9/gRNA expressie plasmiden
- Het ontwerp van een reeks van de gRNA gericht op intergenic gebied tussen UL45 en UL46 genen van HVT zoals eerder beschreven22. Hiermee lijnt u de gids-RNA doel volgorde tegen het genoom van de HVT uit alle potentiële af-target sequenties in het genoom van de HVT te sluiten. Synthetiseren en kloon van de volgorde van de gRNA gericht op UL45/46 regio en sg-A reeks van gepubliceerde gegevens23 in pX459-V2 zoals eerder beschreven22. Controleer of de volgorde van de gekloonde gRNA door Sanger sequencing met behulp van de U6-Fwd primer24.
-
Bouw van donor plasmide
- Voor het genereren van een plasmide van de donor met de VP2 expressie cassette gelabeld met een verwisselbare GFP verslaggever cassette, het ontwerp van oligos Donor-F en Donor-R met de volgende elementen (Figuur 1A en Figuur 3A): een sg-A de volgorde van de doelgroep aan zowel uiteinden, een site van de PacI geflankeerd door twee reeksen van de LoxP voor de GFP verslaggever cassette klonen en besnijdenis, en twee SfiI sites voor het klonen van het VP2 expressie cassette.
- De volgorde in een pGEM-T-easy vector clone en vervolgens clone de GFP en VP2 gene cassettes in de resulterende vector voor het genereren van de donor plasmide uitgeroepen tot pGEM-sgA-GFP-VP222.
Opmerking: Elke klonen vector kan worden gebruikt voor de bouw van de donor plasmide.
-
Plasmide DNA voorbereiding
- Het bereiden van zowel donor plasmide en Cas9/gRNA expressie plasmide ANI's met behulp van een commerciële DNA-extractie-kit volgens de instructies van de fabrikant.
2. CRISPR/Cas9-gemedieerde Knock-in: transfectie en infectie
- De dag voor transfectie, chick embryo fibroblasten (CEFs) voorbereiden op de transfectie/infectie, met behulp van 10 - dag oud embryo's in M199 medium aangevuld met het foetale runderserum (FBS) 5%, 10% tryptose fosfaat Bouillon, streptomycine-100 U/mL penicilline, en 0,25 µg/mL fungizone. Zaad 1.3 x 106 cellen per putje in elk putje van de plaat van een 6-well in 2.5 mL medium.
Opmerking: CEF cellen kunnen worden gehouden voor 3 d bij 4 ° C. - Transfect CEF cellen (bereid in stap 2.1) met de 0,5 µg van UL45/46-gRNA, sg-A 0,5 µg en 1 µg pGEM-sgA-GFP-VP2 met behulp van een passende transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer de cellen gedurende 12 uur in een incubator (bij 38.5 ° C met 5% CO2).
- 12 h posttransfection van Cas9/gRNA en donor plasmiden, Verdun de HVT virus voorraad met M199 kweekmedium aan 1 x 105 pfu/mL. 130 µL van het verdunde virus in elk putje van transfected cellen toevoegen en stel een putje van untransfected cellen als een negatieve controle met dezelfde hoeveelheid virus. Incubeer de cellen transfected/besmet voor 3 d bij 38.5 ° C met 5% CO2. Uitvoeren van alle procedures met de gezamenlijke gedragscode (JCoPR) goedgekeurd door de financiers.
3. oogsten en zuivering van de HVT recombinante Virus
-
Fluorescentie-geactiveerde cel sorteren
- Bereiden van twee 96-wells-platen, preseeded met 2 x 104 CEF cellen per goed de dag voordat u sorteert.
- Trypsinize transfected/besmet CEFs 3 d postinfection. Het medium van elk putje gecombineerd en spoel de cellaag met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 1 mL 0,05% trypsine-EDTA (0,48 mM) om het trypsinize van de cellen in de incubator 38.5 ° C gedurende ongeveer 5 minuten.
- Resuspendeer en breng de cellen in een tube microcentrifuge 1,5 mL met 50 µL van FBS. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de cellen in 1 mL PBS, met 1% FBS. Tel de getallen van de cel met behulp van een hemocytometer en aanpassen van het aantal cellen tot 1 x 106 cellen/mL.
Opmerking: Cellen kunnen worden gehouden op het ijs gedurende 1-2 uur. - De cellen overbrengen in een polystyreen buis via de zeef GLB sorteren. Sorteren van de afzonderlijke cellen uiten GFP in 96-wells-platen bezaaid met CEFs met behulp van de cel sorter volgens de instructie van de fabrikant. Incubeer de gesorteerde cellen voor 5 d bij 38.5 ° C met 5% CO2.
Opmerking: Één passage van de recombinante virussen kan nodig zijn voordat u sorteert als er teveel afzonderlijke cellen van het GFP-expressie en paar GFP-positieve plaques in de oorspronkelijke bron.
-
Passaging van recombinante virussen
- 6-Wells-platen bezaaid met 1.3 x 106 CEF cellen per goed eergisteren de passage voor te bereiden. 5 d postsorting, Controleer de 96-wells-platen onder een fluorescentie Microscoop. Mark van de putten met een enkele GFP-positieve plaque.
Opmerking: Zie Figuur 2voor een representatieve GFP-positieve plaque . - Trypsinize elke GFP-positieve goed met 50 µL van trypsine-EDTA gedurende 3 minuten, voeg 50 µL cultuurmedium, resuspendeer en overdracht van de cellen in een putje van de plaat van een 6-well met CEFs. Dit is de eerste generatie van recombinant HVT.
- Oogst van de eerste generatie van recombinante virussen 3 d later, bevriezen beneden één flacon van elk in 1 mL medium met 10% foetaal kalfsserum (FCS), 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en 80% kweekmedium te bevriezen en opslaan van de virussen in vloeibare stikstof.
Opmerking: De oogsttijd varieert van 2-4 d afhankelijk van de capaciteit van het bedrag en de verspreiding van het virus. - Verzamelen van 1 x 105 cellen van elke eerste generatie van virussen, centrifugeer ze en verwijder het supernatant. Bewaar de cellen bij-20 ° C voor DNA-extractie.
- 6-Wells-platen bezaaid met 1.3 x 106 CEF cellen per goed eergisteren de passage voor te bereiden. 5 d postsorting, Controleer de 96-wells-platen onder een fluorescentie Microscoop. Mark van de putten met een enkele GFP-positieve plaque.
-
Detectie van genomic invoegen door de Kettingreactie van de polymerase
- Voor de extractie van DNA, ontdooien en resuspendeer de pellet van de cel uit stap 3.2.4 met 50 µL van squishing buffer (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM NaCl, en 200 µg/mL proteïnase K) en lyse van de monsters bij 65 ° C gedurende 30 minuten en , dan, bij 95 ° C gedurende 2 min naar de inactivering van het proteïnase K.
- Een polymerase-kettingreactie (PCR) met 3' junction inleidingen (tabel 1) met behulp van 1 µL van DNA-monster uit te voeren. Voor elk monster, bereiden de volgende 20 µL reactie mix op het ijs: 2 x PCR Master Mix (10 µL), 10 µM upstream primer (0,5 µL), 10 µM downstream primer (0,5 µL) DNA sjabloon (1 µL) en nuclease-gratis water (8 µL). Het programma versterking is: 95 ° C gedurende 2 min; 95 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 40 s voor 35 cycli; 72 ° C gedurende 7 min. belasting 2 µL van de versterking te één putje van 1% agarose gel voor de Elektroforese van het gel producten.
Opmerking: Zie Figuur 2voor een representatief resultaat van de 3' kruising PCR .
4. excisie van het fluorescerende Reporter Gene via de Cre-lox systeem
- Preseeded transfect 2 µg van Cre recombinase expressie plasmide in de 6-well plaat te verwijderen van het GFP-gen uit het recombinante virus met CEF cellen, met behulp van een transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant.
- 12 h posttransfection, ontdooien van een flacon van recombinante virus van vloeibare stikstof, zachtjes resuspendeer 50 µL zaad in elk putje van transfected cellen en een goed ingesteld als de negatieve controle met dezelfde hoeveelheid virus. Incubeer gedurende 3 d op bij 38.5 ° C met 5% CO2.
5. plaque zuivering
-
Fluorescentie-geactiveerde cel sorteren
- Zaad twee 96-wells-platen met 2 x 104 CEF cellen per goed de dag voordat u sorteert.
- Volg de procedures die zijn beschreven in stap 3.1 72 h postinfection (uit stap 4) als voorbereiding op de geïnfecteerde cellen sorteren. De cellen van één nonfluorescence in 96-wells-platen met CEFs agarvoedingsbodem sorteren.
-
Passaging van de recombinante virussen en PCR bevestiging
- Kies 5-10 interne nonfluorescence plaques 5 d, postsorting, trypsinize hen met 50 µL van trypsine-EDTA bij 38.5 ° C gedurende 3 minuten en 50 µL cultuurmedium aan resuspendeer de cellen toevoegen.
Opmerking: Zie Figuur 2B voor een representatieve GFP-negatieve plaque. - Voorbij de helft van de cellen in elk putje van de plaat van een 6-well preseeded met CEFs als de tweede generatie.
- Centrifugeer de resterende cellen van elke kloon bij 200 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 50 µL van squishing buffer voor DNA-extractie.
- Uitvoeren van PCR met 5' junction inleidingen (tabel 1) met 1 µL van DNA sjabloon met dezelfde PCR reactie staat zoals beschreven in stap 3.3.2.
Opmerking: Zie Figuur 2B voor een representatief resultaat van 5' junction PCR. - Op basis van de PCR-resultaten, Kies drie tot vijf positieve klonen van recombinante HVT voor verdere passages en verificatie.
- Kies 5-10 interne nonfluorescence plaques 5 d, postsorting, trypsinize hen met 50 µL van trypsine-EDTA bij 38.5 ° C gedurende 3 minuten en 50 µL cultuurmedium aan resuspendeer de cellen toevoegen.
6. verificatie van de recombinante HVT
-
Indirecte immunofluorescentietest assay
- Infecteren CEFs met de tweede generatie van recombinant die HVT stap 5.2 in de 24-well plaat bezaaid met 2.5 x 105 CEFs eergisteren infectie verkregen. Verwijder de cel kweekmedium 48 h postinfection en voeg 500 µL van 4% paraformaldehyde in PBS de cellen vast te stellen. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 min., verwijderen de fixeer en wassen van de cellaag 3 x met PBS.
Opmerking: De cellen kunnen bij 4 ° C bij deze stap voor enkele weken worden bewaard. - Verwijder de PBS en voeg 500 µL van 0,1% Triton X-100 aan de permeabilize van de cellen gedurende 15 minuten wassen de cel laag 3 x met PBS.
- Blok niet-specifieke binding door toevoeging van de buffer met blokkerend (de 5% van het runderserum in PBS) gedurende 1 uur.
- Verdun het primaire antilichaam anti-VP2 monoklonaal antilichaam HH7 - of HVT-besmette kip serum op 1:200 in de blokkeerbuffer en voeg 200 µL per putje Incubeer bij kamertemperatuur voor 1 h. Wash de cel laag 3 x met PBS.
- Verdun de secundair antilichaam geit-antimuis IgG Alexa 568 of geit anti-kip IgG Alexa 488 op 1:200 in de blokkeerbuffer, voeg 200 µL per putje, Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en wassen van de cellen 3 x met PBS. Controleer de eiwit expressie onder de fluorescentie Microscoop.
Opmerking: Zie Figuur 4 voor een vertegenwoordiger VP2 kleuring resultaat.
- Infecteren CEFs met de tweede generatie van recombinant die HVT stap 5.2 in de 24-well plaat bezaaid met 2.5 x 105 CEFs eergisteren infectie verkregen. Verwijder de cel kweekmedium 48 h postinfection en voeg 500 µL van 4% paraformaldehyde in PBS de cellen vast te stellen. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 min., verwijderen de fixeer en wassen van de cellaag 3 x met PBS.
-
Sequentiebepaling van het VP2 gen
- Versterken van de opeenvolging van DNA verspreid over de UL45 en UL46 intergenic regio met hifi-DNA polymerase en inleidingen UL45-F1 en UL46-R1 (tabel 1) op te sporen het hele inbrengen.
- Voorbereiding van de volgende 50 µL reactie mix: 5 µL van 10 x Pfx reactie Mix, 1.5 µL van 10 µM stroomopwaarts en stroomafwaarts primer mix, 1 µL van 10 mM dNTP mix, 1 µL van 50 mM MgSO4, 1 µL van DNA sjabloon en 0,5 µL van Pfx DNA-polymerase , en voeg water nuclease-gratis tot 50 µL. Het programma versterking is: 95 ° C gedurende 2 min; 95 ° C gedurende 15 s, 55 ° C gedurende 30 s, en 68 ° C gedurende 3 minuten voor 35 cycli. Laad alle van het PCR-product naar 1% agarose gel voor de Elektroforese van het gel.
- Het zuiveren van het PCR-product volgens de instructies van een DNA kit voor de zuivering van de gel. 10 µL van het PCR-product (30 ng/µL) verzenden een sequencing bedrijf om te bevestigen de knock-in van het VP2 gen.
7. stabiliteit van de recombinante Virus
- Zaad 2.6 x 106 CEF cellen in elke kolf T25 de dag vóór de uitbreiding van het virus.
- Ontdooien van ten minste drie positieve klonen uit stap 5.2; Voeg één flacon van cellen/virussen in elke kolf T25. Incubeer bij 38.5 ° C met 5% CO2 totdat een 50% cytopathogeen effect wordt waargenomen.
- Oogsten van de cellen in 2 mL gestolde voedingsbodem; infecteren 50 µL aan een nieuwe T25 maatkolf preseeded met CEF cellen voor de volgende generatie. Passaging houden de recombinante virus voor minstens 15 generaties. Elke generatie van virussen door PCR voor de aanwezigheid van de VP2 volgorde en met behulp van de indirecte immunofluorescentie (IFA) voor VP2 expressie te beoordelen van de stabiliteit van de recombinante virussen van analyseren.
Representative Results
De strategie voor de generatie van de recombinant vaccin HVT is uiteengezet in Figuur 1, waarin hoe de donor plasmide is gebouwd (Figuur 1A) en de procedures voor het genereren van de recombinant HVT (Figuur 1B ). Vijf tot dertig GFP-positieve plaques omgeven door wild-type platen kunnen worden waargenomen in gen kloppen-in putten onder de fluorescentie Microscoop 3 d posttransfection en -infecties. Het gezuiverde virus verkregen nadat eencellige sorteren(Figuur 2)werd geanalyseerd door 3' junction PCR, waaruit een PCR-product van de verwachte grootte (Figuur 2A, onderste paneel blijkt). Na de besnijdenis van het GFP-reporter van Cre recombinase verloren meer dan 50% van de plaques hun GFP-expressie. De gezuiverde plaque na het GFP excisie (Figuur 2B) door eencellige sorteren was verder bevestigd door 5' junction PCR, waarin het recht-en kleinbedrijf PCR product (Figuur 2B, onderste paneel). Figuur 3 toont de resultaten van de sequencing van beide junction PCR producten met verschillende gekleurde elementen. In Figuur 4, werd de eiwituitdrukking bevestigd door IFA met VP2-specifieke monoklonale antistoffen en anti-HVT kip serum. Zoals verwacht, kunnen cellen geïnfecteerd met de ouderlijke HVT alleen worden gekleurd door anti-HVT serum (groen), terwijl de recombinante HVT-geïnfecteerde cellen duidelijk bleek de expressie van VP2 gen (rood).
Figuur 1: strategie voor het genereren van een recombinant vaccin HVT-vectored. (A) dit paneel toont een schematische voorstelling van de klonen strategie voor donor plasmide constructie. De belangrijkste elementen omvatten twee Cas9 doel sites (sgA) voor het vrijgeven van invoegen, een verslaggever GFP cassette geflankeerd door LoxP sequenties voor de besnijdenis van GFP en de VP2 expressie cassette. (B) dit paneel toont een overzicht van een tweestaps gene knock-in strategie. Het fragment invoegen van het GFP en de VP2 expressie cassettes worden uitgebracht door Cas9/sgA decollete en ingevoegd in het genoom van de HVT op UL45/46 loci via NHEJ-CRISPR/Cas9. Het GFP-positieve recombinante virus vervolgens wordt gesorteerd en gezuiverd door eencellige fluorescentie-activated cell sorting (FACS). Vervolgens het GFP-gen verslaggever is weggesneden door Cre recombinase en het recombinante virus is gezuiverd en gekenmerkt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Controle van de recombinante HVT. (A) dit paneel toont een GFP-positieve plaque (HVT-GFP-VP2) gevisualiseerd onder de fluorescentie Microscoop (bovenzijde) en de verificatie van de PCR van HVT-GFP-VP2 met inleidingen VP2-F & UL46-R1 voor de 3'-kruising. ()B) dit paneel toont een plaque (HVT-VP2) na het GFP excisie van HVT-GFP-VP2, gevisualiseerd met behulp van Cre recombinase en PCR verificatie van HVT-VP2 met inleidingen UL45-F1 en VP2-R1 voor de 5'-kruising. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Analyse van de recombinante HVT virus volgnummer. (A) de sequenties van de belangrijkste elementen in verschillende kleuren in dit deelvenster zijn de intergenic regio van HVT tussen UL45/46 met de gRNA doel opeenvolging onderstreept en een pijl toont de breukzijde van de Cas9, de VP2 expressie cassette met het einde reeksen cursief kleine letters, de volgorde van de sg-A target in rood met de pijl de breukzijde van de Cas9, de volgorde van de LoxP site in groen en twee SfiI sites sequenties in blauw weergegeven. (B) dit paneel toont de resultaten van de volgorde van de 5' en 3' kruispunten en een schematische presentatie van HVT-VP2 met belangrijke elementen met bijbehorende kleuren gepresenteerd in sequenties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Karakterisering van de recombinante HVT-VP2. Dit paneel geeft de bevestiging van de succesvolle uitdrukking van VP2 in besmette CEFs door bepaling van de indirecte immunofluorescentie (IFA) met anti-VP2 monoklonaal antilichaam HH7 (rood). HVT infectie wordt bevestigd door IFA met HVT-besmette kip serum (groen). De schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De CRISPR/Cas9-systeem is een waardevol hulpmiddel in het gen bewerken geworden. De traditionele technologieën voor recombinante HVT vector ontwikkeling, zoals homologe recombinatie13 en BAC mutagenese technologie25, sprake meestal van verschillende rondes van vector klonen en selectie, evenals grootschalig onderzoek, die kan verschillende maanden duren. Het protocol beschreven hier met behulp van een NHEJ-CRISPR/Cas9 gebaseerde strategie gecombineerd met de Cre-Lox systeem en eencellige sorteren is meer een handige, efficiënte en snellere aanpak in recombinant vaccin generatie. Met behulp van deze pijpleiding, de recombinante virus kan worden verkregen binnen slechts 1-2 weken24en plaque zuivering stappen kunnen ook worden verminderd tot een scheiding van de single-ronde met behulp van fluorescentie-geactiveerde cel sorteren van17. Het hele proces, van ontwerp en donor bouw van gRNA voor het verkrijgen van het gezuiverde recombinante HVT virus, kan worden bereikt binnen 1 maand. De kritische stappen voor succesvol recombinante HVT generatie omvatten de hoog rendement gRNA-selectie voor het targeten van het virale genoom om ervoor te zorgen efficiënte decollete voor het inbrengen van vreemde gen, de hoge transfectie efficiëntie te maximaliseren de kans voor Cas9 / gRNAs en het virus te ontmoeten in dezelfde cel voor bewerken, en de 12 uur interval tussen de transfectie van plasmiden met de donor- en gRNA, en de virale infectie Cas9 en gRNA te worden uitgedrukt op een redelijk niveau, voordat het virus in de cellen krijgt.
De beperking voor de HVT recombinante generatie is dat de complexiteit van de identificatie van GFP-positieve klonen door junction PCR. De GFP-VP2 cassettes kunnen worden ingevoegd in beide richting. De kruising die PCR hier beschreven is alleen voor de identificatie van het donormateriaal in de richting van de zin. In het geval van het inzetstuk in antisense oriëntatie, PCR met behulp van de primerparen beschreven niet zou werken, en de interne inleidingen voor dit doel kunnen worden verwisseld. Een ander potentieel probleem is dat de donor-constructie kan alleen worden gebruikt voor één gen inbrengen in hetzelfde virus als gevolg van het bestaan van de resterende LoxP volgorde na het GFP-verwijdering door Cre behandeling. Een nieuwe constructie van de donor met een variant van de LoxP volgorde kan in plaats daarvan voor een meerdere invoeging doel worden gebruikt.
NHEJ en HDR (homologie geleide reparatie) zijn de twee wegen om te herstellen van de double-stranded-einden (DSBs), gemaakt door Cas926,27. NHEJ is efficiënter als het komt door de celcyclus28, overwegende dat HDR minder efficiënt is en doet zich alleen voor tijdens S en G2 fasen6,29,30. We benut het efficiënter NHEJ reparatie traject hier om de buitenlandse genen in de doellocatie introduceren. Hoewel de NHEJ herstellen kunnen microdeleties door lid te worden van noncompatible of beschadigde DNA uiteinden door een homologie-onafhankelijke mechanistically flexibel proces31,32 tussen de gekloofd donor volgorde en de genomic DNA, de microdeleties invoeren alleen kan optreden op de sites van de splitsing van sgA, en de cassette buitenlandse gen-expressie wordt niet beïnvloed. Een ander voordeel van deze aanpak is dat NHEJ vrij van de beperking van de homologie arm constructie, waardoor het klonen stap zeer eenvoudig. Dit vraagt een groot potentieel voor de toepassing van NHEJ voor buitenlandse gene inbrengen. De invoering van een universele gRNA doelsite op beide einden der de buitenlandse gene cassette maakt het proces sneller als de donor-sjabloon kan meteen worden opgebouwd zonder de noodzaak voor de selectie van specifieke gRNA. De ruggengraat van de plasmide van de donor met sgA doel sites, sites van LoxP en PacI en SfiI sites kan ook grote schaal worden gedeeld tussen verschillende reporter genen, buitenlandse genexpressie-cassettes en ander virus vectoren, geven deze nieuwe aanpak het voordeel van aanpassing.
Het invoegen van de HVT-herbergen VP2 werd gebruikt om te beschrijven van het protocol in dit manuscript; dezelfde aanpak kan echter worden gebruikt om in te voegen meer virale genen op verschillende genomic locaties van het genoom van de HVT met behulp van de gRNA gericht op de gewenste corresponderende volgorde voor de ontwikkeling van multivalent recombinante vaccins van de HVT vectored. Andere MDV vaccinstammen, zoals de SB-1 en CVI988, andere aviaire infectieziekte, met inbegrip van besmettelijke laryngotracheitis virus en eend enteritis virus, en ook andere aviaire DNA virussen, zoals pokken virussen en adenovirussen, kunnen ook worden gebouwd met behulp van hetzelfde aanpak voor ontwikkeling van een multivalent recombinant vaccin. De ontwikkeling van nieuwe multivalent vectored vaccins met behulp van de CRISPR/Cas9-systeemplatform beschreven hier zal zeer gunstig voor de pluimvee-industrie te beschermen tegen meerdere pluimveeziekten zijn.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Pippa Hawes voor het helpen met de confocal beeldvorming. Dit project werd ondersteund door de biotechnologie en biologische wetenschappen onderzoek Raad (BBSRC) verleent, BBS/E/I/00007034 en BB/L014262/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
| Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
| Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
| HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
| pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
| pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
| PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
| SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
| TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
| Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
| Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
| FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
| Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |
References
- Witter, R. L., Solomon, J. J. Experimental infection of turkeys and chickens with a herpesvirus of turkeys (HVT). Avian Diseases. 16 (1), 34-44 (1972).
- Baigent, S. J., et al. Herpesvirus of turkey reconstituted from bacterial artificial chromosome clones induces protection against Marek's disease. Journal of General Virology. 87, Pt 4 769-776 (2006).
- Messerle, M., Crnkovic, I., Hammerschmidt, W., Ziegler, H., Koszinowski, U. H. Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14759-14763 (1997).
- Zhao, Y., Nair, V. Mutagenesis of the repeat regions of herpesviruses cloned as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. 634, 53-74 (2010).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Research. 24 (1), 122-125 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via. Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. 32 (6), 551-553 (2014).
- Zhang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated chicken Stra8 gene knockout and inhibition of male germ cell differentiation. PLoS One. 12 (2), 0172207 (2017).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathogens. 10 (5), 1004090 (2014).
- Bierle, C. J., Anderholm, K. M., Wang, J. B., McVoy, M. A., Schleiss, M. R. Targeted mutagenesis of guinea pig cytomegalovirus using CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Journal of Virology. 90 (15), 6989-6998 (2016).
- Suenaga, T., Kohyama, M., Hirayasu, K., Arase, H. Engineering large viral DNA genomes using the CRISPR-Cas9 system. Microbiology and Immunology. 58 (9), 513-522 (2014).
- Xu, A., et al. A simple and rapid approach to manipulate pseudorabies virus genome by CRISPR/Cas9 system. Biotechnology Letters. 37 (6), 1265-1272 (2015).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. Journal of Virology. 89 (9), 5176-5179 (2015).
- Yuen, K. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein-Barr virus in human cells. Journal of General Virology. 96, Pt 3 626-636 (2015).
- Liang, X., et al. A CRISPR/Cas9 and Cre/Lox system-based express vaccine development strategy against re-emerging Pseudorabies virus. Scientific Reports. 6, 19176 (2016).
- Zou, Z., et al. Construction of a highly efficient CRISPR/Cas9-mediated duck enteritis virus-based vaccine against H5N1 avian influenza virus and duck Tembusu virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 1478 (2017).
- Peng, Z., et al. Pseudorabies virus can escape from CRISPR-Cas9-mediated inhibition. Virus Research. 223, 197-205 (2016).
- Tang, Y. D., et al. Live attenuated pseudorabies virus developed using the CRISPR/Cas9 system. Virus Research. 225, 33-39 (2016).
- Yao, Y., Bassett, A., Nair, V. Targeted editing of avian herpesvirus vaccine vector using CRISPR/Cas9 nucleases. Journal of Vaccine and Technologies. 1, (2016).
- Tang, N., et al. A simple and rapid approach to develop recombinant avian herpesvirus vectored vaccines using CRISPR/Cas9 system. Vaccine. 36 (5), 716-722 (2018).
- He, X., et al. Knock-in of large reporter genes in human cells via. CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair. Nucleic Acids Research. 44 (9), 85 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Petherbridge, L., et al. Cloning of Gallid herpesvirus 3 (Marek's disease virus serotype-2) genome as infectious bacterial artificial chromosomes for analysis of viral gene functions. Journal of Virological Methods. 158 (1-2), 11-17 (2009).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
