Summary
HERPESVIRUS de dindons et dindes (HVT) est largement utilisé comme une plateforme de vecteur pour la génération de vaccins recombinants contre un certain nombre de maladies aviaires. Cet article décrit une méthode simple et rapide pour la génération de vaccins recombinants HVT-guidé à l’aide d’un NHEJ-CRISPR/Cas9 intégré et système de Cre-Lox.
Abstract
HERPESVIRUS de dindons et dindes (HVT) est un vecteur viral idéal pour la génération de vaccins recombinants contre un certain nombre de maladies aviaires, telles que l’influenza aviaire (Ia), la maladie de Newcastle (ND) et la bursite infectieuse (EIA), à l’aide de chromosomes artificiels bactériens ( BAC) par mutagénèse ou par les méthodes conventionnelles de recombinaison. Le cluster régulièrement entrecoupées de répétitions palindromiques (CRISPR) / Cas9 système a été utilisé avec succès dans de nombreux contextes pour l’édition de gène, y compris la manipulation de plusieurs génomes de gros virus à ADN. Nous avons développé un rapid et efficace CRISPR/Cas9-mediated génome édition pipeline pour générer recombinant HVT. Afin de maximiser l’utilisation potentielle de cette méthode, nous présentons ici des informations détaillées sur la méthodologie de production HVT recombinant exprimant la protéine VP2 de IBDV. La cassette d’expression VP2 est insérée dans le HVT génome via un NHEJ (fin-joining non-homologues)-voie de réparation dépendants. Une cassette d’expression de protéine (GFP) fluorescence verte est d’abord attachée à l’insertion pour faciliter la visualisation et ensuite retiré par la Cre-LoxP système. Cette approche offre un moyen efficace d’introduire d’autres antigènes viraux dans le génome HVT pour le développement rapide des vaccins recombinants.
Introduction
Maladie de Marek (MD) est une maladie lymphoproliférative des poulets induite par le sérotype 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]) du genre Mardivirus dans la sous-famille Alphaherpesvirinae. Mardivirus comprend également deux sérotypes non pathogènes : sérotype 2 (GaHV-3) et le sérotype 3 (MeHV-1, historiquement connu comme HVT) qui sont utilisés comme vaccins contre MD Vaccin HVT vivant (souche FC-126) est la première génération de vaccin de MD utilisé dans les années 1970 et est encore utilisé couramment dans les formulations de vaccin bivalent et polyvalente pour fournir une protection accrue contre les MD HVT est aussi largement utilisé comme un vecteur de vaccin d’induire la protection contre un certain nombre de maladies aviaires en raison de sa polyvalence et de sécurité pour ovo et administration sous-cutanée écloserie tant en capacité de fournir une immunité permanente. La stratégie visant à générer des vaccins recombinants HVT repose sur deux classique recombinaison homologue dans les cellules infectées par le virus, qui se chevauchent cosmide DNAs ou BAC mutagénèse2. Cependant, ces méthodes sont généralement longues et fastidieuses, nécessitant la construction de vecteurs de transfert, le maintien du génome viral dans Escherichia coli, des purifications plaque et la suppression de la séquence de BAC et de la sélection marqueur du virus édité3,4.
CRISPR/associés (Cas9) est le gène plus populaire outil d’édition ces dernières années en raison de sa polyvalence et sa spécificité. Le système CRISPR/Cas9 a été utilisé avec succès dans la génération efficace des cellules génétiquement modifiées et des modèles animaux5,6,7,8,9,10, ainsi que dans la manipulation de plusieurs virus à ADN grands génomes11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Après avoir signalé une méthode simple et efficace, utilisant le système CRISPR/Cas9 pour modifier le génome HVT21, nous avons développé un pipeline pour la génération rapide et efficace de recombinant HVT22.
Afin de prolonger l’application potentielle de cette méthode, nous décrivons la méthodologie détaillée pour la génération de recombinaison vaccin HVT exprimant le gène VP2 de IBDV au locus UL45/46 dans le présent rapport. L’approche combine NHEJ-CRISPR/Cas9 pour insérer le gène VP2 taggé gène rapporteur GFP et un système de Cre-LoxP pour enlever la cassette d’expression de GFP plus tard. Par rapport aux traditionnelle recombinaison et BAC recombineering techniques, nous démontrons que NHEJ-CRISPR/Cas9 ainsi qu’un système de Cre-Lox est une approche rapide et efficace pour produire le vaccin HVT recombinant.
Protocol
1. préparation des Cas9/gRNA Expression et construit des donateurs
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Construction des plasmides d’expression Cas9/gRNA
- Concevoir une séquence gRNA ciblant la région intergénique entre les gènes UL45 et UL46 de HVT comme décrit plus haut22. Aligner la séquence cible de guide-RNA contre le génome HVT pour écarter toute séquence hors cible potentielle dans le génome HVT. Synthétiser et cloner la séquence gRNA ciblant la région UL45/46 et sg-une séquence de données publiées23 dans pX459-V2 comme décrit plus haut22. Vérifier la séquence clonée gRNA par Sanger séquençage à l’aide de l' apprêt de U6-Fwd24.
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Construction du plasmide donneur
- Pour générer un plasmide donneur contenant la cassette d’expression VP2 taggée une cassette amovible de journaliste GFP, concevoir des oligos donneur-F et donateurs-R contenant les éléments suivants (Figure 1A et Figure 3A) : une sg-A séquence cible aux deux extrémités, un site de PacI, flanqué de deux séquences de LoxP pour le clonage de GFP journaliste cassette et l’excision et deux sites de SfiI pour le clonage de la cassette d’expression VP2.
- Clonez la séquence dans un vecteur pGEM-T-easy et, ensuite, cloner les gènes cassettes GFP et VP2 dans le vecteur résultant pour générer le plasmide donneur désigné comme pGEM-sgA-GFP-VP222.
Remarque : N’importe quel vecteur de clonage peut être utilisé pour construire le plasmide de donateurs.
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Préparation d’ADN plasmidique
- Préparer les plasmide donneur et Cas9/gRNA expression plasmide DNAs à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN commercial selon les instructions du fabricant.
2. CRISPR/Cas9-mediated Knock-in : Transfection et l’Infection
- La veille de la transfection, préparer des fibroblastes d’embryons de poussins (CEFs) pour la transfection/infection, utilisant des embryons vieux de 10 jours, dans un milieu M199 additionné de 5 % sérum fœtal (SVF), 10 % bouillon tryptose phosphate, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, et fungizone 0,25 µg/mL. Graine de 1,3 x 106 cellules / puits dans chaque puits d’une plaque de 6 puits en 2,5 mL de milieu.
Remarque : Les cellules CEF peuvent être conservés pendant 3 jours à 4 ° C. - Transfecter cellules CEF (document établi en étape 2.1) avec 0,5 µg de UL45/46-gRNA, 0,5 µg de sg-A et 1 µg de pGEM-sgA-GFP-VP2, utilisant un réactif approprié transfection selon les instructions du fabricant. Incuber les cellules pendant 12 h dans un incubateur (à 38,5 ° C, avec 5 % de CO2).
- posttransfection de 12 h de plasmides Cas9/gRNA et donateurs, diluer le stock de virus HVT avec milieu de culture M199 à 1 x 105 UFP/mL. Ajoutez 130 µL du virus dilué dans chaque puits des cellules transfectées et un puits de cellules celllulaire comme témoin négatif avec la même quantité de virus. Incuber les cellules transfectées/infectés pendant 3 jours à 38,5 ° C, avec 5 % de CO2. Effectuer toutes les procédures en utilisant le Code de conduite commun (JCoPR) approuvé par les bailleurs de fonds.
3. la récolte et la Purification du Virus Recombinant HVT
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Fluorescence-lancée de cellules tri
- Préparer deux plaques à 96 puits préconfigurées avec 2 x 104 cellules CEF par bien le jour avant le tri.
- Trypsinize transfectées/infectés CEFs 3 d après l’infection. Aspirer le milieu de chaque puits et rincez la plaque de cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 1 mL de 0.05 % trypsine-EDTA (0,48 mM) pour trypsinize les cellules dans un incubateur à 38,5 ° C pendant environ 5 min.
- Resuspendre et transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL avec 50 µL de FBS. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
- Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS avec 1 % FBS. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajuster le nombre de cellules à 1 x 106 cellules/mL.
Remarque : Les cellules peuvent être conservés sur glace pendant 1-2 h. - Les cellules de transfert à un polystyrène tri tube par l’intermédiaire de son plafond de crépine. Trier les cellules individuelles exprimant GFP dans des plaques de 96 puits ensemencés avec CEFs utilisant le trieur de cellules selon les instructions du fabricant. Incuber les cellules triées pour 5D à 38,5 ° C, avec 5 % de CO2.
Remarque : Un passage du virus recombinant peut-être être nécessaires avant le tri si il y a trop de cellules individuelles de GFP-expression et quelques plaques de GFP-positifs dans le puits original.
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Passage des virus recombinants
- Préparer les plaques 6 puits ensemencés avec 1,3 x 106 cellules CEF par bien le jour avant le passage. 5 d postsorting, contrôlez les plaques 96 puits sous un microscope à fluorescence. Marquer les puits contenant une seule plaque de GFP-positif.
Remarque : Voir la Figure 2A pour une plaque représentante de GFP-positif. - Trypsinize chaque GFP-positif bien avec 50 µL de trypsine-EDTA pendant 3 min, ajouter 50 µL de milieu de culture, resuspendre et transférer les cellules dans un puits d’une plaque de 6 puits avec CEFs. Il s’agira de la première génération de recombinant HVT.
- La récolte de la première génération de virus recombinants, 3 jours plus tard, geler dans un flacon de chaque dans 1 mL de congélation moyen contenant du sérum de veau foetal 10 % (FCS), 10 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) et milieu de culture de 80 % et stocker les virus dans l’azote liquide.
Remarque : Le moment de la récolte varie de 2-4 d selon la capacité de montant et de la prolifération du virus. - Prélever des cellules5 1 x 10 de chaque première génération de virus, centrifuger à eux et éliminer le surnageant. Stocker les cellules à-20 ° C pour l’extraction de l’ADN.
- Préparer les plaques 6 puits ensemencés avec 1,3 x 106 cellules CEF par bien le jour avant le passage. 5 d postsorting, contrôlez les plaques 96 puits sous un microscope à fluorescence. Marquer les puits contenant une seule plaque de GFP-positif.
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Détection d’insertion génomique par polymerase chain reaction
- Pour l’extraction de l’ADN, dégivrez et resuspendre le culot de cellules de l’étape 3.2.4 avec 50 µL d’empiète sur le tampon (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM NaCl et 200 µg/mL de protéinase K) et lyser les échantillons à 65 ° C pendant 30 min et , puis, à 95 ° C pendant 2 min inactiver la protéinase k
- Effectuer une réaction en chaîne par polymérase (PCR) avec 3' jonction des amorces (tableau 1) à l’aide de 1 µL de l’échantillon d’ADN. Pour chaque échantillon, préparer le mélange de réaction suivant 20 µL sur glace : 2 x PCR Master Mix (10 µL) et 10 amorce en amont µM (0,5 µL), 10 amorce en aval µM (0,5 µL), matrice d’ADN (1 µL) et eau exempte de nucléase (8 µL). Le programme d’amplification est : 95 ° C pendant 2 min ; 95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 40 s pour 35 cycles ; 72 ° C pendant 7 min. charge 2 µL des produits d’amplification d’un puits du gel d’agarose de 1 % pour l’électrophorèse sur gel.
Remarque : Voir la Figure 2A , pour un résultat représentatif de la jonction 3' PCR.
4. l’excision du gène rapporteur Fluorescent via la Cre-lox système
- Pour supprimer le gène de la GFP le virus recombinant, transfecter 2 µg de plasmide d’expression recombinase Cre dans la plaque de 6 puits préconfigurée avec des cellules CEF, utilisant un réactif de transfection suivant les instructions du fabricant.
- posttransfection de 12 h, décongeler un flacon de virus recombinant de l’azote liquide, resuspendre doucement, 50 µL de graines dans chaque puits de cellules transfectées et définir un puits comme contrôle négatif avec la même quantité de virus. Incuber pendant 3 jours à 38,5 ° C, avec 5 % de CO2.
5. plaque Purification
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Fluorescence-lancée de cellules tri
- Plaques à 96 puits deux semences avec 2 x 104 cellules CEF par bien le jour avant le tri.
- Suivez les procédures décrites dans l’étape 3.1 72 h après l’infection (de l’étape 4) pour préparer les cellules infectées pour le tri. Trier les cellules nonfluorescence unique dans des plaques de 96 puits ensemencés avec CEFs.
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Passage des virus recombinants et confirmation par PCR
- Choisissez 5 à 10 nonfluorescence unique plaques 5D postsorting, leur trypsinize avec 50 µL de trypsine-EDTA à 38,5 ° C pendant 3 min et ajouter 50 µL de milieu de culture pour remettre en suspension les cellules.
Remarque : Voir la Figure 2B pour une plaque représentante de GFP-négatif. - Passer la moitié des cellules dans chaque puits d’une plaque de 6 puits préconfigurée avec CEFs comme la deuxième génération.
- Centrifuger les cellules restantes de chaque clone à 200 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 50 µL d’empiète sur le tampon d’extraction de l’ADN.
- Effectuer le PCR avec des amorces 5' junction (tableau 1) à l’aide de 1 µL de matrice d’ADN avec le même état de réaction PCR comme indiqué au point 3.3.2.
Remarque : Voir la Figure 2B pour un résultat représentatif de 5' jonction PCR. - Selon les résultats PCR, choisir trois à cinq clones positifs de HVT recombinante de passages supplémentaires et de vérification.
- Choisissez 5 à 10 nonfluorescence unique plaques 5D postsorting, leur trypsinize avec 50 µL de trypsine-EDTA à 38,5 ° C pendant 3 min et ajouter 50 µL de milieu de culture pour remettre en suspension les cellules.
6. vérification de la recombinaison HVT
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Test d’immunofluorescence indirecte
- Infecter les CEFs avec la deuxième génération de recombinant que HVT obtenu à l’étape 5.2 dans la plaque 24 puits ensemencé avec 2. 5 x 105 CEFs le jour avant l’infection. Supprimer la cellule milieu de culture 48 h après l’infection et ajouter 500 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pour fixer les cellules. Incuber les plaques à température ambiante pendant 30 min, puis, enlever le fixateur et laver la couche de cellules 3 x avec du PBS.
Remarque : Les cellules peuvent être conservés à 4 ° C à cette étape pendant plusieurs semaines. - Retirer le PBS et ajouter 500 µL de 0,1 % de Triton X-100 pour permeabilize les cellules pendant 15 min. laver la cellule couche 3 fois avec du PBS.
- Liaison non spécifique de bloc en ajoutant un tampon de blocage (5 % de sérum bovin dans du PBS) pendant 1 h.
- Diluer l’anticorps monoclonal anti-VP2 anticorps primaire HH7 ou HVT-infectés par le sérum de poulet au 1 : 200 dans un tampon bloquant, ajouter 200 µL / puits et incuber à température ambiante pendant 1 h. laver la cellule couche 3 x avec du PBS.
- Diluer l’anticorps secondaire chèvre anti-souris IgG Alexa 568 ou d’anti-poulet IgG Alexa 488 au 1 : 200 dans un tampon bloquant de la chèvre, ajouter 200 µL / puits, incuber à température ambiante pendant 1 heure et laver les cellules 3 x avec du PBS. Contrôler l’expression de la protéine sous le microscope de fluorescence.
Remarque : Voir la Figure 4 pour une VP2 représentant résultat.
- Infecter les CEFs avec la deuxième génération de recombinant que HVT obtenu à l’étape 5.2 dans la plaque 24 puits ensemencé avec 2. 5 x 105 CEFs le jour avant l’infection. Supprimer la cellule milieu de culture 48 h après l’infection et ajouter 500 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pour fixer les cellules. Incuber les plaques à température ambiante pendant 30 min, puis, enlever le fixateur et laver la couche de cellules 3 x avec du PBS.
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Séquençage du gène VP2
- Amplifier la séquence d’ADN couvrant la région intergénique, UL45 et UL46, avec haute fidélité ADN polymérase et amorces UL45-F1 et UL46-R1 (tableau 1) pour détecter l’insertion entière.
- Préparer le mélange de réaction de 50 µL suivants : 5 µL de 10 x Pfx mélange réactionnel, 1,5 µL de 10 µM en amont et mix amorce en aval, 1 µL du mélange dNTP 10 mM, 1 µL de 50 mM MgSO4, 1 µL de matrice d’ADN et 0,5 µL de Pfx ADN polymérase et ajouter de l’eau exempte de nucléase à 50 µL. Le programme d’amplification est : 95 ° C pendant 2 min ; 95 ° C pendant 15 s, 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 3 min pour 35 cycles. Charger tous les produits PCR au gel d’agarose à 1 % pour l’électrophorèse sur gel.
- Purifier le produit PCR suit l’instruction d’un kit de purification de gel ADN. Envoyer 10 µL du produit PCR (30 ng/µL) à une société de séquencement pour confirmer le knock-in du gène VP2.
7. stabilité du Virus Recombinant
- Semences 2,6 x 106 CEF cellules dans chaque fiole T25 le jour avant l’expansion du virus.
- Décongeler au moins trois clones positifs de l’étape 5.2 ; ajouter un flacon de cellules/virus dans chaque fiole T25. Incuber à 38,5 ° C, avec 5 % de CO2 jusqu'à ce qu’on observe un effet cytopathique 50 %.
- Récolter les cellules dans 2 mL de milieu de culture ; infecter 50 µL dans un nouveau ballon T25 préconfigurée avec des cellules du corps expéditionnaire canadien pour la prochaine génération. Garder de passage le virus recombinant au moins 15 générations. Analyser chaque génération de virus par PCR pour la présence de la séquence VP2 et par dosage de l’immunofluorescence indirecte (IFA) pour l’expression VP2 évaluer la stabilité des virus recombinants.
Representative Results
La stratégie utilisée pour la production du vaccin HVT recombinante est décrit dans la Figure 1, qui comprend comment le plasmide donneur est construite (Figure 1A) et les procédures pour générer le recombinant HVT (Figure 1B ). Plaques de GFP-positif de cinq à trente entourés de plaques de type sauvage peuvent être observés dans le gène frapper-dans puits sous le posttransfection de fluorescence microscope 3 d - infection. Le virus purifié obtenu après que unicellulaires tri (Figure 2A) a été analysée par 3' jonction PCR, qui montre un produit PCR de la taille attendue (Figure 2A, panneau inférieur). Après l’excision du reporter GFP par recombinase Cre, plus de 50 % des plaques perdu leur expression de la GFP. La plaque purifiée après l’excision de la GFP (Figure 2B) en triant les unicellulaires a été confirmée par la jonction 5' PCR, qui montre le produit PCR de bonne taille (Figure 2B, panneau inférieur). La figure 3 montre les résultats du séquençage des deux jonction produits PCR avec différents éléments colorés. Dans la Figure 4, l’expression de la protéine a été confirmée par IFA avec l’anticorps monoclonal spécifique au VP2 et anti-HVT poulet sérum. Comme prévu, cellules infectées par le HVT parental peuvent seulement être teintés par le sérum anti-HVT (verts), tandis que les cellules infectées par HVT recombinantes montrent clairement l’expression du gène VP2 (rouge).
Figure 1: stratégie pour la génération d’une recombinaison vaccin HVT-guidé. (A), ce tableau montre une représentation schématique de la stratégie de clonage pour donneur construction plasmidique. Les principaux éléments sont les deux sites cibles de Cas9 (sgA) pour libérer la cassette d’expression VP2 d’insertion et une cassette GFP journaliste flanqué de séquences LoxP pour l’excision de GFP. (B), ce panneau affiche une vue d’ensemble d’une stratégie en deux étapes gène knock-in. Le fragment d’insertion de la GFP et les cassettes d’expression VP2 est libéré par clivage Cas9/sgA et inséré dans le génome HVT à UL45/46 loci via NHEJ-CRISPR/Cas9. Le virus recombinant GFP-positif est ensuite trié et purifié par la seule cellule activée par fluorescence cellulaire triant (FACS). Par la suite, le gène rapporteur GFP est excisé par recombinase Cre et le virus recombinant est purifié et caractérisé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Vérification de la recombinaison HVT. (A) ce panneau montre une plaque de GFP-positive (HVT-GFP-VP2) visualisée sous le microscope de fluorescence (panneau supérieur) et au contrôle de PCR de HVT-GFP-VP2 avec amorces VP2-F & UL46-R1 pour la jonction 3'. ()B) ce panneau indique une plaque (HVT-VP2) visualisée après l’excision de la GFP de HVT-GFP-VP2, à l’aide de recombinase Cre et vérification de PCR de HVT-VP2 avec amorces UL45-F1 et VP2-R1 pour la jonction 5'. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Séquence d’analyse des virus recombinant HVT. (A) les séquences des éléments clés dans des couleurs différentes dans ce panneau sont la région intergénique HVT entre UL45/46 avec la séquence cible de gRNA a souligné et une flèche indiquant le site de clivage de Cas9, la cassette d’expression VP2 avec la fin des séquences en minuscule italique, la séquence cible de sg-A en rouge avec la flèche indiquant le site de clivage de Cas9, la séquence de site LoxP en vert et deux séquences de sites SfiI en bleu. (B) ce panneau montre les résultats de séquençage de la jonction 5' et 3' et une présentation schématique des HVT-VP2 avec éléments clés avec des couleurs correspondantes présentées en séquences. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Caractérisation de la recombinaison HVT-VP2. Ce panneau montre la confirmation de l’expression réussie de VP2 en CEFs infectés par le test d’immunofluorescence indirecte (IFA) avec un anticorps monoclonal anti-VP2 HH7 (rouge). HVT infection est confirmée par IFA avec du sérum de poulet infectés HVT (vert). La barre d’échelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Le système CRISPR/Cas9 est devenu un outil précieux dans l’édition de gène. Les technologies traditionnelles de recombinant vecteur de développement HVT, tels que la recombinaison homologue13 et BAC mutagénèse technologie25, impliquent généralement plusieurs séries de vecteur de clonage et de la sélection, ainsi que d’un dépistage à grande échelle, ce qui peut prendre plusieurs mois. Le protocole décrit ici en utilisant une stratégie NHEJ-CRISPR/Cas9-based combinée avec le système Cre-Lox et monocellulaires tri est une approche plus pratique, plus rapide et efficace dans la production de vaccin recombinant. À l’aide de ce gazoduc, le virus recombinant puisse être obtenu dans seulement 1 à 2 semaines24et étapes de purification de plaque peuvent aussi être réduites à une séparation de la tour à l’aide de fluorescence-lancée de cellules tri17. L’ensemble du processus, de gRNA construction design et donateurs pour obtenir le virus HVT recombinant purifié, peut être réalisé au cours du mois. Les étapes critiques de génération réussie à HVT recombinante comprennent le choix de haute efficacité gRNA afin de cibler le génome viral afin d’assurer un clivage efficace pour l’insertion de gènes étrangers, l’efficacité de transfection élevé pour maximiser les chances de Cas9 / gRNAs et le virus de se réunir à la même cellule pour l’édition et l’intervalle de 12 heures entre la transfection des plasmides donneur et gRNA et l’infection virale d’autoriser Cas9 et gRNA à s’exprimer à un niveau raisonnable avant que le virus pénètre dans les cellules.
La limitation pour la génération de recombinant HVT est que la complexité de l’identification de GFP-positifs des clones de jonction PCR. Les cassettes de GFP-VP2 pouvaient être insérés soit l’orientation. La jonction que PCR décrite ici est seulement pour l’identification de l’insert dans l’orientation de sens. Dans le cas de l’insert dans l’orientation antisense, PCR en utilisant les paires d’amorces décrites ne fonctionnerait pas, et les amorces internes pourraient être échangés à cet effet. Un autre problème potentiel est que la construction de donateurs ne peut servir pour l’insertion d’un gène dans le même virus en raison de l’existence de la séquence LoxP restante après l’enlèvement de la GFP par traitement de Cre. Une nouvelle construction de donneur avec une variante LoxP séquence pourrait servir au lieu de cela dans un but d’insertion multiple.
NHEJ et HDR (réparation axés sur l’homologie) sont les deux voies pour réparer les ruptures de double-brin (CDB) créés par Cas926,27. NHEJ est plus efficace lorsqu’il se produit tout au long du cycle cellulaire28, alors que le HDR est moins efficace et se produit seulement pendant S et G2 phases6,29,30. Nous avons exploité la voie de réparation NHEJ plus efficace ici pour introduire des gènes étrangers dans les endroits ciblés. Bien que le NHEJ de réparation peut-être introduire des indels en rejoignant les extrémités d’ADN endommagées ou incompatibles à une homologie indépendant mécaniquement flexible processus31,32 entre les séquences clivées donneur et l’ADN génomique, les indels peut se produire uniquement sur les sites de clivage du sgA, et la cassette d’expression génétique étrangère n’est pas affectée. Un autre avantage de cette approche est que NHEJ est exempt de la restriction de la construction de l’homologie de bras, faisant le clonage étape très simple. Ceci amène un grand potentiel pour l’application de NHEJ pour l’insertion de gènes étrangers. La mise en place d’un site cible de gRNA universelle à la fois termine du gène étranger cassette rend le processus plus rapid que le modèle de donateurs pourrait être construit tout de suite sans avoir besoin de sélection spécifique gRNA. L’épine dorsale du plasmide contenant des sites cibles de sgA, LoxP sites et sites PacI et SfiI donateurs peut également être partagé largement entre gènes rapporteurs différents, l’expression des gènes étrangers-cassettes et vecteurs de virus différents, donnant à cette nouvelle approche l’avantage de personnalisation.
L’insert VP2 HVT-qui était utilisé pour décrire le protocole dans ce manuscrit ; Cependant, la même approche peut servir à insérer plus de gènes viraux à différents endroits de génomiques du génome HVT en utilisant le gRNA ciblant la séquence correspondante souhaitée pour le développement de vaccins multivalents de HVT vecteur recombinants. Autres souches vaccinales MDV, tels que les SB-1 et CVI988, autres herpèsvirus aviaires, y compris la laryngotrachéite infectieuse virus virus de canard entérite et aussi autres virus ADN aviaires, tels que les virus de la variole et des adénovirus, peuvent également être conçues à l’aide de la même approche pour le développement d’un vaccin recombinant multivalent. Le développement de nouveaux vaccins vectorisées multivalents utilisant la plate-forme du système CRISPR/Cas9 décrite ici sera très bénéfique pour l’industrie de la volaille pour se protéger contre plusieurs maladies de la volaille.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Pippa Hawes pour aider avec l’imagerie confocale. Ce projet a été soutenu par la biotechnologie et les Biological Sciences Research Council (BBSRC) subventions BBS/E/I/00007034 et BB/L014262/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
| Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
| Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
| HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
| pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
| pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
| PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
| SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
| TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
| Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
| Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
| FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
| Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |
References
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