Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

doi: 10.3791/58199 Published: August 20, 2018

Summary

Digital polymerasekjedereaksjons (PCR) er et nyttig verktøy for høy følsomhet påvisning av single nukleotid varianter og DNA kopi nummer varianter. Her viser vi nøkkelfaktorer for å måle sjeldne varianter i det menneskelige genomet digital PCR med chip-i-en-t-format.

Abstract

Kvantitativ analyse av menneskelig genetisk variasjon er avgjørende for å forstå molekylær egenskapene til alvorlige medisinske tilstander, som svulster. Fordi digitale polymerase kjedereaksjoner (PCR) aktiverer presis kvantifiseringen DNA kopi nummer varianter, blir de et viktig verktøy for å oppdage sjeldne genetisk variasjoner, slik som multiresistent mutasjoner. Det forventes at molekylær diagnoser bruker digital PCR (dPCR) vil være tilgjengelig i klinisk praksis i nær fremtid; Dermed er hvor å effektivt gjennomføre dPCR med menneskelige genetisk materiale et hett tema. Her introduserer vi en metode for å oppdage adenomatøse polypose coli (APC) somatisk mosaicism dPCR med chip-i-en-t-format, som gjør åtte dPCR reaksjoner på utføres samtidig. Forsiktighet bør utvises når fylle og tetting reaksjonsblandingen på sjetongene. Denne artikkelen viser hvordan å unngå over- og undervurdering av positiv partisjoner. Videre, presenterer vi en enkel prosedyre for innsamling dPCR produktet fra partisjonene på chips, hvilke kan brukes å bekrefte bestemt forsterkning. Vi håper at metoder rapporten vil bidra til å fremme dPCR med metoden chip-i-en-tube genetisk forskning.

Introduction

Kvantitativ PCR (qPCR) brukes ofte å kvantifisere menneskelige genetisk variasjon, inkludert single nukleotid varianter (SNVs) og DNA kopi nummer variasjoner (CNVs). I qPCR, en polymerase reaksjon utføres i hver retning på samme måte som konvensjonelle end-point PCR og et signal forsterkning opp fra tuben etter hver termisk syklus. Derimot i dPCR, betyr end-point dPCR i denne rapporten PCR blandingen er lagt inn mange mikroskopiske chambers, kalt partisjoner, hvor DNA maler er presentere eller fraværende en begrensende fortynning, og hver partisjon som inneholder PCR blanding er vurdert som negativ eller positiv etter fullført PCR. Mens det er lett å anslå at det er ingen DNA maler i negativ partisjonene, er det uklart hvor mange eksemplarer av DNA maler finnes i positiv partisjonene. Derfor er antall DNA maler i positiv partisjonene beregnet basert på Poisson-fordelingen, bruker antall fra negative partisjoner1. dPCR er dyrere og har en mindre dynamisk rekkevidde i forhold til qPCR, men denne metoden muliggjør en absolutt kvantifisering og tilbyr høyere følsomhet og større presisjon2.

En av de viktigste programmene av dPCR er validering av variantene identifisert av neste generasjons sekvensering (NGS). Spesielt i tilfellet sjeldne varianter, betyr lav variant fraksjoner, er validering avgjørende på grunn av sekvensering feil som kan oppstå i NGS3. Mens Sanger sekvensering og qPCR er nyttige for validering av SNVs og CNVs, deres følsomhet er lav i forhold til dPCR. DPCR teknologi er derfor etterspørselen etter genetiske undersøkelser arbeider med sjeldne varianter. Nylig har oppdaget av flytende biopsi sjeldne varianter knyttet til kreft egenskaper, for eksempel resistens, blitt et hett tema i molekylær diagnose og terapi4. DPCR teknologien vises egnet for flytende biopsi studier og forventes å ha viktige klinisk programmer i nær fremtid, men forbedringer relatert til dynamikkområdet og kostnadene er fortsatt må implementeres.

Kommersielt tilgjengelig dPCR teknologi kan grovt kategoriseres i dråpe- og chip-baserte plattformer; forskjellen er hvordan DNA malene er partisjonert5,6,7. I dPCR med chip-i-en-rør format distribueres PCR blandingen av handlingen kapillær til partisjonene på en brikke. Chips er bygget i åtte-tube strimler, hvilke mange lab ansatte vil allerede være kjent med, og dermed åtte prøver kan bli behandlet på en gang8. I lesing trinn tar < 1 h å behandle 96 prøver av oppdager hele bildet av chip og ikke hver partisjon. Siden dPCR med chip-i-i-rør-formatet har en høy gjennomstrømning sammenlignet med andre dPCR systemer, er brukervennlighet og produktivitet viktige fordelene for brukerne.

I denne rapporten, somatisk mosaicism av APC genet hos en pasient med sporadiske familiær adenomatøse polypose brukes som en representant og resultatene av dPCR og NGS sammenlignes. Hovedformålet med denne rapporten er å tallfeste klart en single nukleotid variant bruker dPCR med chip-i-en-t-format. Vi håper at denne rapporten er nyttig for forskere interessert i vedta den dPCR plattformen for eget arbeid.

Protocol

Studien design ble godkjent av den Institutional Review Boards i Hamamatsu University School of Medicine (G-260-4). Skriftlig samtykke ble innhentet fra pasienten og hans foreldre.

1. kvalitetskontroll av genomisk DNA

Merk: Genomic DNA (gDNA) var Hentet fra perifert blod med veletablerte silika-membranbasert DNA rensing metoden. I forkant av den under prosedyrer, konsentrasjonen av gDNA ble bestemt bruker et spektrofotometer.

  1. Forberede gDNA prøven i en konsentrasjon av 10-100 ng/µL.
  2. Legge til 10 µL DNA eksempel bufferen til en 8-tube stripen.
  3. Legg 1 µL av DNA stige eller gDNA til rør. Virvle blandingen for 1 min med microplate vedlegg.
  4. Last røret, gel enhet og pipette tips i geleelektroforese instrument (Tabell for materiale) og start Kjør ved å trykke på "Start"-knappen.
    Merk: Geleelektroforese systemet vil automatisk operere med ett klikk på Start-knappen.
  5. Bekrefte at lavere markøren i DNA eksempel bufferen er riktig tilordnet på electropherograms. Hvis det er riktig tilordnet, manuelt tilordne markøren i 'Electroherogram modus' av programvaren.
    Merk: DNA integritet nummeret (DIN) vil bli automatisk beregnet. DIN verdien kommer fra DNA integritet. Høy og lav indikerer DIN verdiene svært intakt og sterkt forringet gDNA, henholdsvis.
  6. Angi størrelse område av gDNA (> 200 bp) i 'regionen modus' av programvaren automatisk beregne konsentrasjonen av gDNA (> 200 bp).

2. primer og sonde Design

  1. Beregne smeltende (Tm) Temperaturverdiene alle åpen tilgang verktøy under følgende betingelser: 10-25 baser, 50 mM Na+/K+, 0.80 mM dNTPs og 3 mM Mg2 + (Tabell for materiale). Utforme revers primerne å forsterke genomisk regionen målet alleler Tm verdien rundt 60 ° C og amplicon lengden på 100-300 bp.
    Merk: Se Tabell 1 for konsentrasjonen av oligonucleotides.
  2. Design låst nukleinsyre (LNA) sonder for referanse og variant alleler basert på følgende: (i) 1 – 6 LNAs finnes i hver probe; (ii) en fluorescerende farge og en avsluttes finnes på 5'- og 3-terminuses for hver probe. (iii) forskjellen mellom Tm verdiene av samsvarende og-sonder er > 10 ° C; (iv) Tm verdiene av samsvarende og-sonder er høyere og lavere enn primerne, henholdsvis [f.eks, frem primer: 60.8 ° C, omvendt primer: 59.8 ° C, referanse allelet sonde (matchet eller feil): 62.6/45.3 ° C, variant allelet sonde (matchet eller feil): 61.7/50.5 ° C]. Tm verdiene ble beregnet ved hjelp av verktøyet åpen tilgang også brukt for trinn 2.1.
  3. Kontroller at designet primere og prober ikke omfatte single nukleotid polymorfismer med en frekvens på > 0,1% som bestemmes av databaser [f.eksenkelt nukleotid polymorfisme databasen (dbSNP)].

3. digital PCR

  1. Forberede primere, sonder, og gDNA lager løsninger i konsentrasjoner som beskrevet i tabell 1 med en TE-buffer og lagre dem på -20-4 ° C.
  2. Bland reagenser i romtemperatur i et samlet volum på 15 µL til en siste konsentrasjon som beskrevet i tabell 1.
    1. Legge 3 µL destillert vann i stedet for gDNA i en nei-mal kontroll (NTC).
    2. Forberede 3,5 x antall PCR blandingen i tre eksemplarer rede for pipettering feilen.
  3. Pipetter PCR blanding opp og ned for å blande den.
  4. Angi lasting plattformen på sjetongene bygget i 8-tube stripen og sette dem på autoloader. Kontroller at det er en kontakt mellom brikken og lasting plattformen.
  5. Passe en lasting glidebryter på plattformen og hold glidebryteren med stopper på lasteren.
  6. Pipetter 15 µL av PCR blandingen på plattformen nær spissen av glidebryteren (figur 1A).
  7. Kjøre lasteren ved å trykke på knappen på lasteren (for ca 1 min).
    Merk: Det er ikke et problem hvis en liten mengde PCR blandingen forblir på plattformen. Det er mulig å kjøre fortløpende lasteren.
  8. Angi den chip-i-en-rør fylt med PCR blandingen i side-sporet på den forsegling enhancer. Skyv lysbildet lokk og kanten av det øvre lokket til ikke bryte chip (figur 1B).
  9. Kjøre den forsegling enhancer (ca 2 min). Sekvensielt kjøre tetting enhancer for 1 min hvis en dam av væske er fremdeles synlig fordi en ufullstendig tetting fører en krysskontaminering av positive signaler (tall 1 c og 1 D).
  10. Legg 230 µL av tetting væske, en oljebasert reagens, til rør.
    Merk: Sjetongene skal nå være nedsenket i væske.
  11. Angi rør i termisk cycler. Kjøre den termiske cycler som beskrevet i tabell 2 (for ca 2 timer). Justere temperaturen eller varigheten av PCR hvis det er en ujevn fordeling av positiv partisjoner (figur 1E).
    Merk: Det anbefales å sette satsen rampen til rundt 1 ° C/s.
  12. La rør i termisk cycler i minst 15 min å redusere planlagte støy.
    Merk: Rørene kan stå over natten også. Fluorescens signaler oppdaget selv dagen.
  13. Angi rør på oppdagelsen pilken og hell 6 mL destillert vann i dekopaj. Hvis luftbobler vises i og utenfor rør, fjerner du dem (tall 1F og 1 G).
  14. Laste inn dekopaj i detektoren og kjøre den med et klikk på knappen "Kjør" av programvaren etter at Fluorescene, eksperimentet og prøve/NTC kategoriene (Tabell for materiale).
    Merk: To farger påvisning av åtte prøver med en standard intensitet tar ca 4-5 min.
  15. Bekrefte posisjon tomten, histogram og 2D spredningsdiagram.
    Merk: iIf fluorescens intensiteten av negative partisjonene er høy, justere intensiteten med et klikk på knappen Innstillinger av programvaren slik at det ligger innenfor 30-70.
  16. Beregne variant allelet brøken (VAF) bruker følgende formel:
    Equation 1
    Her er Cv og Cr kopien antall varianten og referanse allelet, henholdsvis.
    Merk: De beregnes automatisk i programmet basert på Poisson statistikk.

4. innhenting av PCR produkt

  1. Fjern tetting væske fra røret.
  2. Legge til 100 µL TE bufferen røret. Vortex kraftig for 30 s og kort sentrifuge røret.
  3. Overføre TE løsningen til en annen rør og legge 30 µL av 3 M natrium acetate og 200 µL av etanol.
  4. Cool løsningen ved 20 ° C over natten.
  5. Sentrifuge løsningen for 30 min 16.000 x g og fjerne nedbryting.
  6. Legg til 300 µL av 80% etanol rør og vortex.
  7. Sentrifuge løsningen for 15 min 16.000 x g og fjerne nedbryting. Kan føre til air-dry i 5 minutter.
  8. Oppløse bunnfall i 1 – 5 µL TE bufferen etter luft-tørking.
  9. Eventuelt vurdere produktet størrelsen ved hjelp av et geleelektroforese instrument med trinn 1. Legg 1 µL av løsningen gel enheten en høy følsomhet (Tabell for materiale).

Representative Results

Vi gjennomgått somatisk mosaicism av APC genet hos en pasient med sporadiske familiær adenomatøse polypose i henhold til prosedyrene som er beskrevet ovenfor. I en tidligere studie, APC c.834 + 2T > C mutasjon ble funnet i pasienten, men ikke i foreldre, med Sanger sekvensering og NGS9. Design av primer og sonder i representant resultatene vises i tabell 3. Genomic DNA ble Hentet fra den proband, foreldre, og seks friske blodgivere blod. DIN verdiene av de ni gDNA prøvene til 6,7-7.9 (figur 2 og Tabell 4). FAM og HEX ble brukt som fluorescens fargestoffer for C og T alleler, henholdsvis. Grønne og gule flekker på posisjon tomter representerer FAM-positive og HEX-positive partisjoner, henholdsvis (Figur 3A). De blå flekkene representerer negative partisjoner for både FAM og HEX. Den svarte bakgrunnen tilsvarer partisjoner der reaksjonsblandingen ikke ble lagt til. Mange positive partisjoner av C og T alleler ble oppdaget i den proband, mens noen positiv partisjoner av C allelet ble oppdaget i den proband far eller NTC, og i de siste, positive partisjonene t allelet ble ikke oppdaget. Signalet avstanden mellom C og T alleler var tydelig på det todimensjonale (2D) scatterplot, og mest positive signaler HEX og FAM var eksklusive hverandre (Figur 3B). VAF av den proband var 13,2%, som er lik som bestemmes ved hjelp av NGS (12.7%) (Tabell 4). VAFs av den proband foreldre og friske blodgivere ble < 0,1%. Gjenkjenning grensen for APC c.834 + 2T > C mutasjon var anslått til 0,3% bruker 3 x standardavviket for gjentatte målinger med 10 – 11 ng av de totale gDNA10.

Størrelsen på amplicon i dPCR analysen for APC c.834 + 2T > C var spådd for å bli 123 bp. For å bekrefte at dPCR produktet ble forsterket som et enkelt band, dPCR produktet ble samlet inn fra assayed chip. Bruker geleelektroforese, et enkelt band var tydelig oppdaget, og produktet størrelsen var i samsvar med prediksjon (Figur 4).

Figure 1
Figur 1 : Ting å merke seg for dPCR analysen med chip-i-en-rør format. (A) dette panelet viser hvordan du setter opp 8-tube stripen inne autoloaderen. (B) dette panelet viser brutt sjetonger. (C) dette panelet viser hvordan chip overflater like etter (i) lasting og (ii) tetting. (iii) en dam av væske er synlig ved en ufullstendig tetting. (D) dette panelet viser posisjon plottet i et kryss-kontaminering. (E) dette panelet viser posisjon plottet i en ujevn fordeling. (F) dette panelet viser luftbobler hvordan på røret overflaten nedsenket i vann. (G) dette panelet viser luftbobler i røret. Gjennom hele figuren, svart-hvitt pilspisser angi brutt chip stykker og luftbobler, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant electropherograms av blod gDNA. Electropherograms av blod gDNA DIN verdiene til 6,7 og 7.9 vises i øvre og nedre panelet, henholdsvis. Stjernen angir en lavere markør. DIN: DNA integritet nummer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representant resultatene av APC somatisk mosaicism dPCR med chip-i-en-tube formatet. (A) posisjon tomter og (B) scatterplots kontrollen no-mal (NTC), den proband og far vises her. HEX og FAM svarer til referanse og variant alleler, henholdsvis. Loddrette og vannrette linjene angir grensene av HEX og FAM intensitet, henholdsvis. Dette tallet har blitt endret fra Kahyo et al. 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Samling av dPCR produkter fra assayed brikken. Samlet og konsentrert dPCR produktene ble utsatt for geleelektroforese. Anslått målet størrelsen var 123 bp. Dette tallet har blitt endret fra Kahyo et al. 10. NTC: no-mal kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Reagens Konsentrasjon
lager løsning
Volum (μL) Siste konsentrasjon Anbefalt
siste konsentrasjon
DNase RNase-fri destillert vann - 1.75 - -
2 x PCR Master mix - 7.5 - -
LNA undersøke for store allelet 2 ΜM 0,5 66,7 nM 3.33 – 100 nM
LNA undersøke for mindre allelet 2 ΜM 0,5 66,7 nM 3.33 – 100 nM
Fremover primer 1 ΜM 0,5 33,3 nM 3.33-50.0 nM
Omvendt primer 1 ΜM 0,5 33,3 nM 3.33-50.0 nM
20 x dPCR løsning - 0,75 - -
gDNA 3,33 ng/μL 3 666 pg/μL 20 pg/μL-2000 pg/μL1

Tabell 1: dPCR analysen de anvendte reagensene. 1 Avhengig av forventet presisjon og følsomhet.

Trinn Temperatur Tid Sykluser
Første denature 95 ° C 5 m 1
Denature
Avspenning og utvidelse
95 ° C
58 ° C
50 s
90 s
42
Endelig utvidelse 70 ° C 5 m 1

Tabell 2: Termisk cycler forhold.

navn Sekvensen1 Tm verdien2
Fremover primer 5-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3 60.8 ° C
Omvendt primer 5-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3 59.8 ° C
LNA undersøke for T allelet 5'-HEX-ATTT [A] CCTGACCA-IBFQ-3 " Matchet: 62.6 ° C
: 45.3 ° C
LNA undersøke for C allelet 5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3 " Matchet: 61,7 ° C
Ikke samsvarer: 50.5 ° C

Tabell 3: Design av primer og sonder. 1 Understreket og alternative bokstaver er LNA og målrettet varianten, henholdsvis. 2 Beregnet etter trinn 2 av protokollen.

NGS3 dPCR4
Eksempel1 Vev Input DNA (ng) DIN2 VAF (%) Variant (kopier) Referanse (kopier) VAF (%)
Mener RSD
NTC - - - - 1.23 0 I/T I/T
Proband Blod 11.3 7.6 12.7 379 2.48 x 103 13.2 0.0353
Far Blod 10.3 7.7 0.0167 1.08 3.42 x 103 0.0341 0.439
Mor Blod 10.8 7.6 0.0136 0.956 3.04 x 103 0.0313 0.637
Donor-1 Blod 11,7 7.3 - 1,64 3.01 x 103 0.0543 0.414
Donor-2 Blod 10.5 7.6 - 1.06 2,90 x 103 0.0406 0.539
Donor-3 Blod 17,6 7.9 - 4,24 5.65 x 103 0.0713 0.783
Donor-4 Blod 12.3 7.6 - 2,38 4,16 x 103 0.0666 0.557
Donor-5 Blod 19.2 7 - 1.48 6,79 USD x 103 0.0213 0.571
Donor-6 Blod 14.4 6.7 - 3.44 4.67 x 103 0.0728 0.729

Tabell 4: resultatene av dPCR analysen APC somatisk mosaicism. 1 NTC: no-mal kontroll; Donor: frisk donor. 2 DIN: DNA integritet nummer. 3 Iwaizumi et al. 9, hum genomet Var. 2 15057 (2015). 4 Eksperimentene ble kjørt i tre eksemplarer og uavhengig gjentatt 3 x; dataene blir uttrykt som middelverdien; RSD: relative standardavvik; N/A: ikke aktuelt. Tabellen er endret fra Kahyo et al. 10.

Discussion

DIN verdien brukes ofte til å vurdere skadet DNA (f.eks, gDNA fra formalin-fast parafin-embedded vev) før kvantifisering eller sekvensering, fordi en avansert nedbrytning av gDNA kan føre til lav kvalitet data. DIN vurdering, dermed blir et viktig skritt i kvalitetssikringen av menneskelig gDNA11. Siden gDNA brukes i representant eksperimentet ble lagret på 4 ° C i 4-11 år etter utvinning fra blod, ble DIN verdier fastslått for en kvalitetskontroll før dPCR analysen. Dette trinnet anbefales spesielt hvis materialet er mistenkt for å være skadet. Konsentrasjonen av gDNA ble også bestemt av geleelektroforese. Fordi det dynamiske utvalget av dPCR ikke er så stort som for qPCR på grunn av begrensningene av partisjonene, er et mål av gDNA konsentrasjonen et viktig skritt for en vellykket dPCR analysen. Som inndata DNA var korrelert med totalt kopien antall variant og referanse alleler i dPCR analysen (R-kvadrert = 0.935; Tabell 4), geleelektroforese er nyttig for å måle gDNA konsentrasjonen før dPCR analysen.

Lasting og tetting prosesser er viktige skritt for vellykket resultat. Det er avgjørende å bekrefte riktig montering av PCR blandingen på plattformen og sikre kontakt mellom brikken og plattformen (figur 1A). Protrusion av PCR blanding av skyvekontrollen kan føre til ugyldig distribusjon på chip. Bekrefter fordelingen av positive og negative partisjonene på posisjon tomten er også nødvendig for en nøyaktig analyse, fordi det antas i Poisson statistikken at DNA maler er tilfeldig delt i chambers1. Representant treff, ble positiv partisjoner fordelt i chip (Figur 3). Dette resultatet oppfyller kravet for Poisson statistikk og gjenspeiler at lasting og tetting prosedyrer var effektive. Når rørene i den forsegling enhancer, chips kan være ødelagt hvis den sentrale delen av det øvre lokket er skjøvet for sterkt (figur 1B). For å unngå dette, skyv kanten av det øvre lokket. Hvis det er en kunstig klynge av positiv partisjoner (figur 1D), kan antall kopier bli overvurdert på grunn av en kryssforurensning mellom partisjoner. Tetting prosedyren skal forbedres hvis en dam av væske er synlige på overflaten (figur 1C) (f.eksved å kjøre fortløpende tetting enhancer for 1 min). Hvis det er en ujevn fordeling av positiv partisjoner (figur 1E), kan antall kopier bli undervurdert på grunn av utilstrekkelig forsterkning eller forurensning av tetting væske og vann. PCR betingelsene skal justeres i dette tilfellet [f.eksved å justere temperaturen eller varigheten av PCR (trinn 3.11 protokollen), eller ved å sikre at tetting væske og vann strømmet ned jigg er ren]. Fluorescens signaler oppdages fra 8-tube stripen i destillert vann. Hvis luftbobler overholder tube overflaten, er det muligheten for at de kan forstyrre signalet påvisning (figur 1F). Derfor bør bobler fjernes bruke et verktøy, som en fin pipette tips. I tillegg kan luftbobler danne inni rør når de angis i dekopaj (figur 1G). Hvis bobler inni rør er stor nok til å dekke chip, bør de også fjernes. Bobler kan fjerne hvis de blir stående i flere minutter ved romtemperatur.

Noen positive partisjoner kan oppdages i NTC. For å unngå en forurensning av DNA maler, holde benken ren og, hvis mulig, gjør en ren plass med en fan filter enhet. Hvis en forurensning av DNA malene er mistenkt, grundig rydde rommet og/eller kast brukte reagenser. Derimot, hvis positive delene av referansen allelet ikke gjenkjennes i nærvær av gDNA, bekrefte konsentrasjonen av gDNA, primere og sonder. Spesielt ble primerne brukt i en lavere konsentrasjon i representant eksperimentet, sammenlignet med konvensjonelle PCR (tabell 1)12. Det er også avgjørende å bekrefte rampen ofte, som sjelden endres i konvensjonelle PCR.

Hva gjør dPCR med chip-i-en-rør format unike er partisjonering av PCR blandingen inne universell 8-tube stripe8,13. Overføring av partisjonering kamre i et PCR-rør er ikke nødvendig i dette systemet, dermed redusere risikoen for forurensing. Det er også en fordel i dPCR systemet med chip-i-en-t-format. Det tar < 4 h å fullføre 96 analyser i dPCR systemet, mens det tar minst 5 h til slutt det samme antallet analyser i dråpe-baserte dPCR14. Videre muliggjør universell 8-tube stripen bruk av en konvensjonell termisk cycler, i motsetning til en annen chip-baserte dPCR15, som krever en termisk cycler med en flat blokk. Akkumulert kunnskap og reagensene konvensjonelle PCR kan også brukes til dPCR systemet. Dette vil være nyttig for å utvide programmene i dPCR.

Det bør bemerkes at dPCR har flere begrensninger. I dPCR med chip-i-en-rør format er partisjonsnummeret til chip relativt lavt sammenlignet med de andre dPCR-plattformer. Ytterligere forbedring chip enheten må øke det dynamiske området, som avhenger av antall partisjoner. Fordi den interne plassen av universell røret er begrenset, kreves en banebrytende design for chip enheten å øke antall partisjoner. Automatisering av hele dPCR prosedyren i fremtiden vil sterkt redusere menneskelig feil, noe som fører til enda mer pålitelige resultater. På grunn av dens høy gjennomstrømming og høy følsomhet natur forventes dPCR med chip-i-en-t-format brukes for å behandle en rekke prøver for flytende biopsier og miljømessige DNA.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av en Grant-in-Aid for Scientific Research (C) fra Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) (nr 15 K 08397) til Tomoaki Kahyo, og av tilskudd fra Japan Direktoratet for medisinsk forskning og utvikling (AMED) (nr. 927960719), Grant-in-Aid for utforskende forskning (nr. 16K 15256), utgifter for tilknyttede prosjekter av et incentiv spesielle budsjett for å fremme en National University Reform i Management utgifter tilskudd (nr. 1019253), og røyking Research Foundation til Haruhiko Sugimura. Forfatterne takker Dr. Iwaizumi og Dr. Kurachi for deres kliniske støtte. Fond ikke hadde noen rolle i utarbeidelsen av manuskriptet. Figur 3og Figur 4 Tabell 4 er tilpasset og trykket fra en artikkel av Kahyo et al. 10, med tillatelse fra Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAamp DNA Blood Maxi Kit Qiagen 51194 Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA
NanoDrop 1000 ThermoFisher SCIENTIFIC ND-8000 Before Protocol 1: Spectrophotometer
8-strip tube Agilent Technologies 401428 Protocol 1
Genomic DNA sample buffer Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
DNA ladder Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
MS3 Basic Small Shaker IKA 3617000 Protocol 1: Vortex mixer
Genomic DNA ScreenTape Agilent Technologies 5067-5365 Protocol 1: Gel device
2200 TapeStation system Agilent Technologies G2965AA Protocol 1: Electrophoresis instrument
TapeStation Analysis Software Agilent Technologies Bundled with G2965AA Protocol 1: Analysis software
DNA oligo primers IDT Custom order Protocol 2
LNA probes IDT Custom order Protocol 2
Software tool IDT Web site: http://biophysics.idtdna.com/ Protocol 2
dbSNP database NCBI Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Protocol 2
TE buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 12090015 Protocol 3
DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher SCIENTIFIC 10977015 Protocol 3 (Table 1)
Clarity Digital PCR Probe Mastermix JN Medsys 12013 Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix
A component of #10011
Clarity Sealing Fluid JN Medsys 12005 Protocol 3: Sealing fluid
A component of #10011
Clarity JN Solution JN Medsys 12006 Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution
A component of #10011
Clarity Tube-strip JN Medsys 12007 Protocol 3: Chip-in-a-tube
A component of #10011
Clarity Sample Loading Kit JN Medsys 12008 Protocol 3: Loading platform and slider
A component of #10011
Clarity Auto Loader JN Medsys 11002 Protocol 3: Auto loader
A component of #10001
Clarity Sealing Enhancer JN Medsys 11003 Protocol 3: Sealing enhancer
A component of #10001
Clarity Reader JN Medsys 11004 Protocol 3: Reader
A component of #10001
Life Eco Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC Protocol 3: Thermal cycler
Clarity Software JN Medsys Bundled with #10001 Protocol 3: Analysis software
High Sensitivity D1000 screen tape Agilent Technologies 5067-5584 Protocol 4: Gel device for high sensitivity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision. PLoS One. 10, (3), 0118833 (2015).
  2. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59, (6), 892-902 (2013).
  3. Chen, L., Liu, P., Evans, T. C., Ettwiller, L. M. DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science. 355, (6326), 752-756 (2017).
  4. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discovery. 6, (5), 479-491 (2016).
  5. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Analytical Chemistry. 80, (23), 8975-8981 (2008).
  6. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, (22), 8604-8610 (2011).
  7. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314, (5804), 1464-1467 (2006).
  8. Low, H., Chan, S. J., Soo, G. H., Ling, B., Tan, E. L. Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (7), 1869-1875 (2017).
  9. Iwaizumi, M., et al. A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis. Human Genome Variation. 2, 15057 (2015).
  10. Kahyo, T., et al. Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism. Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).
  11. Kanai, Y., et al. The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International. 68, (2), 63-90 (2018).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  13. Cao, L., et al. Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications. Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).
  14. Bio-Rad Laboratories. Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf (2018).
  15. Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf (2013).
Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).More

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter