Summary
Digitala polymeraskedjereaktion (PCR) är ett användbart verktyg för hög känslighet detektion av enda nukleotid varianter och DNA kopia antalet varianter. Här visar vi viktiga överväganden för att mäta sällsynta varianter i det mänskliga genomet med digital PCR med formatet chip-i-ett-rör.
Abstract
Kvantitativ analys av mänsklig genetisk variation är avgörande för att förstå de molekylära egenskaperna av allvarliga medicinska tillstånd såsom tumörer. Eftersom digitala polymeras kedjereaktioner (PCR) Aktivera exakt kvantifiering av DNA copy number variants, blir de ett viktigt verktyg för att upptäcka sällsynta genetiska varianter, såsom resistenta mutationer. Det förväntas att molekylär diagnoser med digital PCR (dPCR) kommer att vara tillgängliga i klinisk praxis inom en snar framtid; Hur att effektivt genomföra dPCR med mänskliga genetiska materialet är således ett hett ämne. Här, införa vi en metod för att upptäcka adenomatös polypos coli (APC) somatisk mosaicism med dPCR med formatet chip-i-ett-rör, som tillåter åtta dPCR reaktioner ska genomföras samtidigt. Försiktighet bör iakttas vid fyllning och tätning reaktionsblandningen på markerna. Denna artikel visar hur att undvika över- och underskattning av positiva partitioner. Dessutom presenterar vi en enkel procedur för att samla in produktens dPCR från partitioner på marker, som sedan kan användas för att bekräfta de specifika förstärkningen. Vi hoppas att betänkandet metoder kommer att bidra till att främja dPCR med metoden chip-i-ett-rör i genetisk forskning.
Introduction
Kvantitativ PCR (qPCR) används ofta för att kvantifiera mänsklig genetisk variation, inklusive enda nukleotid varianter (SNVs) och DNA kopia antalet variationer (CNVs). I qPCR, ett polymeras reaktionen utförs i varje rör på samma sätt som i konventionella slutpunkten PCR, och en förstärkning signalen förvärvas från röret efter varje termisk cykel. Däremot i dPCR, vilket innebär slutpunkten dPCR i detta betänkande, PCR-blandningen är laddad i många mikroskopiska chambers, kallas partitioner, där DNA mallar finns närvarande eller frånvarande på en begränsande utspädning och varje partition innehåller PCR blandning bedöms som negativ eller positiv efter komplett PCR. Medan det är lätt att uppskatta att det finns inga DNA-mallar i negativa partitioner, är det oklart hur många kopior av DNA mallar finns i positiva partitioner. Därför uppskattas antalet DNA mallar i positiva partitioner baserat på Poisson-fördelningen, med räkningen från negativa partitioner1. dPCR är dyrare och har ett mindre dynamiskt omfång jämfört med qPCR, men denna metod möjliggör en absolut kvantifiering och erbjuder en högre känslighet och större precision2.
En av de viktigaste applikationerna av dPCR är valideringen av de varianter som identifierats av nästa generations sekvensering (NGS). Särskilt när det gäller sällsynta varianter, menande låg variant fraktioner, är validering avgörande på grund av sekvensering fel som kan uppstå i NGS3. Medan Sanger sekvensering och qPCR är användbara verktyg för validering av SNVs och CNVs, deras känslighet är låg jämfört med dPCR. DPCR teknik är därför efterfrågan på genetiska studier behandlar sällsynta varianter. Nyligen blivit upptäckt av flytande biopsi av sällsynta varianter cancer egenskaper, såsom läkemedelsresistens, ett hett ämne i molekylär diagnos och terapi4. Den dPCR tekniken visas lämplig för flytande biopsi studier och förväntas ha viktiga kliniska tillämpningar inom en snar framtid, även om förbättringar relaterade till det dynamiska omfånget och kostnaden är fortfarande skyldiga att genomföras.
Kommersiellt tillgängliga dPCR teknik kan grovt indelat i droplet- och chip-baserade plattformar. skillnaden är hur DNA mallarna är partitionerade5,6,7. I dPCR med chip-i-ett-rör format distribueras PCR blandningen av kapillärkraften i partitionerna på ett chip. Markerna är byggda i åtta-tube remsor, som många lab Personalen kommer redan vara bekant med, och således åtta prover kan behandlas på en tid8. I steg i behandlingen tar < 1 h att behandla 96 prover genom att upptäcka hela bilden av chip och inte varje partition. Eftersom dPCR med formatet chip-i-ett-rör har ett högt dataflöde jämfört med andra dPCR system, är användbarhet och produktivitet viktiga fördelar för sina användare.
I denna rapport somatisk mosaicism av APC genen hos en patient med sporadiska familjär adenomatös polypos används som ett representativt fall och resultaten av dPCR och NGS jämförs. Det huvudsakliga syftet med denna rapport är att tydligt kvantifiera en enda nukleotid variant med dPCR med formatet chip-i-ett-rör. Vi hoppas att detta betänkande är till hjälp för forskare som är intresserade av att anta den dPCR plattformen för sitt eget arbete.
Protocol
Studiedesign godkändes av institutionella i styrelserna för de Hamamatsu University School of Medicine (G-260-4). Skriftligt informerat samtycke erhölls från patienten och hans föräldrar.
1. kvalitetskontroll av genomisk DNA
Obs: Genomiskt DNA (gDNA) extraherades från perifert blod metoden väletablerade kiseldioxid-membran-baserade DNA rening. I förväg av den nedanför procedurer, koncentrationen av gDNA bestämdes med en spektrofotometer.
- Förbereda gDNA provet vid en koncentration på 10 – 100 ng/µL.
- Tillsätt 10 µL av DNA prov buffert till en 8-tube-remsan.
- Tillsätt 1 µL DNA stege eller gDNA i rören. Vortex blandningen för 1 min med mikroplattan kvarstad.
- Load röret, gel enheten och pipetten tips i elektrofores instrument (Tabell av material) och start kör genom att trycka på knappen 'börja'.
Obs: Elektrofores systemet fungerar automatiskt med ett klick på knappen Start. - Bekräfta att den lägre markör som finns i DNA prov bufferten är korrekt tilldelad på elektroferogrammen. Om den tilldelas felaktigt, manuellt tilldela markören i de 'Electroherogram läge' av programvaran.
Anmärkning: Antalet DNA integritet (DIN) kommer att beräknas automatiskt. DIN värdet kommer från DNA integritet. Högt och lågt indikerar buller värden mycket intakt och starkt försämrade gDNA, respektive. - Ange regionen storlek i gDNA (> 200 bp) i 'Region läge' av mjukvara för att automatiskt beräkna koncentrationen av gDNA (> 200 bp).
2. primer och sonden Design
- Beräkna de smältande (Tm) temperaturvärden med alla öppna verktyg under följande förhållanden: 10 – 25 baser, 50 mM Na+k+, 0,80 mM dNTP och 3 mM Mg2 + (Tabell för material). Design framåt och bakåt primers att förstärka regionen genomisk som innehåller mål-alleler med Tm värdet cirka 60 ° C och amplikon längden på 100 – 300 bp.
Obs: Se tabell 1 för koncentrationen av oligonukleotider. - Design den låsta nukleinsyra (LNA) sonder för referens- och variant alleler baserat på följande villkor: (i) 1 – 6 LNAs är närvarande i varje sond; (ii) ett fluorescerande färgämne och en törstsläckare är närvarande vid det 5'- och 3'-terminuses av varje sond, respektive; (iii) skillnaden mellan Tm värdena av de matchade och inkompatibla sonderna är > 10 ° C; (iv) Tm värdena av de matchade och inkompatibla sonderna är högre och lägre än de av primers, respektive [e.g., forward primer: 60,8 ° C, reverse primer: 59,8 ° C, referens allel sonden (matchade/felaktigt): 62.6/45.3 ° C, variant allel sonden (matchade/felaktigt): 61.7/50.5 ° C]. Tm värdena beräknades med hjälp av öppna verktyget används också för steg 2.1.
- Se till att de designade primers och sonder omfattar de enda nukleotid polymorfismer med en frekvens av > 0,1% som bestäms från databaser [e.g., Single Nucleotide Polymorphism databasen (dbSNP)].
3. digital PCR
- Förbereda de grundfärger, sonder och gDNA stamlösningar i de koncentrationer som beskrivs i tabell 1 med TE buffert och lagra dem vid -20 – 4 ° C.
-
Blanda reagenserna i rumstemperatur i en total volym på 15 µL till en slutlig koncentration som beskrivs i tabell 1.
- Tillsätt 3 µL destillerat vatten i stället för gDNA i en no-mall kontroll (NTC).
- Förbereda 3,5 x mängden PCR-blandningen i tre exemplar för pipettering felet.
- Pipettera PCR blandningen upp och ner för att blanda.
- Ange den lastning korgen på marker byggdes 8-tube remsan och ställa dem på autoloader. Säkerställa att det finns en kontakt mellan chip och lastning plattform.
- Passar en lastning reglage på plattformen och hålla reglaget med proppen bort av lastaren.
- Pipettera 15 µL av PCR-blandningen på plattformen nära spetsen av skjutreglaget (figur 1A).
- Kör lastaren genom att trycka på knappen på lastaren (för ca 1 min).
Obs: Det är inte ett problem om en liten mängd PCR blandning förblir på plattformen. Det är möjligt att sekventiellt kör lastaren. - Ställ in chip-i-ett-röret fylls med PCR-blandning i side slot av den tätning förstärkare. Tryck Skjut locket och kanten av locket för att inte bryta chip (figur 1B).
- Kör den tätning förstärkare (ca 2 min). Köras sekventiellt den tätning förstärkare för 1 min om en pöl av vätska är fortfarande synliga eftersom en ofullständig tätning orsakar en korskontaminering av de positiva signalerna (siffrorna 1 c och 1 D).
- Tillsätt 230 µL tätningsvätska, ett oljebaserade reagens, rören.
Obs: Marker bör nu vara nedsänkta i vätska. - Ställ in rören i termocykel. Kör termocykel som beskrivs i tabell 2 (för cirka 2 h). Finjustera temperaturen eller varaktigheten av PCR om det finns en ojämn fördelning av positiva partitioner (figur 1E).
Obs: Det rekommenderas att fastställa skattesatsen ramp till omkring 1 ° C/s. - Lämna rören i den termocykel för minst 15 min att minska baslinjen bullret.
Obs: Rören kan vara kvar över natten liksom. Fluorescens signaler upptäcktes även följande dag. - Rören på jiggen upptäckt och häll 6 mL destillerat vatten i jiggen. Om luftbubblor är synliga i och utanför rören, avmarkera dem (siffror 1F och 1 G).
- Läsa in jiggen i detektorn och köra den med ett klick på knappen 'Kör' av programvaran efter valet av Fluorescene, Experiment och prov/NTC flikar (Tabell för material).
Obs: Tvåfärgad detektion av åtta prover med en standard intensitet tar cirka 4-5 min. - Bekräfta den ståndpunkt tomt, histogram och 2D spridningsdiagram.
Obs: iIf fluorescensintensiteten hos negativa partitionerna är hög, justera intensiteten genom att klicka på knappen Inställningar av programvaran så att den faller inom intervallet 30 – 70. - Beräkna andelen variant allel (VAF) med följande formel:
Här, är Cv och Cr kopia antalet varianten och referens allelen, respektive.
Obs: De beräknas automatiskt i programmet utifrån Poisson statistik.
4. insamling av PCR-produkten
- Ta bort tätningsvätskan från röret.
- Tillsätt 100 µL av TE buffert till röret. Vortex kraftigt i 30 s och kort Centrifugera röret.
- Överför TE lösningen till en annan tube och tillsätt 30 µL 3 M natriumacetat och 200 µL etanol.
- Kyl lösningen vid-20 ° C över natten.
- Centrifugera lösningen för 30 min vid 16 000 x g och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 300 µL av 80% etanol till röret och vortex.
- Centrifugera lösningen för 15 min vid 16 000 x g och avlägsna supernatanten. Låt fällningen lufttorka för 5 min.
- Lös upp utfällningen i 1 – 5 µL av TE bufferten efter lufttorkning.
- Om nödvändigt, bedöma Produktstorlek med ett instrument som elektrofores med hänvisning till steg 1. Ladda 1 µL av lösningen till gel enheten för en hög känslighet (Tabell för material).
Representative Results
Vi granskade somatisk mosaicism av APC genen hos en patient med sporadiska familjär adenomatös polypos enligt de förfaranden som beskrivs ovan. I en tidigare studie, APC c.834 + 2T > C mutation hittades i patienten, men inte i deras föräldrar, använder Sanger sekvensering och NGS9. Mönster av primers och sonder används i de representativa resultat redovisas i tabell 3. Genomiskt DNA var ur blodet av det proband, föräldrarna och sex friska donatorer. DIN värdena av nio gDNA proverna varierade till 6,7 – 7,9 (figur 2 och tabell 4). FAM och HEX användes som fluorescens färgämnen för de C och T-allelerna, respektive. De gröna och gula fläckarna på position tomterna representerar FAM-positiv och HEX-positiv partitioner, respektive (figur 3A). De blå fläckarna representera negativa partitioner för både FAM och HEX. Den svarta bakgrunden motsvarar partitioner där reaktionsblandningen inte lades. Många positiva partitioner i C och T alleler upptäcktes i den proband, medan några positiva partitioner av C-allelen upptäcktes i den proband far eller NTC och, i sistnämnda, positiv partitioner av T allel inte upptäcktes. Signalen separationen mellan C och T-alleler var tydliga på den tvådimensionella (2D)-spridningsdiagram, och de mest positiva signalerna av HEX och FAM var exklusive varandra (figur 3B). VAF av den proband var 13,2%, som är liknande till det fastställs med hjälp av NGS (12,7%) (Tabell 4). VAFs av den proband's föräldrar och friska donatorer var < 0,1%. Detektionsgränsen för APC c.834 + 2T > C mutation uppskattades till 0,3% använder 3 x standardavvikelsen för upprepade mätningar med 10 – 11 ng av totala gDNA10.
Kopiestorlek i dPCR-analysen för APC c.834 + 2T > C förutspåddes för att vara 123 bp. För att bekräfta att den dPCR produkten förstärktes som ett enda band, samlades dPCR produkten från analyseras chip. Använda elektrofores, ett enda band upptäcktes klart och Produktstorlek överensstämde med prognos (figur 4).
Figur 1 : Punkter att notera för dPCR analysen med chip-i-ett-rör format. (A) denna panel visar hur du ställer in 8-tube remsan i autoloader. (B) denna panel visar brutna marker. (C), denna panel visar hur chip ytbehandlar strax därefter (i) lastning och (ii) tätning. (iii) en pöl av vätska syns vid en ofullständig tätning. (D), denna panel visar position tomten i fråga om en förorening. (E), denna panel visar position tomten i fråga om en ojämn fördelning. (F) panelen visar luftbubblor hur på tube ytan nedsänkt i vatten. (G), denna panel visar luftbubblor inuti röret. Under hela hela figuren, svarta och vita pilspetsar indikerar trasiga chip bitar och luftbubblor, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representant elektroferogrammen av blod gDNA. Elektroferogrammen av blod gDNA med DIN 6,7 och 7,9 värden visas i den övre och nedre panelen, respektive. Asterisken indikerar en lägre markör. BULLER: DNA integritet nummer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa resultat av APC somatisk mosaicism med formatet chip-i-ett-rörs dPCR. (A) positionen tomter och (B) scatterplots kontrollen nr-mall (NTC), den proband och Fadern visas här. HEX och FAM motsvarar referens- och variant alleler, respektive. Vertikala och horisontella linjer anger tröskelvärdena i HEX och FAM stödnivåer, respektive. Denna siffra har ändrats från Kahyo et al. 10. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 : Samling av dPCR produkter från analyseras chip. De insamlade och koncentrerad dPCR produkterna utsattes för elektrofores. Den förutspådda målstorleken var 123 bp. Denna siffra har ändrats från Kahyo et al. 10. NTC: nr-mall kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Koncentration av stamlösning |
Volym (μl) | Slutlig koncentration | Rekommenderat slutlig koncentration |
| DNAS/RNase-Free destillerat vatten | - | 1,75 | - | - |
| 2 x PCR Master mix | - | 7.5 | - | - |
| LNA sond för stora allel | 2 ΜM | 0,5 | 66,7 nM | 3.33 – 100 nM |
| LNA sond för mindre allel | 2 ΜM | 0,5 | 66,7 nM | 3.33 – 100 nM |
| Forward primer | 1 ΜM | 0,5 | 33,3 nM | 3.33 – 50,0 nM |
| Reverse primer | 1 ΜM | 0,5 | 33,3 nM | 3.33 – 50,0 nM |
| 20 x dPCR lösning | - | 0,75 | - | - |
| gDNA | 3.33 ng/μl | 3 | 666 pg/μL | 20 pg/μL – 2 000 pg/μL1 |
Tabell 1: reagens som används för analysen dPCR. 1 Beroende på förväntad precision och känslighet.
| Steg | Temperatur | Tid | Cykler |
| Inledande denaturering | 95 ° C | 5 m | 1 |
| Denaturera Glödgning och förlängning |
95 ° C 58 ° C |
50 s 90 s |
42 |
| Slutliga förlängning | 70 ° C | 5 m | 1 |
Tabell 2: Termocykel villkor.
| Namn | Sekvens1 | Tm värde2 |
| Forward primer | 5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3′ | 60,8 ° C |
| Reverse primer | 5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3′ | 59,8 ° C |
| LNA probe för T-allelen | 5'-HEX-ATTT [EN] CCTGACCA-IBFQ-3' | Matchad: 62,6 ° C Inkompatibla: 45,3 ° C |
| LNA probe för C-allelen | 5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3' | Matchad: 61,7 ° C Inkompatibla: 50,5 ° C |
Tabell 3: Design av primers och sonder. 1 Understrukna och inom parentes bokstäver är LNA och riktade variant, respektive. 2 Beräknas enligt steg 2 i protokollet.
| NGS3 | dPCR4 | |||||||
| Prov1 | Vävnad | Ingång DNA (ng) | DIN2 | VAF (%) | Variant (kopior) | Referens (kopior) | VAF (%) | |
| Menar | RSD | |||||||
| NTC | - | - | - | - | 1.23 | 0 | EJ TILLÄMPLIGT | EJ TILLÄMPLIGT |
| Proband | Blod | 11.3 | 7,6 | 12,7 | 379 | 2.48 x 103 | 13.2 | 0.0353 |
| Fader | Blod | 10.3 | 7,7 | 0,0167 | 1,08 | 3.42 x 103 | 0.0341 | 0.439 |
| Mor | Blod | 10,8 | 7,6 | 0.0136 | 0.956 | 3,04 x 103 | 0.0313 | 0,637 |
| Givare-1 | Blod | 11,7 | 7,3 | - | 1,64 | 3,01 x 103 | 0.0543 | 0.414 |
| Givare-2 | Blod | 10.5 | 7,6 | - | 1,06 | 2,90 x 103 | 0.0406 | 0.539 |
| Givare-3 | Blod | 17,6 | 7,9 | - | 4.24 | 5,65 x 103 | 0.0713 | 0.783 |
| Givare-4 | Blod | 12.3 | 7,6 | - | 2,38 | 4.16 x 103 | 0.0666 | 0,557 |
| Givare-5 | Blod | 19,2 | 7 | - | 1,48 | 6,79 x 103 | 0.0213 | 0.571 |
| Givare-6 | Blod | 14,4 | 6,7 | - | 3.44 | 4,67 x 103 | 0.0728 | 0.729 |
Tabell 4: resultat av dPCR assay för APC somatisk mosaicism. 1 NTC: nr-mall kontroll; Donator: friska givare. 2 BULLER: DNA integritet nummer. 3 Iwaizumi et al. 9, hum genomet Var. 2 15057 (2015). 4 Experimenten kördes i tre exemplar och självständigt upprepade 3 x; data är uttryckta som medelvärdet; RSD: relativ standardavvikelse; N/A: ej tillämpligt. Tabellen har ändrats från Kahyo et al. 10.
Discussion
DIN värdet används ofta bedöma skadat DNA (t.ex., gDNA från formalin-fast paraffin-inbäddat vävnad) innan kvantifiering eller sekvensering, eftersom en avancerad nedbrytning av gDNA kan resultera i låg kvalitet data. DIN bedömning, således blir ett viktigt steg i kvalitetskontroll av mänskliga gDNA11. Eftersom den gDNA används i representativa experimentet hade varit lagras vid 4 ° C i 4 – 11 år efter dess utvinning från blod, bestämdes dess buller värden för en kvalitetskontroll innan dPCR analysen. Detta steg rekommenderas särskilt om material som misstänks vara skadade. Koncentrationen av gDNA fastställdes också genom elektrofores. Eftersom det dynamiska omfånget av dPCR inte är lika bred som för qPCR på grund av begränsningar i partitioner, är en mätning av gDNA koncentrationen ett viktigt steg för en framgångsrik dPCR analys. Som mängden input DNA var korrelerad med antalet totala kopia från varianten och referens alleler i dPCR-analysen (R-kvadrat = 0,935; (Se tabell 4), elektrofores är användbar för att mäta gDNA koncentrationen innan dPCR analysen.
Lastning och tätning processer är viktiga steg för framgångsrika resultat. Det är viktigt att bekräfta lämplig montering av PCR-blandningen på plattformen och säkerställa kontakt mellan chip och plattform (figur 1A). Utbuktningen på PCR-blandning från skjutreglaget kan orsaka ogiltiga distribution på chip. Bekräftar fördelningen av positiva och negativa partitioner på en position tomt är också nödvändigt för en exakt analys, eftersom det antas i Poisson statistik att DNA mallar delas slumpmässigt upp i chambers1. I de representativa resultat distribuerades positiva partitioner i hela chip (figur 3). Detta resultat uppfyller kravet för Poisson statistik och återspeglar att lastning och tätning förfaranden var effektiva. När du ställer in rören i den tätning förstärkare, marker kan brytas om den centrala delen av locket trycks för starkt (figur 1B). För att undvika detta, tryck försiktigt kanten av locket. Om det finns en konstgjord kluster av positiva partitioner (figur 1D), kan kopienumret överskattas på grund av en korskontaminering mellan partitioner. Försegla förfarandet bör förbättras om en pöl av vätska är synliga på ytan (figur 1C) (t.ex., av sekventiellt rerunning den tätning förstärkare för 1 min). Om det finns en ojämn fördelning av positiva partitioner (figur 1E), kan kopienumret underskattas på grund av otillräcklig förstärkning eller förorening av tätning vätska och vatten. De PCR-villkor bör justeras i detta fall [e.g., genom att finjustera temperaturen eller varaktigheten av PCR (steg 3.11 i protokollet), eller genom att säkerställa att den tätande vätska och vatten hälls i jiggen är rena]. Fluorescens signaler upptäcks från 8-tube strip nedsänkt i destillerat vatten. Om luftbubblor följer tube ytan, finns det möjlighet att de kan störa signaldetektion (figur 1F). Därför ska bubblor rensas med hjälp av ett verktyg, såsom en fina pipettspetsen. Dessutom kan luftbubblor bildas inuti rören när de ställs i jiggen (figur 1G). Om bubblor inuti rören är tillräckligt stor för att täcka chip, bör de också tas bort. Bubblorna kan avmarkera om de är kvar i flera minuter vid rumstemperatur.
Vissa positiva partitioner kan upptäckas i NTC. För att undvika en kontaminering av DNA mallar, hålla bänken ren och, om möjligt, göra en ren utrymme med en fläkt filterenhet. Om en förorening av DNA mallar misstänks, grundligt rengöra utrymmet eller kassera reagenserna som används. Däremot om de positiva partitionerna av referens-allelen inte upptäcks i närvaro av gDNA, bekräfta koncentrationerna av gDNA, primers och sonder. Särskilt, användes primers vid en lägre koncentration i representativa experimentet, jämfört med konventionella PCR (tabell 1)12. Det är också viktigt att bekräfta den ramp taxa, som ändras sällan i konventionella PCR.
Det unika dPCR med formatet chip-i-ett-tube är delningen av PCR-blandningen släpper universal 8-tube strip8,13. En överföring av partitionering kamrarna i en PCR-röret behövs inte i detta system, vilket minskar risken för kontaminering. Det är också en fördel i det dPCR systemet med chip-i-ett-rör format; Det tar < 4 h till slut 96 analyser i det dPCR systemet, medan det tar minst 5 h till slut samma antal analyser i droplet-baserade dPCR14. Dessutom möjliggör universal 8-tube remsan användning av en konventionell termocykel, till skillnad från ett annat chip-baserade dPCR15, vilket kräver en termocykel med ett platt block. Också, den ackumulerade kunskap och reagenser för konventionella PCR kan tillämpas till dPCR systemet. Detta kommer att vara användbart för att utvidga tillämpningar av dPCR.
Det bör noteras att dPCR har flera begränsningar. I dPCR med formatet chip-i-ett-rör är partitionsnumret för chipet relativt låg jämfört med de i andra dPCR plattformar. Ytterligare en förbättring chip enheten kommer att behöva öka det dynamiska omfånget, som beror på antal partitioner. Eftersom förvaringsutrymmet av universal röret är begränsat, krävs en banbrytande design för chip enheten att öka antalet partitioner. Automatisering av hela dPCR förfarandet i framtiden skulle kraftigt minska mänskliga fel, vilket resulterar i ännu mer tillförlitliga resultat. På grund av hög genomströmning och hög känslighet förväntas dPCR med chip-i-ett-rör format tillämpas för att behandla ett antal prover för flytande biopsier och miljömässiga DNA.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Här studien har finansierats genom ett bidrag för Scientific Research (C) från Japan Society för att främjande av vetenskap (JSPS) (nr 15 K 08397) till Tomoaki Kahyo och genom bidrag från Japan byrån för medicinsk forskning och utveckling (AMED) (nr 927960719), Bidrag för förberedande forskning (nr 16K 15256), utgifter för associerade projekt av ett incitamentsprogram särskild Budget för främjande av en National University Reform i Management kostnader bidrag (nr 1019253), och rökning forskningsstiftelsen att Haruhiko Sugimura. Författarna tackar Dr. Iwaizumi och Dr. Kurachi för deras kliniska stöd. Finansiärerna hade ingen roll i utarbetandet av manuskriptet. Figur 3, figur 4och tabell 4 är anpassade och särtryck ur en artikel av Kahyo et al. 10, med tillstånd från Elsevier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Blood Maxi Kit | Qiagen | 51194 | Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA |
| NanoDrop 1000 | ThermoFisher SCIENTIFIC | ND-8000 | Before Protocol 1: Spectrophotometer |
| 8-strip tube | Agilent Technologies | 401428 | Protocol 1 |
| Genomic DNA sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
| DNA ladder | Agilent Technologies | 5067-5366 | Protocol 1: A component of Genomic DNA Screen Tape Assay |
| MS3 Basic Small Shaker | IKA | 3617000 | Protocol 1: Vortex mixer |
| Genomic DNA ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5365 | Protocol 1: Gel device |
| 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2965AA | Protocol 1: Electrophoresis instrument |
| TapeStation Analysis Software | Agilent Technologies | Bundled with G2965AA | Protocol 1: Analysis software |
| DNA oligo primers | IDT | Custom order | Protocol 2 |
| LNA probes | IDT | Custom order | Protocol 2 |
| Software tool | IDT | Web site: http://biophysics.idtdna.com/ | Protocol 2 |
| dbSNP database | NCBI | Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ | Protocol 2 |
| TE buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12090015 | Protocol 3 |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher SCIENTIFIC | 10977015 | Protocol 3 (Table 1) |
| Clarity Digital PCR Probe Mastermix | JN Medsys | 12013 | Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix A component of #10011 |
| Clarity Sealing Fluid | JN Medsys | 12005 | Protocol 3: Sealing fluid A component of #10011 |
| Clarity JN Solution | JN Medsys | 12006 | Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution A component of #10011 |
| Clarity Tube-strip | JN Medsys | 12007 | Protocol 3: Chip-in-a-tube A component of #10011 |
| Clarity Sample Loading Kit | JN Medsys | 12008 | Protocol 3: Loading platform and slider A component of #10011 |
| Clarity Auto Loader | JN Medsys | 11002 | Protocol 3: Auto loader A component of #10001 |
| Clarity Sealing Enhancer | JN Medsys | 11003 | Protocol 3: Sealing enhancer A component of #10001 |
| Clarity Reader | JN Medsys | 11004 | Protocol 3: Reader A component of #10001 |
| Life Eco Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | Protocol 3: Thermal cycler |
| Clarity Software | JN Medsys | Bundled with #10001 | Protocol 3: Analysis software |
| High Sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | Protocol 4: Gel device for high sensitivity |
References
- Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision. PLoS One. 10 (3), 0118833 (2015).
- Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
- Chen, L., Liu, P., Evans, T. C., Ettwiller, L. M. DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science. 355 (6326), 752-756 (2017).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Analytical Chemistry. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- Low, H., Chan, S. J., Soo, G. H., Ling, B., Tan, E. L. Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1869-1875 (2017).
- Iwaizumi, M., et al. A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis. Human Genome Variation. 2, 15057 (2015).
- Kahyo, T., et al. Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism. Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).
- Kanai, Y., et al. The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International. 68 (2), 63-90 (2018).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Cao, L., et al. Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications. Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).
- Bio-Rad Laboratories. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf (2018).
- Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf (2013).
