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Cancer Research

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

doi: 10.3791/58199 Published: August 20, 2018

Summary

Digital cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta útil para a detecção de alta sensibilidade de variantes de nucleotídeo único e as variantes números de cópia do DNA. Aqui, demonstramos considerações-chave para variantes raras no genoma humano usando PCR digital com o formato de microplaqueta-em-um-tubo de medição.

Abstract

A análise quantitativa da variação genética humana é crucial para compreender as características moleculares de doenças graves, como tumores. Porque digital polimerase reações em cadeia (PCR) permitem a quantificação precisa das variantes números de cópia do DNA, eles estão se tornando uma ferramenta essencial para a detecção de variações genéticas raras, tais como mutações resistentes aos medicamentos. Espera-se que o diagnóstico molecular usando PCR digital (dPCR) estará disponível na prática clínica num futuro próximo; assim, como conduzir eficientemente dPCR com material genético humano é um tema quente. Aqui, apresentamos um método para detectar mosaicismo somático Polipose Adenomatosa do colo (APC), usando dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo, que permite oito reações dPCR ser realizados simultaneamente. Deve ter cuidado ao enchimento e selagem a mistura de reação nas fichas. Este artigo demonstra como evitar o over - e subestimação das partições positivas. Além disso, apresentamos um procedimento simples para a coleta do produto dPCR de partições nas fichas, que podem ser usadas para confirmar a amplificação específica. Esperamos que este relatório métodos ajudará a promover o dPCR com o método de microplaqueta-em-um-tubo na pesquisa genética.

Introduction

PCR quantitativo (qPCR) é frequentemente usado para quantificar a variação genética humana, incluindo variantes de nucleotídeo único (SNVs) e DNA cópia números variações (CNVs). Em qPCR, uma polimerase é realizada em cada tubo, da mesma forma como a PCR convencional de ponto de extremidade, e um sinal de amplificação é adquirido a partir do tubo após cada ciclo térmico. Por outro lado, em dPCR, significa o ponto de extremidade dPCR neste relatório, a mistura PCR é carregada em muitas câmaras microscópicas, denominadas partições, onde modelos de DNA estão presentes ou ausentes em uma diluição limitante e cada partição contendo mistura PCR é avaliada como negativo ou positivo após o PCR completa. Enquanto é fácil estimar que não há nenhum modelo de DNA nas partições negativas, desconhece-se quantas cópias de modelos de DNA estão presentes nas partições positivas. Portanto, o número de modelos de DNA nas partições positivos é estimado com base na distribuição de Poisson, usando a contagem no negativo partições1. dPCR é mais caro e tem um alcance dinâmico menor comparado a qPCR, mas este método permite uma quantificação absoluta e oferece uma maior sensibilidade e maior precisão2.

Dentre as principais aplicações de dPCR é a validação das variantes identificadas por sequenciamento de próxima geração (NGS). Especialmente no caso das variantes raras, frações de variante baixa significado, validação é fundamental devido a erros de sequenciamento que podem ocorrer em NGS3. Enquanto Sanger sequenciamento e qPCR são ferramentas úteis para a validação da SNVs e CNVs, sua sensibilidade é baixa em comparação com dPCR. Portanto, dPCR tecnologia é na demanda por estudos genéticos lidando raras variantes. Recentemente, a detecção por biópsia líquida de raras variantes relacionadas com características de câncer, tais como a resistência aos medicamentos, tornou-se um tema quente no diagnóstico molecular e terapia4. A tecnologia dPCR aparece apropriada para estudos de biópsia líquida e deverá ter importantes aplicações clínicas no futuro próximo, apesar de melhorias relacionadas com a gama dinâmica e custo ainda são necessárias para ser implementado.

Tecnologia dPCR comercialmente disponíveis pode ser categorizada aproximadamente em plataformas baseadas no chip e gota; a diferença é como os modelos de DNA são particionadas5,6,7. No dPCR com formato de microplaqueta-em-um-tubo, a mistura PCR é distribuída pela ação capilar para as partições em um chip. Os chips são construídos em tiras de oito-tubo, que muitos funcionários do laboratório já vão estar familiarizados com, e, assim, oito amostras podem ser tratadas em um tempo8. Na etapa de leitura, é preciso < 1 h para tratar 96 amostras detectando a imagem inteira do chip e não de cada partição. Desde dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo tem um alto throughput em comparação com outros sistemas dPCR, usabilidade e produtividade são as principais vantagens para seus usuários.

Neste relatório, mosaicismo somático do gene APC em um paciente com esporádico polipose adenomatosa familiar é usado como um caso representativo e os resultados de dPCR e NGS são comparados. O objetivo principal deste relatório é quantificar claramente uma variante de nucleotídeo único usando dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo. Esperamos que este relatório é útil para pesquisadores interessados em adotar a plataforma dPCR para seu próprio trabalho.

Protocol

O desenho do estudo foi aprovado pelos conselhos revisão institucional de a Hamamatsu University School of Medicine (G-260-4). Obteve-se consentimento escrito do paciente e seus pais.

1. controle da qualidade do DNA genômico

Nota: O DNA genômico (gDNA) foi extraído do sangue periférico utilizando o método de purificação de DNA baseado em sílica-membrana bem estabelecido. Antes da abaixo os procedimentos, a concentração de gDNA foi determinada utilizando um espectrofotômetro.

  1. Prepare a amostra de gDNA em uma concentração de 10 a 100 ng / µ l.
  2. Adicione 10 µ l de tampão de amostra de DNA para uma faixa de 8-tubo.
  3. Adicione 1 µ l de DNA escada ou gDNA para os tubos. A mistura por 1 min, usando o acessório de microplacas de vórtice.
  4. Carga do tubo, o dispositivo de gel e pipeta dicas para o instrumento de eletroforese (Tabela de materiais) e começar a correr, pressionando o botão 'Iniciar'.
    Nota: O sistema de eletroforese funciona automaticamente com um clique no botão Iniciar.
  5. Confirme que o marcador inferior contido no buffer de amostra de DNA é atribuído corretamente sobre o electropherograms. Se ele é incorretamente atribuído, atribua manualmente o marcador no 'modo de Electroherogram' do software.
    Nota: O número de integridade do DNA (DIN) será automaticamente calculado. O valor DIN origina-se da integridade do DNA. Alto e baixo ruído valores indicam gDNA altamente intacta e fortemente degradada, respectivamente.
  6. Especifica a região de tamanho da gDNA (> 200 bp) nomodo de região' ' do software para calcular automaticamente a concentração de gDNA (> 200 bp).

2. primer e sonda Design

  1. Calcular os valores de temperatura (Tm) fusão usando qualquer ferramenta de acesso aberto sob as seguintes condições: bases de 10 – 25, 50mm at+/k+, dNTPs 0,80 mM e 3 mM Mg2 + (Tabela de materiais). Desenha os primers para diante e reversos para amplificar a região genômica contendo alelos de destino com o valor dem T em torno de 60 ° C e o comprimento do amplicon na bp 100-300.
    Nota: Consulte a tabela 1 para a concentração dos oligonucleotides.
  2. Projeto do ácido nucleico bloqueado (LNA) sondas para os alelos de referência e variante baseado nas seguintes condições: (i) 1 – 6 LNAs estão presentes em cada ponta de prova; (ii) um corante fluorescente e um quencher estão presentes em 5'- e 3'-terminal de cada sonda, respectivamente; (iii) a diferença entre os valores dem T das sondas combinados e incompatíveis é > 10 ° C; (iv) Tm valores as sondas combinadas e incompatíveis são superiores e inferiores dos primers, respectivamente [por exemplo, para a frente da primeira demão: 60,8 ° C, primer reverso: 59,8 ° C, sonda alelo de referência (combinado/incompatíveis): 62.6/45.3 ° C, variante sonda alelo (combinado/incompatíveis): 61.7/50.5 ° C]. Os valores dem T foram calculados usando a ferramenta de acesso aberto, também usada no passo 2.1.
  3. Certifique-se que os primers projetados e sondas não englobar os polimorfismos de nucleotídeo único com uma frequência de > 0,1% conforme determinado de bancos de dados [por exemplo, o banco de dados do polimorfismo de nucleotídeo único (dbSNP)].

3. digital PCR

  1. Preparar as primeiras demão, sondas e gDNA soluções estoque nas concentrações descritas na tabela 1 , com um buffer de TE e armazená-los no -20-4 ° C.
  2. Misture os reagentes à temperatura ambiente em um volume total de 15 µ l para uma concentração final conforme descrito na tabela 1.
    1. Adicione 3 µ l de água destilada em vez de gDNA em um controle de não-modelo (NTC).
    2. Prepare 3.5 x a quantidade da mistura de PCR em triplicado para dar conta do erro de pipetagem.
  3. Pipete a mistura PCR para cima e para baixo misturá-lo.
  4. Definir a plataforma de carregamento para os chips construídos na faixa de 8-tubo e defini-las sobre o carregador automático. Certifique-se de que há um contato entre o chip e a plataforma de carga.
  5. Ajustar um controle deslizante de carregamento na plataforma e mantenha o controle deslizante com a rolha fora o carregador.
  6. Pipete 15 µ l da mistura de PCR na plataforma perto da ponta do controle deslizante (Figura 1A).
  7. Execute o carregador pressionando o botão do loader (por aproximadamente 1 min).
    Nota: Isto não é um problema se uma pequena quantidade da mistura PCR permanece na plataforma. É possível sequencialmente, execute novamente o carregador.
  8. Defina o microplaqueta-em-um-tubo preenchido com mistura PCR na ranhura lateral do realçador da selagem. Empurre a tampa corrediça e a borda da tampa superior para não quebrar o chip (Figura 1B).
  9. Execute o realçador da selagem (aproximadamente 2 min). Sequencialmente executar novamente o realçador da selagem por 1 min, se uma poça de líquido é ainda visível, porque uma selagem incompleta faz com que uma contaminação cruzada dos sinais positivos (figuras 1 e 1 D).
  10. Adicione 230 µ l de líquido, um reagente à base de óleo, para os tubos de vedação.
    Nota: As fichas agora devem ser imerso no fluido.
  11. Defina os tubos no termociclador. Execute o termociclador conforme descrito na tabela 2 (para aproximadamente 2 h). Ajuste a temperatura e a duração das PCR se há uma distribuição desigual de partições positivas (Figura 1E).
    Nota: Recomenda-se definir a taxa de rampa de cerca de 1 ° C/s.
  12. Deixe os tubos no termociclador durante pelo menos 15 minutos para reduzir o ruído da linha de base.
    Nota: Os tubos podem ser deixados durante a noite também. Sinais de fluorescência foram detectados até o dia seguinte.
  13. Definir os tubos no anzol a deteção e despeje o jig 6 mL de água destilada. Se as bolhas de ar são visíveis dentro e fora dos tubos, eliminá-los (figuras 1F e 1 G).
  14. Carregar o gabarito para o detector e executá-lo com um clique no botão "executar" do software após a seleção de guias Fluorescene, experimento e amostra/NTC (Tabela de materiais).
    Nota: A detecção de cor dupla de oito amostras com uma intensidade padrão leva aproximadamente 4-5 min.
  15. Confirme o enredo de posição, o histograma e o 2D de dispersão.
    Nota: iIf a intensidade da fluorescência das partições negativas é elevado, ajuste a intensidade com um clique no botão Configurações do software, de modo que cabe dentro da faixa de 30 a 70.
  16. Calcule a fração de variante alélica (VAF) usando a seguinte fórmula:
    Equation 1
    Aqui, Cv e Cr são o número de cópias da variante e o alelo de referência, respectivamente.
    Nota: Eles são automaticamente calculados no programa de software com base em estatísticas de Poisson.

4. coleção de produto do PCR

  1. Remova o fluido de vedação do tubo.
  2. Adicione 100 µ l de tampão TE ao tubo. Vórtice vigorosamente por 30 s e brevemente centrifugar o tubo.
  3. Transferir a solução TE para outro tubo e adicionar 30 µ l de acetato de sódio 3M e 200 µ l de etanol.
  4. Legal a solução a-20 ° C durante a noite.
  5. Centrifugue a solução por 30 min a 16.000 x g e remover o sobrenadante.
  6. Adicione 300 µ l de etanol a 80% para o tubo e o vórtice.
  7. Centrifugue a solução por 15 min a 16.000 x g e remover o sobrenadante. Permitir que o precipitado secar ao ar por 5 min.
  8. Dissolva o precipitado em 1 – 5 µ l de tampão TE após secagem ao ar.
  9. Se necessário, avalie o tamanho do produto usando um instrumento de eletroforese com referência à etapa 1. Carrega de 1 µ l da solução para o dispositivo de gel para uma sensibilidade elevada (Tabela de materiais).

Representative Results

Revimos o mosaicismo somático do gene APC em um paciente com esporádico polipose adenomatosa familiar de acordo com os procedimentos descritos acima. Em um estudo anterior, a APC c.834 + 2T > mutação C foi encontrada no paciente, mas não em seus pais, usando Sanger sequenciamento e NGS9. Os projetos das primeiras demão e sondas utilizadas nos resultados representativos são mostrados na tabela 3. DNA genômico foi extraído do sangue do probando, os pais e seis doadores saudáveis. Os valores de ruído das nove amostras gDNA variou de 6,7 – 7,9 (Figura 2 e tabela 4). FAM e HEX foram usados como as tinturas de fluorescência para os alelos C e T, respectivamente. As manchas de verdes e amarelas nas parcelas posição representam partições FAM-positivo e HEX-positivo, respectivamente(Figura 3). Os pontos azuis representam partições negativas para FAM e HEX. O fundo preto corresponde a partições onde a mistura de reação não foi adicionada. Muitas partições positivas dos alelos C e T foram detectadas no probando, enquanto alguns partições positivas do alelo C foram detectadas no pai do probando ou a NTC e, nas últimas, positivas partições do T alelo não foram detectados. A separação do sinal entre os alelos C e T foi clara sobre o gráfico de dispersão bidimensional (2D), e os sinais mais positivos de HEX e FAM eram exclusivos um do outro (Figura 3B). O VAF do probando era 13,2%, que é similar àquele determinado usando NGS (12,7%) (Tabela 4). Os VAFs do probando pais e doadores saudáveis foram < 0,1%. Limite de detecção para a APC c.834 + 2T > mutação C foi estimada em 0,3% usando 3 vezes o desvio padrão para as medições repetidas com ng 10 – 11 do total gDNA10.

O tamanho do amplicon no ensaio dPCR para APC c.834 + 2T > C foi previsto para ser 123 bp. Para confirmar que o produto dPCR foi amplificado como uma única banda, o produto dPCR foi coletado o chip analisado. Usando electroforese, uma única banda claramente foi detectada e o tamanho do produto era consistente com a previsão (Figura 4).

Figure 1
Figura 1 : Pontos a serem observados para o ensaio de dPCR com microplaqueta-em-um-tubo formato. (A), este painel mostra como configurar a faixa de 8-tubo no carregador automático. (B), este painel mostra fichas quebradas. (C), este painel mostra como o chip superfícies logo após (i) carregamento e (ii) a vedação. (iii) uma poça de líquido é visível no caso de uma selagem incompleta. (D), este painel mostra a trama de posição no caso de uma contaminação cruzada. (E), este painel mostra a trama de posição no caso de uma distribuição desigual. (F), este painel mostra como ar bolhas na superfície do tubo, imergidas em água. (G), este painel mostra as bolhas de ar dentro do tubo. Em toda a figura inteira, preto e brancas setas indicam peças chip quebrado e bolhas de ar, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Electropherograms representante de sangue gDNA. Electropherograms de sangue gDNA com valores de ruído de 6,7 e 7,9 são mostradas no painel inferior e superior, respectivamente. O asterisco indica um marcador inferior. DIN: Número de integridade de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Resultados representativos da APC mosaicismo somático usando dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo. (A), a posição de parcelas e (B) scatterplots do controle não-modelo (NTC), o probando e o pai são mostrados aqui. HEX e FAM correspondem os alelos de referência e variante, respectivamente. Linhas verticais e horizontais indicam os limites das intensidades HEX e FAM, respectivamente. Esta figura foi modificada de Kahyo et al . 10. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Coleção de produtos dPCR do chip analisado. Os produtos recolhidos e concentrado dPCR foram submetidos à eletroforese. O tamanho do alvo previsto era 123 bp. Esta figura foi modificada de Kahyo et al . 10. NTC: controle de não-modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Reagente Concentração
da solução-mãe
Volume (μL) Concentração final Recomendado
concentração final
DNase/RNase-livre água destilada - 1,75 - -
2 x PCR Master mix - 7.5 - -
Sonda do LNA para alelo principal 2 ΜM 0,5 66,7 nM 3.33 – 100 nM
Sonda do LNA para alelo menor 2 ΜM 0,5 66,7 nM 3.33 – 100 nM
Cartilha para a frente 1 ΜM 0,5 33.3 nM 3.33 – 50,0 nM
Primeira demão reversa 1 ΜM 0,5 33.3 nM 3.33 – 50,0 nM
20 x solução dPCR - 0.75 - -
gDNA 3,33 ng/μL 3 pg 666/μL 20 pg/μL – 2.000 pg/μL1

Tabela 1: reagentes utilizados para o ensaio de dPCR. 1 Dependendo da precisão esperada e sensibilidade.

Passo Temperatura Tempo Ciclos de
Desnaturação inicial 95 ° C 5 m 1
Desnaturar
Recozimento e extensão
95 ° C
58 ° C
50 s
90 s
42
Extensão final 70 ° C 5 m 1

Tabela 2: Condições de termociclador.

Nome Sequência1 Tm valor2
Cartilha para a frente 5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3 ' 60,8 ° C
Primeira demão reversa 5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3 ' 59,8 ° C
Sonda do LNA para alelo T 5'-HEX-ATTT [A] CCTGACCA-IBFQ-3' Correspondência: 62,6 ° C
Incompatíveis: 45,3 ° C
Sonda do LNA para alelo C 5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3' Correspondência: 61,7 ° C
Incompatíveis: 50,5 ° C

Tabela 3: desenho dos primers e sondas. 1 Letras sublinhadas e entre colchetes são o LNA e variante alvo, respectivamente. 2 Calculado de acordo com a etapa 2 do protocolo.

NGS3 dPCR4
Amostra1 Tecido Entrada do DNA (ng) DIN2 VAF (%) Variante (cópias) Referência (cópias) VAF (%)
Quer dizer RSD
NTC - - - - 1.23 0 N/A N/A
Probando Sangue 11.3 7.6 12.7 27 X 2.48 x 103 13.2 0.0353
Pai Sangue 10.3 7.7 0,0167 1.08 3,42 x 103 0.0341 0.439
Mãe Sangue 10,8 7.6 0.0136 0.956 3,04 x 103 0.0313 0.637
Doador-1 Sangue 11,7 7.3 - 1.64 3,01 x 103 0.0543 0.414
Doador-2 Sangue 10.5 7.6 - 1.06 2,90 x 103 0.0406 0,539
Doador-3 Sangue 17,6 7,9 - 4.24 5.65 x 103 0.0713 0.783
Doador-4 Sangue 12.3 7.6 - 2.38 4.16 x 103 0.0666 0.557
Doador-5 Sangue 19.2 7 - 1.48 6,79 x 103 0.0213 0.571
Doador-6 Sangue 14,4 6.7 - 3.44 4,67 x 103 0.0728 0.729

Tabela 4: resultados da dPCR do ensaio para APC mosaicismo somático. 1 NTC: controle de não-modelo; Doador: doador saudável. 2 DIN: Número de integridade de DNA. 3 Iwaizumi et al 9, hum genoma var. 15057 2 (2015). 4 Os experimentos foram executados em triplicado e independentemente repetida 3x; os dados são expressos como o valor médio; RSD: desvio-padrão relativo, N/a: não aplicável. A tabela foi modificada de Kahyo et al . 10.

Discussion

O valor DIN é usado frequentemente para avaliar o DNA danificado (por exemplo, gDNA de tecido fixada em formol de parafina) antes de quantificação ou sequenciamento, porque uma degradação avançada de gDNA pode resultar em dados de baixa qualidade. Avaliação de ruído é, tornando-se assim, um passo importante no controle de qualidade da gDNA humana11. Desde que o gDNA usado no experimento representativo foram guardada em 4 ° C por 4 – 11 anos após a sua extração de sangue, seus valores de ruído foram determinadas para um controle de qualidade antes do ensaio de dPCR. Esta etapa é recomendada especialmente se os materiais são suspeitos de ser danificado. A concentração de gDNA também foi determinada por eletroforese. Porque a gama dinâmica de dPCR não é tão ampla quanto a qPCR devido às limitações das partições, uma medida da concentração gDNA é um passo importante para um ensaio de sucesso dPCR. Como a quantidade de DNA foi correlacionada com o número de cópia total dos alelos no ensaio dPCR variante e referência de entrada (R-quadrado = 0.935; Tabela 4), electroforese é útil para medir a concentração de gDNA antes do ensaio de dPCR.

O carregamento e a processos de vedação são passos importantes para resultados de sucesso. É crucial confirmar a montagem adequada da mistura de PCR na plataforma e assegurar um contacto entre o chip e a plataforma (Figura 1A). Protrusão de mistura PCR do controle deslizante pode causar distribuição inválida no chip. Confirmando a distribuição das partições positivas e negativas em um terreno de posição também é necessário para uma análise precisa, porque presume-se em estatísticas de Poisson que modelos de DNA são aleatoriamente divididos em câmaras1. Nos resultados do representante, partições positivas foram distribuídas por todo o chip (Figura 3). Este resultado cumpre a exigência para as estatísticas de Poisson e reflete que a carga e procedimentos de selagem foram eficazes. Quando configuração o realçador da selagem dos tubos, os chips podem ser quebrados se a parte central da pálpebra superior é empurrada demasiado fortemente (Figura 1B). Para evitar isso, empurre suavemente a borda da tampa superior. Se houver um cluster artificial de partições positivos (Figura 1D), o número de cópia pode ser superestimado devido a uma contaminação cruzada entre as partições. O processo de selagem deve ser melhorado se uma poça de líquido é visível na superfície (Figura 1C) (por exemplo, por sequencialmente executar novamente o realçador da selagem por 1 min). Se há uma distribuição desigual de partições positivas (Figura 1E), o número de cópia pode ser subestimado devido a amplificação insuficiente ou contaminação do fluido de selagem e da água. As condições PCR devem ser ajustadas neste caso [por exemplo, por meio do ajuste da temperatura ou a duração da PCR (etapa 3.11 do protocolo), ou garantindo que o fluido da selagem e água derramada o jig limpos]. Sinais de fluorescência são detectados da faixa de 8-tubo imergida em água destilada. Se as bolhas de ar aderem à superfície do tubo, há a possibilidade de que eles podem interferir com a detecção de sinal (Figura 1F). Portanto, as bolhas devem ser canceladas usando uma ferramenta, como uma ponta de pipeta fina. Além disso, as bolhas de ar podem formar dentro dos tubos, quando eles são definidos o gabarito (Figura 1G). Se as bolhas dentro dos tubos são grandes o suficiente para cobrir o chip, eles também devem ser cancelados. As bolhas podem esclarecer se são deixados por alguns minutos em temperatura ambiente.

Algumas partições positivas podem ser detectadas no NTC. Para evitar uma contaminação dos modelos de DNA, mantenha a bancada limpa e, se possível, fazer um espaço limpo com uma unidade de filtro do ventilador. Se houver suspeita de uma contaminação dos modelos de DNA, cuidadosamente limpar o espaço e/ou descartar os reagentes usados. Por outro lado, se as partições positivas do alelo referência não são detectadas em presença de gDNA, reconfirme as concentrações do gDNA, cartilhas e sondas. Notavelmente, os primers foram usados em uma concentração mais baixa no experimento representativa, em relação ao convencional do PCR (tabela 1)12. Também é crucial confirmar a taxa de rampa, que raramente é alterada no PCR convencional.

O que torna dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo único é o particionamento da mistura de PCR dentro da faixa de 8-tubo universal8,13. Uma transferência das câmaras de particionamento em um tubo PCR não é necessário neste sistema, reduzindo assim o risco de contaminação. Há também uma vantagem no sistema dPCR com formato de microplaqueta-em-um-tubo; é preciso < 4h para terminar 96 ensaios nesse sistema dPCR, enquanto leva pelo menos 5 h para terminar o mesmo número de ensaios em baseados em gotículas dPCR14. Além disso, a faixa de 8-tubo universal permite o uso de um termociclador convencional, ao contrário de outro chip baseada dPCR15, que exige um termociclador com um bloco liso. Além disso, o conhecimento acumulado e reagentes para PCR convencional podem ser aplicados ao sistema dPCR. Isto será útil para expandir as aplicações de dPCR.

Deve notar-se que dPCR tem várias limitações. Em dPCR com o formato de microplaqueta-em-um-tubo, o número da partição do chip é relativamente baixo em comparação com aqueles em outras plataformas dPCR. Melhoria adicional para o dispositivo do chip deverão aumentar o alcance dinâmico, que varia de acordo com o número de partições. Porque o espaço interno do tubo universal é limitado, uma inovadora para o dispositivo de chip é necessário para aumentar o número de partições. A automação do processo inteiro dPCR futuramente reduziria muito o erro humano, resultando em resultados ainda mais confiáveis. Devido à sua natureza de alta produtividade e alta sensibilidade, o dPCR com microplaqueta-em-um-tubo formato deverá ser aplicado para tratar um número de amostras de biópsias líquidas e DNA ambiental.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este estudo foi suportado por um subsídio para a Scientific Research (C) da sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) (n. º 15 K 08397) para Tomoaki Kahyo e por concessões da Agência de pesquisa médica e desenvolvimento (AMED) (n º 927960719), Japão Subsídio para pesquisa exploratória (n. º 16K 15256), das despesas para projectos associados de um orçamento especial incentivo para a promoção de uma reforma da Universidade Nacional de subsídios de despesas de gestão (n º 1019253) e a Fundação de pesquisa de fumar para Haruhiko Sugimura. Os autores agradecer Dr. Iwaizumi e Dr. Kurachi pelo apoio clínico. Os financiadores não tinham qualquer papel na preparação do manuscrito. Figura 3, Figura 4e tabela 4 são adaptado e reproduzido a partir de um artigo por Kahyo et al . 10, com permissão da Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAamp DNA Blood Maxi Kit Qiagen 51194 Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA
NanoDrop 1000 ThermoFisher SCIENTIFIC ND-8000 Before Protocol 1: Spectrophotometer
8-strip tube Agilent Technologies 401428 Protocol 1
Genomic DNA sample buffer Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
DNA ladder Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
MS3 Basic Small Shaker IKA 3617000 Protocol 1: Vortex mixer
Genomic DNA ScreenTape Agilent Technologies 5067-5365 Protocol 1: Gel device
2200 TapeStation system Agilent Technologies G2965AA Protocol 1: Electrophoresis instrument
TapeStation Analysis Software Agilent Technologies Bundled with G2965AA Protocol 1: Analysis software
DNA oligo primers IDT Custom order Protocol 2
LNA probes IDT Custom order Protocol 2
Software tool IDT Web site: http://biophysics.idtdna.com/ Protocol 2
dbSNP database NCBI Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Protocol 2
TE buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 12090015 Protocol 3
DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher SCIENTIFIC 10977015 Protocol 3 (Table 1)
Clarity Digital PCR Probe Mastermix JN Medsys 12013 Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix
A component of #10011
Clarity Sealing Fluid JN Medsys 12005 Protocol 3: Sealing fluid
A component of #10011
Clarity JN Solution JN Medsys 12006 Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution
A component of #10011
Clarity Tube-strip JN Medsys 12007 Protocol 3: Chip-in-a-tube
A component of #10011
Clarity Sample Loading Kit JN Medsys 12008 Protocol 3: Loading platform and slider
A component of #10011
Clarity Auto Loader JN Medsys 11002 Protocol 3: Auto loader
A component of #10001
Clarity Sealing Enhancer JN Medsys 11003 Protocol 3: Sealing enhancer
A component of #10001
Clarity Reader JN Medsys 11004 Protocol 3: Reader
A component of #10001
Life Eco Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC Protocol 3: Thermal cycler
Clarity Software JN Medsys Bundled with #10001 Protocol 3: Analysis software
High Sensitivity D1000 screen tape Agilent Technologies 5067-5584 Protocol 4: Gel device for high sensitivity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision. PLoS One. 10, (3), 0118833 (2015).
  2. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59, (6), 892-902 (2013).
  3. Chen, L., Liu, P., Evans, T. C., Ettwiller, L. M. DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science. 355, (6326), 752-756 (2017).
  4. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discovery. 6, (5), 479-491 (2016).
  5. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Analytical Chemistry. 80, (23), 8975-8981 (2008).
  6. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, (22), 8604-8610 (2011).
  7. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314, (5804), 1464-1467 (2006).
  8. Low, H., Chan, S. J., Soo, G. H., Ling, B., Tan, E. L. Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (7), 1869-1875 (2017).
  9. Iwaizumi, M., et al. A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis. Human Genome Variation. 2, 15057 (2015).
  10. Kahyo, T., et al. Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism. Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).
  11. Kanai, Y., et al. The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International. 68, (2), 63-90 (2018).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  13. Cao, L., et al. Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications. Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).
  14. Bio-Rad Laboratories. Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf (2018).
  15. Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf (2013).
Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo
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Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).More

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).

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