Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

doi: 10.3791/58199 Published: August 20, 2018

Summary

Digital Polymerasekædereaktionen (PCR) er et nyttigt redskab til høj følsomhed påvisning af enkelt nucleotid varianter og DNA kopi antal varianter. Her, viser vi centrale overvejelser i forbindelse med måling af sjældne varianter i det menneskelige genom ved hjælp af digital PCR med formatet chip i rør.

Abstract

Kvantitativ analyse af menneskers genetiske variation er afgørende for at forstå de molekylære karakteristika af alvorlige medicinske tilstande, såsom tumorer. Fordi digital polymerase kædereaktion (PCR) aktiverer en præcis kvantificering af DNA kopi antal varianter, bliver de et vigtigt værktøj til påvisning af sjældne genetiske variationer, som resistente mutationer. Det forventes at molekylære diagnoser ved hjælp af digital PCR (dPCR) vil være tilgængelig i klinisk praksis i den nærmeste fremtid; således, hvordan man effektivt fører dPCR med menneskets genetiske materiale er et varmt emne. Her, indfører vi en metode til at registrere adenomatøs polypose coli (APC) somatiske mosaicisme ved hjælp af dPCR med formatet chip i rør, som giver mulighed for otte dPCR reaktioner skal gennemføres samtidigt. Bør udvises forsigtighed ved fylde- og forseglingmaskiner reaktionsblandingen på chips. Denne artikel viser, hvordan man undgår over- og undervurdering af positive partitioner. Desuden præsenterer vi en enkel procedure for indsamling dPCR produkt fra partitioner på de chips, som derefter kan bruges til at bekræfte den særlige forstærkning. Vi håber, at denne metoder betænkning vil bidrage til at fremme dPCR med metoden chip i rør i genetisk forskning.

Introduction

Kvantitativ PCR (qPCR) er ofte bruges til at kvantificere menneskelige genetiske variation, herunder enkelt nucleotid varianter (SNVs) og DNA kopi nummer variationer (CNVs). I qPCR, en polymerase reaktion er udført i hver tube på samme måde som de konventionelle end-point PCR, og en forstærkning signal er erhvervet fra røret efter hver varmecyklus. Derimod i dPCR, hvilket betyder end-point dPCR i denne rapport, PCR-blandingen er indlæst i mange mikroskopiske kamre, kaldes partitioner, hvor DNA-skabeloner er til stede eller fraværende på en begrænsende fortynding og hver partition, der indeholder PCR-blandingen er vurderet som negativ eller positiv efter komplet PCR. Mens det er let at vurdere, at der er ingen DNA skabeloner i de negative partitioner, er det uklart hvor mange kopier af DNA skabeloner er til stede i de positive partitioner. Derfor skønnes antallet af DNA skabeloner i de positive partitioner baseret på Poisson-fordelingen, ved hjælp af Grev fra negative partitioner1. dPCR er dyrere og har en mindre dynamikområde i forhold til qPCR, men denne metode giver mulighed for en absolut kvantificering og tilbyder en højere følsomhed og større præcision2.

En af de vigtigste anvendelser af dPCR er en validering af de varianter, der er identificeret af næste generation sequencing (NGS). Især ved sjældne varianter, betyder lav variant fraktioner, er validering afgørende på grund af sekventering fejl, der kan opstå i NGS3. Mens Sanger sekvensering og qPCR er nyttige værktøjer til validering af SNVs og CNVs, deres følsomhed er lav i forhold til dPCR. Derfor er dPCR teknologien i efterspørgslen efter genetiske undersøgelser beskæftiger sig med sjældne varianter. For nylig, påvisning af flydende biopsi af sjældne varianter relateret til kræft egenskaber, herunder resistens, er blevet et varmt emne i molekylær diagnostik og terapi4. DPCR teknologi synes velegnet til flydende biopsi undersøgelser og forventes at have vigtige kliniske applikationer i den nærmeste fremtid selv om forbedringer vedrører den dynamikområde og omkostningerne er stadig forpligtet til at blive gennemført.

Kommercielt tilgængelige dPCR teknologi kan groft inddeles i droplet- og chip-baserede platforme; forskellen er, hvordan DNA-skabeloner er partitioneret5,6,7. I dPCR med chip i rør format fordeles PCR-blandingen af kapillaritet i partitioner på en chip. Chipsene er bygget i otte-tube strips, som mange lab personale vil allerede være bekendt med, og således otte prøver kan behandles på én gang8. I læsning trin tager det < 1 h at behandle 96 prøver ved at afsløre hele billedet af chip og ikke hver partition. Da dPCR med formatet chip i rør har en høj produktivitet sammenlignet med andre dPCR systemer, er brugervenlighed og produktivitet de vigtigste fordele for sine brugere.

I denne betænkning, somatiske mosaicisme af APC -genet hos en patient med sporadiske familiær adenomatøs polypose er brugt som en repræsentant og resultaterne af dPCR og NGS sammenlignes. Hovedformålet med denne betænkning er at klart kvantificere en enkelt nukleotid variant bruger dPCR med formatet chip i rør. Vi håber, at denne rapport er nyttig for forskere interesseret i at vedtage dPCR platform for deres eget arbejde.

Protocol

Undersøgelse design blev godkendt af institutionelle Review bestyrelserne i Hamamatsu University School of Medicine (G-260-4). Var indhentet skriftlig informeret samtykke fra patienten og hans forældre.

1. kvalitetskontrol af genomisk DNA

Bemærk: Genomisk DNA (gDNA) blev ekstraheret fra perifert blod ved hjælp af veletablerede silica-membran-baseret DNA oprensning metode. Forud for de nedenstående procedurer, koncentrationen af gDNA blev bestemt ved hjælp af et spektrofotometer.

  1. Forberede eksemplet gDNA ved en koncentration på 10-100 ng/µL.
  2. Tilføje 10 µL DNA prøve buffer til en 8-tube strip.
  3. Tilføj 1 µL DNA ladder eller gDNA til rør. Vortex blanding i 1 minut ved hjælp af mikrotiterplade vedhæftet fil.
  4. Belastning røret, gel enhed og pipette tips til elektroforese instrument (Table of Materials) og start Kør ved at trykke på knappen 'Start'.
    Bemærk: Elektroforese systemet vil automatisk at operere med et enkelt klik på knappen Start.
  5. Bekræfte, at den lavere markør indeholdt i DNA prøvebuffer tildeles korrekt på elektroferogrammer. Hvis det er forkert tildelt, manuelt tildele markør i 'Electroherogram mode' af softwaren.
    Bemærk: DNA integritet nummer (DIN) vil automatisk blive beregnet. DIN værdi kommer fra DNA integritet. Høj og lav angiver DIN værdier meget intakt og stærkt forringede gDNA, henholdsvis.
  6. Angiv størrelse region af gDNA (> 200 bp) i 'Region mode' af software til automatisk at beregne koncentrationen af gDNA (> 200 bp).

2. primer og sonde Design

  1. Beregne de smeltende temperatur (Tm) værdier ved hjælp af en åben adgang værktøj på følgende betingelser: 10 – 25 baser, 50 mM Na+/K+, 0,80 mM dNTP'er og 3 mM Mg2 + (Tabel af materialer). Design frem og bak primere til at forstærke regionen genomisk indeholdende mål alleler med Tm værdi omkring 60 ° C og amplikon længde på 100-300 bp.
    Bemærk: Se tabel 1 for koncentrationen af oligonukleotider.
  2. Design den låste nukleinsyre (LNA) sonder til reference og variant alleler baseret på følgende betingelser: (i) 1-6 LNAs er til stede i hver sonde; (ii) et fluorescerende farvestof og en quencher er til stede på 5'- og 3'-lufthavnsbygninger af hver sonde, henholdsvis; (iii) forskellen mellem Tm værdierne af de matchede og forkerte sonder er > 10 ° C; (iv) Tm værdierne af de matchede og forkerte sonder er højere og lavere end primere, henholdsvis [fx, fremad primer: 60.8 ° C, reverse primer: 59,8 ° C, reference allel sonde (matchede/uoverensstemmende): 62.6/45.3 ° C, variant allel sonde (matchede/uoverensstemmende): 61.7/50.5 ° C]. Tm værdier beregnet ved hjælp af værktøjet åben adgang også anvendes til trin 2.1.
  3. Sikre, at designet primere og sonder ikke omfatte enkelt nucleotid polymorfier med en frekvens på > 0,1% som bestemmes fra databaser [f.eks.enkelt nukleotid polymorfisme database (dbSNP)].

3. digital PCR

  1. Forbered primere, sonder og gDNA stamopløsninger i de koncentrationer, der er beskrevet i tabel 1 med en TE buffer og gemme dem på -20-4 ° C.
  2. Bland reagenser ved stuetemperatur i en samlet maengde paa 15 µL til en endelig koncentration som beskrevet i tabel 1.
    1. Tilføje 3 µL af destilleret vand i stedet for gDNA i en no-template control (NTC).
    2. Forberede 3,5 x mængden af PCR-blandingen i tre eksemplarer for at tage højde for den pipettering fejl.
  3. Der afpipetteres PCR-blandingen op og ned for at blande det.
  4. Der lastning platform på chips bygget i 8-tube strimler og satte dem på autoloaderen. Sikre, at der er en kontakt mellem chip og indlæse platform.
  5. Passer en loading skyderen på platformen og hold skyderen med prop ud af læsseren.
  6. Der afpipetteres 15 µL PCR-blandingen på platform nær spidsen af skyderen (fig. 1A).
  7. Køre læsseren ved at trykke på knappen af loader (for ca 1 min).
    Bemærk: Det er ikke et problem, hvis en lille mængde af PCR blandingen forbliver på platformen. Det er muligt at sekventielt rerun loader.
  8. Angiv den chip-i-en-rør fyldt med PCR blanding i slidsen side af den forsegling enhancer. Skub slide-låg og kanten af det øverste øjenlåg kan ikke bryde chippen (figur 1B).
  9. Kør den forsegling forstærker (ca 2 min). Sekventielt rerun den forsegling enhancer for 1 min, hvis en pøl af væsken er stadig synlig, fordi en ufuldstændig forsegling forårsager en krydskontaminering af de positive signaler (tal 1 c og 1 D).
  10. Tilføje 230 µL af forsegling væske, en olie-baserede reagens til rør.
    Bemærk: Chips bør nu være nedsænket i væsken.
  11. Angive rør i den termiske cycler. Køre den termiske variator, som beskrevet i tabel 2 (for ca 2 h). Tune temperaturen eller varigheden af PCR, hvis der er en ujævn fordeling af positive partitioner (figur 1E).
    Bemærk: Det anbefales at indstille rampe sats til omkring 1 ° C/s.
  12. Forlade rør i den termiske cycler i mindst 15 min. til at reducere baseline støj.
    NOTE: Rør kan stå natten over så godt. Fluorescens signaler blev opdaget endnu den følgende dag.
  13. Angive rør på opdagelse jig og hæld 6 mL destilleret vand i jig. Hvis luftbobler er synlige inden for og uden for rørene, fjerne dem (tallene 1F og 1 G).
  14. Indlæse jig i detektoren og køre det med et klik på knappen 'Kør' af softwaren efter udvælgelsen af Fluorescene, forsøget og prøven/NTC faner (Tabel af materialer).
    Bemærk: Dobbelt farve påvisning af otte prøver med en standard intensitet tager ca 4-5 min.
  15. Bekræfte den holdning plot, histogram og 2D scatter plot.
    Bemærk: iIf fluorescens-intensiteten af de negative partitioner er høj, justere intensiteten med et klik på knappen Indstillinger af softwaren, så det falder inden for intervallet 30-70.
  16. Beregne den variant allel fraktion (VAF) ved hjælp af følgende formel:
    Equation 1
    Her, er Cv og Cr kopi numre af varianten og reference-allel, henholdsvis.
    Bemærk: De beregnes automatisk i programmet baseret på Poisson statistik.

4. opkrævning af PCR produkt

  1. Fjerne den forsegling væske fra røret.
  2. Tilføj 100 µL af TE buffer til glasset. Vortex kraftigt i 30 s og kortvarigt centrifuge røret.
  3. TE opløsning overføres til en anden slange og tilføje 30 µL 3 M natriumacetat og 200 µL af ethanol.
  4. Cool løsning på-20 ° C natten over.
  5. Centrifugeres løsning for 30 min på 16.000 x g og Fjern supernatanten.
  6. Tilsæt 300 µL 80% ethanol til tube og vortex.
  7. Centrifugeres løsning for 15 min på 16.000 x g og Fjern supernatanten. Tillad bundfaldet at lufttørre i 5 min.
  8. Bundfaldet oploeses i 1 – 5 µL af TE buffer efter lufttørring.
  9. Om nødvendigt vurdere produktstørrelse ved hjælp af elektroforese instrument med henvisning til trin 1. Indlæse 1 µL af løsningen på gel-enhed til en høj følsomhed (Tabel af materialer).

Representative Results

Vi gennemgik somatiske mosaicisme af APC -genet hos en patient med sporadiske familiær adenomatøs polypose efter de procedurer, der er beskrevet ovenfor. I en tidligere undersøgelse, APC c.834 + 2T > C mutationen blev fundet i patienten, men ikke i deres forældre, ved hjælp af Sanger sekvensering og NGS9. Design af primere og sonder anvendes i de repræsentative resultater er vist i tabel 3. Genomisk DNA blev udvundet af blod fra den proband, forældrene og seks raske donorer. DIN værdierne af de ni gDNA prøver varierede til 6.7-7,9 (figur 2 og tabel 4). FAM og HEX blev brugt som fluorescens farvestoffer til C og T alleler, henholdsvis. De grønne og gule pletter på position parceller repræsenterer FAM-positive og HEX-positive partitioner, henholdsvis (fig. 3A). De blå pletter repræsenterer negative partitioner for både FAM og HEX. Den sorte baggrund svarer til partitioner hvor reaktionsblandingen ikke blev tilføjet. Mange positive partitioner af C og T alleler blev opdaget i den proband, mens få positive partitioner af C-allelen blev opdaget i den proband far eller NTC, og i de sidstnævnte, positive partitioner af T allel blev ikke fundet. Signal adskillelse mellem C og T alleler var klar på den todimensionale (2D) scatterplot, og de mest positive signaler af HEX og FAM var hinanden (figur 3B). VAF af de proband var 13,2%, hvilket er lig det fedtfrie NGS (12,7%) (Tabel 4). VAFs af den proband forældre og raske donorer blev < 0,1%. Detektionsgrænsen for APC c.834 + 2T > C mutation blev anslået til at være 0,3% bruger 3 x standardafvigelsen for de gentagne målinger med 10-11 ng af de samlede gDNA10.

Amplikon størrelse i dPCR analysen til APC c.834 + 2T > C blev forudsagt for at være 123 bp. For at bekræfte, at dPCR produktet var forstærket som en enkelt band, blev dPCR produkt indsamlet fra den analyserede chip. Ved hjælp af elektroforese, en enkelt band var klart opdaget, og produktstørrelse var i overensstemmelse med forudsigelse (figur 4).

Figure 1
Figur 1 : Punkter at bemærke til dPCR analysen med chip i rør format. (A) dette panel viser hvordan man opsætter 8-tube strip i autoloaderen. (B) dette panel viser brudt chips. (C) dette panel viser, hvordan chippen overflader bare efter (i) indlæsning og (ii) forsegling. (iii) en pøl af væsken er synlige for en ufuldstændig forsegling. (D) dette panel viser holdning plot for en krydskontaminering. (E) dette panel viser handlingen holdning i forbindelse med en ujævn fordeling. (F) dette panel viser luft hvordan bobler på tube overfladen nedsænket i vand. (G) dette panel viser luftbobler inde i røret. I hele det hele tal, sort og hvid pilespidser angive brudt chip stykker og luft bobler, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentant elektroferogrammer af blod gDNA. Elektroferogrammer af blod gDNA med DIN 6,7 og 7,9 værdier er vist i den øverste og nederste panel, henholdsvis. Stjernen angiver en lavere markør. DIN: DNA integritet nummer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentative resultater af APC somatiske mosaicisme med formatet chip i rør dPCR. (A) holdning plots og (B) scatterplots af no-template control (NTC), den proband og far er vist her. HEX og FAM svarer til reference og variant alleler, henholdsvis. Lodrette og vandrette linjer angiver tærskelværdierne i HEX og FAM intensiteter, henholdsvis. Dette tal er blevet ændret fra Kahyo et al. 10. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Samling af dPCR produkter fra de analyserede chip. Produkterne, der opsamlet og koncentreret dPCR blev udsat for elektroforese. Den forudsagte Målstørrelse blev 123 bp. Dette tal er blevet ændret fra Kahyo et al. 10. NTC: no-skabelon kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Reagens Koncentration
af stamopløsningen
Volumen (μL) Endelig koncentration Anbefalet
endelig koncentration
DNase/RNase-fri destilleret vand - 1,75 - -
2 x PCR Master mix - 7.5 - -
LNA sonden for store allel 2 ΜM 0,5 66,7 nM 3.33 – 100 nM
LNA sonden for mindre allel 2 ΜM 0,5 66,7 nM 3.33 – 100 nM
Fremad primer 1 ΜM 0,5 33,3 nM 3.33 – 50,0 nM
Omvendt primer 1 ΜM 0,5 33,3 nM 3.33 – 50,0 nM
20 x dPCR løsning - 0,75 - -
gDNA 3,33 ng/μl 3 666 pg/μL 20 pg/μL – 2.000 pg/μL1

Tabel 1: reagenser, der anvendes til dPCR analysen. 1 Afhængigt af forventede præcision og følsomhed.

Trin Temperatur Tid Cykler
Indledende denaturere 95 ° C 5 m 1
Denaturere
Udglødning og udvidelse
95 ° C
58 ° C
50 s
90 s
42
Endelige udvidelse 70 ° C 5 m 1

Tabel 2: Termisk cycler betingelser.

Navn Sekvens1 Tm værdi2
Fremad primer 5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3′ 60,8 ° C
Omvendt primer 5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3′ 59,8 ° C
LNA sonde til T-allelen 5'-HEX-ATTT [EN] CCTGACCA-IBFQ-3' Matches: 62.6 ° C
Forkerte: 45.3 ° C
LNA sonde til C-allelen 5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3' Matches: 61,7 ° C
Forkerte: 50,5 ° C

Tabel 3: Design af primere og sonder. 1 Understreget og bracket breve er LNA og målrettede variant, henholdsvis. 2 Beregnet efter trin 2 i protokollen.

NGS3 dPCR4
Prøve1 Væv Input DNA (ng) DIN2 VAF (%) Variant (kopier) Reference (kopier) VAF (%)
Middelværdi RSD
NTC - - - - 1.23 0 NIELSEN NIELSEN
Proband Blod 11.3 7.6 12,7 379 2,48 x 103 13.2 0.0353
Far Blod 10.3 7.7 0.0167 1,08 3.42 x 103 0.0341 0.439
Mor Blod 10,8 7.6 0.0136 0.956 3,04 x 103 0.0313 0.637
Donor-1 Blod 11.7 7.3 - 1,64 3.01 x 103 0.0543 0.414
Donor-2 Blod 10.5 7.6 - 1,06 2,90 x 103 0.0406 0.539
Donor-3 Blod 17,6 7,9 - 4.24 5,65 x 103 0.0713 0.783
Donor-4 Blod 12.3 7.6 - 2,38 4.16 x 103 0.0666 0.557
Donor-5 Blod 19.2 7 - 1,48 6.79 x 103 0.0213 0.571
Donor-6 Blod 14.4 6.7 - 3.44 4.67 x 103 0.0728 0.729

Tabel 4: resultaterne af dPCR assay for APC somatiske mosaicisme. 1 NTC: no-skabelon kontrol; Donor: sund donor. 2 DIN: DNA integritet nummer. 3 Iwaizumi et al. 9, hum genom Var. 2 15057 (2015). 4 Forsøgene blev kørt i tredobbelt og uafhængigt gentagne 3 x; dataene, der er udtrykt som middelværdien; RSD: Relativ standardafvigelse; N/A: ikke relevant. Tabellen er blevet ændret fra Kahyo et al. 10.

Discussion

DIN værdi er ofte bruges til at vurdere beskadigede DNA (fx, gDNA fra formalin-fast paraffin-embedded væv) før kvantificering eller sekventering, fordi en avanceret nedbrydning af gDNA kan resultere i lav kvalitet data. DIN vurdering bliver således et vigtigt skridt i kvalitetskontrol af menneskelige gDNA11. Da gDNA anvendes i de repræsentative eksperiment havde været gemt ved 4 ° C for 4-11 år efter dens udvinding fra blod, blev DIN værdier bestemt for en kvalitetskontrol inden dPCR assay. Dette trin anbefales, især hvis materialerne, der er mistænkt for at være beskadiget. Koncentrationen af gDNA var endvidere bestemmes ved elektroforese. Fordi det dynamiske område af dPCR ikke er så bred som for qPCR på grund af begrænsninger af partitionerne, er en måling af gDNA koncentration et vigtigt skridt til et vellykket dPCR assay. Da mængden af input DNA var korreleret med den samlede kopi antal variant og reference alleler i dPCR assay (R-kvadreret = 0.935; Tabel 4), elektroforese er nyttige til måling af gDNA koncentration før dPCR assay.

Påfyldning og forsegling processer er vigtige skridt for succesfulde resultater. Det er afgørende at bekræfte den passende montering af PCR-blandingen på platformen og sikre kontakt mellem chip og platform (fig. 1A). Fremspring i PCR blanding fra skyderen kan forårsage ugyldig distribution på chip. Bekræfter fordelingen af positive og negative partitioner på en position plot er også nødvendige for en præcis analyse, fordi det antages i Poisson statistikker, at DNA skabeloner tilfældigt er opdelt i afdelinger1. I de repræsentative resultater, blev positive partitioner fordelt i hele chip (figur 3). Dette resultat opfylder kravet for Poisson statistikker og afspejler, at påfyldning og forsegling procedurer var effektiv. Når du rør i den forsegling enhancer, chipsene kunne brydes, hvis den centrale del af det øverste låg er skubbet kraftigt (figur 1B). For at undgå dette, forsigtigt skubbe kanten af det øverste låg. Hvis der er en kunstig klynge af positive partitioner (fig. 1D), kan eksemplarnummer overvurderes som følge af en krydskontaminering mellem partitioner. Forsegling proceduren bør forbedres, hvis en pøl af væsken er synlige på overfladen (figur 1C) (f.eks.ved at køre sekventielt den forsegling enhancer for 1 min). Hvis der er en ujævn fordeling af positive partitioner (figur 1E), kan være undervurderet kopi nummer på grund af utilstrækkelig forstærkning eller forurening af forsegling væske og vand. PCR betingelser bør justeres i dette tilfælde [f.eks.ved tuning temperaturen eller varigheden af PCR (trin 3.11 i protokollen) eller ved at sikre, at den forsegling væske og vand hældes i jig er ren]. Fluorescens signaler registreres fra 8-tube strip nedsænket i destilleret vand. Hvis luftbobler overholder tube overflade, er der mulighed for, at de kan forstyrre signal detektion (figur 1F). Bobler bør derfor ryddes ved hjælp af et værktøj, som et fint pipette tip. Derudover kan luftbobler danne inde i rørene, når de angives i jig (figur 1G). Hvis bobler inde i rørene er stor nok til at dække chippen, bør de også ryddes. Boblerne kan klare hvis de efterlades i flere minutter ved stuetemperatur.

Nogle positive partitioner kan blive opdaget i NTC. For at undgå en kontaminering af DNA skabeloner, holde bænken ren, og hvis det er muligt, gøre en rene rum med en fan filterenhed. Hvis er mistanke om en kontaminering af DNA skabeloner, grundigt rense rummet og/eller kassere de anvendte reagenser. Derimod, hvis de positive partitioner af reference-allelen ikke registreres i nærværelse af gDNA, bekræfte koncentrationer af gDNA, primere og sonder. Især, blev primere brugt ved en lavere koncentration i de repræsentative eksperiment, i forhold til konventionelle PCR (tabel 1)12. Det er også afgørende at bekræfte den rampe sats, hvilket er sjældent ændres i konventionelle PCR.

Hvad gør dPCR med formatet chip i rør unikke er partitionering af PCR-blandingen inde universal 8-tube strip8,13. En overførsel af afskærmning afdelinger ind i et PCR rør er ikke påkrævet i dette system, dermed reducere risikoen for forurening. Der er også en fordel i dPCR systemet med chip i rør format; det tager < 4 h at afslutte 96 assays i dPCR systemet, mens det tager mindst 5 h at afslutte det samme antal assays i droplet-baserede dPCR14. Desuden, den universelle 8-tube strip muliggør brug af en konventionel termisk cycler, i modsætning til en anden chip-baserede dPCR15, som kræver en termisk cycler med en flad blok. Også, den akkumulerede viden og reagenser til konventionelle PCR kan anvendes til dPCR systemet. Dette vil være nyttigt for at udvide anvendelserne af dPCR.

Det skal bemærkes, at dPCR har flere begrænsninger. I dPCR med formatet chip i rør er partitionsnummeret på chippen relativt lav sammenlignet med dem i andre dPCR platforme. Yderligere forbedring af chip-enhed vil være forpligtet til at øge det dynamiske område, der afhænger af antallet af partitioner. Fordi de indre rum af den universelle tube er begrænset, er en banebrydende design for chip-enhed forpligtet til at øge antallet af partitioner. Automatisering af proceduren for hele dPCR i fremtiden ville reducere human fejl, hvilket resulterer i endnu mere pålidelige resultater. På grund af dens høj overførselshastighed og høj følsomhed natur forventes dPCR med chip i rør format skal anvendes for at behandle et stort antal prøver til flydende biopsier og miljømæssige DNA.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af en licensbetaling for Scientific Research (C) fra Japan samfundet for fremme videnskab (JSP'ER) (nr. 15 K 08397) til Tomoaki Kahyo, og ved tilskud fra Japan Agency for medicinalforskning og udvikling (AMED) (nr. 927960719), Licensbetaling for sonderende forskning (nr. 16K 15256), udgifter til tilknyttede projekter af en ansporende særlige Budget til fremme af en National University Reform Management udgifter tilskud (nr. 1019253), og rygning Research Foundation at Haruhiko Sugimura. Forfatterne takke Dr. Iwaizumi og Dr. Kurachi for deres kliniske støtte. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i udarbejdelsen af manuskriptet. Figur 3, figur 4og tabel 4 er tilpasset og Genoptrykt fra en artikel af Kahyo et al. 10, med tilladelse fra Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAamp DNA Blood Maxi Kit Qiagen 51194 Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA
NanoDrop 1000 ThermoFisher SCIENTIFIC ND-8000 Before Protocol 1: Spectrophotometer
8-strip tube Agilent Technologies 401428 Protocol 1
Genomic DNA sample buffer Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
DNA ladder Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
MS3 Basic Small Shaker IKA 3617000 Protocol 1: Vortex mixer
Genomic DNA ScreenTape Agilent Technologies 5067-5365 Protocol 1: Gel device
2200 TapeStation system Agilent Technologies G2965AA Protocol 1: Electrophoresis instrument
TapeStation Analysis Software Agilent Technologies Bundled with G2965AA Protocol 1: Analysis software
DNA oligo primers IDT Custom order Protocol 2
LNA probes IDT Custom order Protocol 2
Software tool IDT Web site: http://biophysics.idtdna.com/ Protocol 2
dbSNP database NCBI Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Protocol 2
TE buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 12090015 Protocol 3
DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher SCIENTIFIC 10977015 Protocol 3 (Table 1)
Clarity Digital PCR Probe Mastermix JN Medsys 12013 Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix
A component of #10011
Clarity Sealing Fluid JN Medsys 12005 Protocol 3: Sealing fluid
A component of #10011
Clarity JN Solution JN Medsys 12006 Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution
A component of #10011
Clarity Tube-strip JN Medsys 12007 Protocol 3: Chip-in-a-tube
A component of #10011
Clarity Sample Loading Kit JN Medsys 12008 Protocol 3: Loading platform and slider
A component of #10011
Clarity Auto Loader JN Medsys 11002 Protocol 3: Auto loader
A component of #10001
Clarity Sealing Enhancer JN Medsys 11003 Protocol 3: Sealing enhancer
A component of #10001
Clarity Reader JN Medsys 11004 Protocol 3: Reader
A component of #10001
Life Eco Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC Protocol 3: Thermal cycler
Clarity Software JN Medsys Bundled with #10001 Protocol 3: Analysis software
High Sensitivity D1000 screen tape Agilent Technologies 5067-5584 Protocol 4: Gel device for high sensitivity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision. PLoS One. 10, (3), 0118833 (2015).
  2. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59, (6), 892-902 (2013).
  3. Chen, L., Liu, P., Evans, T. C., Ettwiller, L. M. DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science. 355, (6326), 752-756 (2017).
  4. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discovery. 6, (5), 479-491 (2016).
  5. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Analytical Chemistry. 80, (23), 8975-8981 (2008).
  6. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, (22), 8604-8610 (2011).
  7. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314, (5804), 1464-1467 (2006).
  8. Low, H., Chan, S. J., Soo, G. H., Ling, B., Tan, E. L. Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (7), 1869-1875 (2017).
  9. Iwaizumi, M., et al. A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis. Human Genome Variation. 2, 15057 (2015).
  10. Kahyo, T., et al. Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism. Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).
  11. Kanai, Y., et al. The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International. 68, (2), 63-90 (2018).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  13. Cao, L., et al. Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications. Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).
  14. Bio-Rad Laboratories. Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf (2018).
  15. Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf (2013).
Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).More

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter