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Cancer Research

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

doi: 10.3791/58199 Published: August 20, 2018

Summary

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein nützliches Werkzeug zum hochempfindlichen Nachweis von Einzel-Nukleotid und DNA-Kopie Zahl Varianten. Hier zeigen wir wichtige Überlegungen zur Messung der seltenen Varianten im menschlichen Genom mittels digitaler PCR mit dem Chip-in-Rohr-Format.

Abstract

Die Quantitative Analyse der menschlichen genetischen Variation ist entscheidend für das Verständnis der molekularen Eigenschaften des schweren Erkrankungen leiden, wie z. B. Tumoren. Da digitale Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die genaue Quantifizierung der DNA-Kopie Zahl Varianten ermöglichen, werden sie ein wesentliches Instrument zur Erkennung von seltenen genetischen Variationen, wie z.B. Medikamenten-resistenten Mutationen. Es wird erwartet, dass Molekulare Diagnostik mittels digitaler PCR (dPCR) in naher Zukunft in der klinischen Praxis verfügbar sind; so, wie man effizient dPCR mit menschlichen Erbgut durchzuführen ist ein heißes Thema. Hier stellen wir eine Methode zur Erkennung adenomatöse Polyposis coli (APC) somatische Mosaikbildung mit dPCR mit der Chip-in-Rohr-Format, das acht dPCR Reaktionen gleichzeitig durchgeführt werden kann. Beim Füllen und verschließen das Reaktionsgemisch auf den Chips ist Vorsicht geboten. Dieser Artikel veranschaulicht, wie die über- und Unterschätzung der positiven Partitionen zu vermeiden. Ausserdem stellen wir ein einfaches Verfahren zum Sammeln von dPCR Produkt von Partitionen auf die Chips, die dann verwendet werden können, um die spezifische Verstärkung zu bestätigen. Wir hoffen, dass dieser Bericht hilft die dPCR mit der Chip-in-Rohr-Methode in der genetischen Forschung zu fördern.

Introduction

Quantitative PCR (qPCR) wird häufig verwendet, um menschliche genetische Variation, darunter Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs) und DNA-Kopie Nummer Variationen (CNV) zu quantifizieren. In qPCR eine Polymerase-Reaktion wird in jedem Röhrchen auf die gleiche Weise wie bei der konventionellen Endpunkt PCR durchgeführt und eine Verstärkung Signal aus der Tube nach jedem thermischen Zyklus erworben wird. Dagegen in dPCR, d. h. Endpunkt dPCR in diesem Bericht die PCR Mischung wird geladen in vielen mikroskopisch kleinen Kammern, Partitionen bezeichnet, wo DNA-Vorlagen sind präsentieren oder fehlt eine begrenzende Verdünnung und jede Partition, die mit PCR Mischung als bewertet wird nach der vollständigen PCR positiv oder negativ. Es ist, zwar einfach zu schätzen, dass es keine DNA-Vorlagen in den negativen Partitionen ist unklar, wie viele Kopien der DNA-Templates in die positive Partitionen vorhanden sind. Daher ist die Anzahl der DNA-Vorlagen in den positiven Partitionen anhand der Poisson-Verteilung, über die Anzahl von negativen Partitionen1geschätzt. dPCR ist teurer und hat ein kleineren Dynamikbereich qPCR verglichen, aber diese Methode ermöglicht eine absolute Quantifizierung und bietet eine höhere Empfindlichkeit und größere Genauigkeit2.

Eine der Hauptanwendungen von dPCR ist die Validierung der Varianten von Next Generation Sequencing (NGS) identifiziert. Insbesondere bei seltenen Varianten, Bedeutung niedrige Variante Brüche, unbedingt Validierung durch Sequenzierung in NGS3auftretende Fehler. Während Sanger-Sequenzierung und qPCR sind nützliche Tools für die Validierung von SNVs und CNV, ihre Sensitivität ist gering im Vergleich zu dPCR. Daher ist dPCR Technologie gefragt für genetische Studien Umgang mit seltenen Varianten. Vor kurzem ist die Erkennung von flüssigen Biopsie von seltenen Varianten, die im Zusammenhang mit Krebs Eigenschaften, wie z.B. Resistenzen, ein heißes Thema in der molekularen Diagnostik und Therapie4geworden. Die dPCR Technologie für flüssigbiopsie Studien geeignet erscheint und wird voraussichtlich in naher Zukunft wichtige klinische Anwendungen haben, obwohl Verbesserungen im Zusammenhang mit der Dynamik und Kosten müssen noch umgesetzt werden.

Handelsüblichen dPCR Technologie kann grob in Tröpfchen und Chip-basierten Plattformen eingeteilt werden; der Unterschied ist wie die DNA-Templates sind partitionierte5,6,7. In der dPCR mit Chip-in-Rohr-Format ist die PCR Mischung durch die Kapillarwirkung in die Partitionen auf einem Chip verteilt. Die Chips sind in acht-Schlauch Streifen, welche viele Labormitarbeiter bereits mit vertraut werden, gebaut und somit acht Proben können zu einer Zeit8behandelt werden. In der Lesung Schritt dauert es < 1 h, 96 Proben zu behandeln, indem er das gesamte Bild des Chips und nicht jede Partition erkennt. Da dPCR mit dem Chip-in-Rohr-Format einen hohen Durchsatz im Vergleich zu anderen Systemen dPCR hat, sind Benutzerfreundlichkeit und Produktivität die wichtigsten Vorteile für die Nutzer.

In diesem Bericht somatische Mosaikbildung des APC -Gens bei einem Patienten mit sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis dient als repräsentativer Fall und die Ergebnisse der dPCR und NGS verglichen. Der Hauptzweck dieses Berichts soll eine Einzel-Nukleotid-Variante mit dPCR mit dem Chip-in-Rohr-Format eindeutig zu quantifizieren. Wir hoffen, dass dieser Bericht hilfreich für Forscher bei der Verabschiedung der dPCR Plattform für ihre eigene Arbeit interessiert ist.

Protocol

Das Design der Studie wurde von der institutionellen Review Boards von Hamamatsu University School of Medicine (G-260-4) genehmigt. Schriftliche Einwilligung wurde von den Patienten und seine Eltern eingeholt.

1. Kontrolle der Qualität von genomischer DNA

Hinweis: Genomic DNA (gDNA) wurde aus dem peripheren Blut mit der etablierten Silica-Membran-basierten DNA-Reinigung-Methode extrahiert. Im Vorfeld der der folgenden Verfahren, war die Konzentration des gDNA mit einem Spektralphotometer bestimmt.

  1. Die gDNA-Probe in einer Konzentration von 10 – 100 ng/µL vorbereiten.
  2. Fügen Sie 10 µL Probenpuffer DNA zu einem 8-Rohr-Strip.
  3. Die Röhren 1 µL DNA-Leiter oder gDNA hinzufügen. Wirbel die Mischung für 1 min mit dem Mikrotestplatte Anlage.
  4. Legen Sie das Rohr, die Gel-Gerät und Pipette Spitzen in der Elektrophorese instrument (Table of Materials) und den Durchlauf durch Drücken der Taste "Start" starten.
    Hinweis: Die Elektrophorese-System funktioniert automatisch mit einem Klick auf die Schaltfläche "Start".
  5. Bestätigen Sie, dass die untere Markierung in der DNA-Probe-Puffer enthalten korrekt auf der Electropherograms zugewiesen ist. Wenn es nicht ordnungsgemäß zugeordnet ist, manuell weisen Sie zu, die Markierung im "Electroherogram Modus" der Software.
    Hinweis: Die DNA-Integrität-Anzahl (DIN) wird automatisch berechnet. Der DIN Wert stammt aus der DNA-Integrität. Hohe und niedrige geben DIN Werte sehr intakt und stark degradierten gDNA, beziehungsweise.
  6. Geben Sie die Größe eines Bereichs von gDNA (> 200 bp) in der "Region-Modus" der Software zur automatischen Berechnung die Konzentration von gDNA (> 200 bp).

(2) Primer und Sonde Design

  1. Berechnen Sie die schmelzende (Tm)-Temperaturwerte mit einem beliebigen open-Access-Tool unter folgenden Bedingungen: 10 – 25 Basen, 50 mM Na+/+k, dNTPs 0,80 mM und 3 mM Mg2 + (Table of Materials). Entwerfen Sie die Forward- und reverse Primer, die genomische Region mit Ziel Allele mit T-m -Wert ca. 60 ° C und die Länge der Amplifikate bei 100 – 300 bp zu verstärken.
    Hinweis: Siehe Tabelle 1 für die Konzentration der Oligonukleotide.
  2. Design der verschlossene Nukleinsäure (LNA) für die Referenz und Variante Allel Sonden basiert auf den folgenden Bedingungen: (i) 1 – 6 LNAs sind in jeder Probe; (Ii) einem Fluoreszenzfarbstoff und einen Quencher befinden sich an der 5'- und 3'-Abfertigungseinrichtungen für jede Sonde bzw.; (Iii) der Unterschied zwischen den T-m -Werten der abgestimmten und nicht übereinstimmenden Sonden ist > 10 ° C; (iv) Tm -Werte der abgestimmten und nicht übereinstimmenden Sonden sind höher und niedriger als die der Primer, bzw. [z.B., forward Primer: 60,8 ° C, rückwärts-Primer: 59,8 ° C, Referenzfühler Allel (angepasst/stimmen nicht überein): 62.6/45.3 ° C, Variante Allel-Sonde (angepasst/stimmen nicht überein): 61.7/50.5 ° C]. Die T-m -Werte wurden berechnet mit dem open-Access-Tool auch für Schritt 2.1 verwendet.
  3. Sicherstellen Sie, dass die gestaltete Primer und Sonden nicht Einzel-Nukleotid-Polymorphismen mit einer Häufigkeit von > 0,1 umfassen % aus Datenbanken [z. B.die Single Nucleotide Polymorphismus-Datenbank (DbSNP)] ermittelt.

3. digitale PCR

  1. Bereiten Sie den Primer und Sonden gDNA Stammlösungen in den Konzentrationen, die in Tabelle 1 beschrieben mit einem TE-Puffer und speichern Sie diese-20 – 4 ° C.
  2. Mischen der Reagenzien bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 15 µL, eine Endkonzentration, wie in Tabelle 1 beschrieben.
    1. Fügen Sie 3 µL destilliertes Wasser anstelle von gDNA in einer keine-Template-Kontrolle (NTC).
    2. Bereiten Sie 3,5 x die Menge der PCR Mischung in dreifacher Ausfertigung zu pipettieren Fehler ausmachen.
  3. Pipette die PCR Mischung rauf und runter, um es zu mischen.
  4. Legen Sie die Ladefläche auf den Chips gebaut im 8-Rohr-Streifen und legen sie auf der Autoloader. Sicherstellen Sie, dass ein zwischen dem Chip und der Ladefläche Kontakt.
  5. Passt einen Laden-Schieberegler auf der Plattform und halten Sie den Schieberegler mit dem Stopper aus den Loader.
  6. Pipette 15 µL des PCR-Gemisches auf der Plattform in der Nähe der Spitze des Schiebers (Abb. 1A).
  7. Starten Sie den Loader durch Drücken der Taste des Laders (für ca. 1 min).
    Hinweis: Es ist kein Problem, wenn eine kleine Menge des PCR Mischung auf der Plattform bleibt. Es ist möglich, die nacheinander den Loader erneut ausführen.
  8. Legen Sie die Chip-in-a-Rohr gefüllt mit PCR Mischung an der Seite der Dichtung Enhancer. Drücken Sie die Folie Deckel und dem Rand der oberen Deckel, kein Bruch der Chip (Abbildung 1B).
  9. Führen Sie die Abdichtung Enhancer (ca. 2 min). Die Abdichtung Enhancer für 1 min erneut sequenziell ausgeführt, wenn eine Pfütze Flüssigkeit noch sichtbar ist, weil eine unvollständige Abdichtung eine Kreuzkontamination der positiven Signale (Zahlen 1 und 1 D) verursacht.
  10. Fügen Sie 230 µL Flüssigkeit, ein Öl-basierten Reagenz auf die Rohre abdichten.
    Hinweis: Die Chips sollten jetzt in die Flüssigkeit eingetaucht werden.
  11. Setzen Sie die Rohre in den Thermocycler. Führen Sie den Thermocycler, wie in Tabelle 2 (für ca. 2 h) beschrieben. Stellen Sie die Temperatur oder die Dauer der PCR ist eine ungleichmäßige Verteilung der positiven Partitionen (Abbildung 1E).
    Hinweis: Es empfiehlt sich, legen Sie die Ramp-Rate auf etwa 1 ° C/s.
  12. Verlassen Sie die Rohre in den Thermocycler für mindestens 15 Minuten um die Basislinie Rauschen zu reduzieren.
    Hinweis: Die Rohre können sowie über Nacht bleiben. Fluoreszenz-Signale wurden auch am folgenden Tag entdeckt.
  13. Legen Sie die Rohre auf die Erkennung Jig und Jig Gießen Sie 6 mL destilliertem Wasser. Wenn Luftblasen innerhalb und außerhalb der Rohre sichtbar sind, deaktivieren sie (Zahlen 1F und 1 G).
  14. Laden Sie die Vorrichtung in den Detektor und führen Sie es mit einem Klick auf die Schaltfläche "Ausführen" der Software nach der Auswahl des Fluorescene, Experiment und Probe/NTC Registerkarten (Table of Materials).
    Hinweis: Die dual Farberkennung von acht Proben mit einer Standardintensität dauert ca. 4-5 Minuten.
  15. Das positionsdiagramm, Histogramm und 2D Streudiagramm zu bestätigen.
    Hinweis: iIf der Fluoreszenzintensität der negativen Partitionen ist hoch, die Intensität, mit einem Klick auf die Schaltfläche "Einstellungen" der Software so einstellen, dass es innerhalb des Bereichs von 30 – 70 liegt.
  16. Berechnen Sie die Variante Allel Bruchteil (VAF) mithilfe der folgenden Formel:
    Equation 1
    Hier sind Lebenslauf und Cr heftnummern die Variante und die Referenz-Allel.
    Hinweis: sie werden automatisch in das Software-Programm, basierend auf Poisson Statistiken berechnet.

4. Sammlung von PCR-Produkt

  1. Entfernen Sie die Dichtung Flüssigkeit aus der Tube.
  2. Hinzu kommt das Rohr 100 µL TE-Puffer. Vortex kräftig für 30 s und kurz Zentrifuge der Röhre.
  3. Übertragen Sie die TE-Lösung auf einem anderen Gefäß und 30 µL 3 M Natriumacetat und 200 µL Ethanol.
  4. Kühlen Sie die Lösung bei-20 ° C über Nacht.
  5. Die Lösung für 30 min bei 16.000 X g Zentrifugieren und den überstand zu entfernen.
  6. Am Rohr und Wirbel 300 µL von 80 % Ethanol hinzufügen.
  7. Die Lösung für 15 min bei 16.000 X g Zentrifugieren und den überstand zu entfernen. Lassen Sie den Niederschlag 5 min an der Luft trocknen.
  8. Den Niederschlag in 1 – 5 µL TE-Puffer nach Lufttrocknung zu lösen.
  9. Falls erforderlich, bewerten Sie die Produktgröße mit einem Elektrophorese-Instrument mit Bezug auf Schritt 1. 1 µL der Lösung mit dem Gel-Gerät für eine hohe Sensitivität (Table of Materials) zu laden.

Representative Results

Wir überprüften somatische Mosaikbildung des APC -Gens bei einem Patienten mit sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis gemäß den oben beschriebenen Verfahren. In einer früheren Studie, die APC c.834 + 2 t > C Mutation fand sich bei den Patienten, aber nicht in ihrer Eltern, mit Sanger-Sequenzierung und NGS9. Die Entwürfe der Primer und Sonden verwendet in die repräsentativen Ergebnisse sind in Tabelle 3dargestellt. Genomischer DNA wurde aus dem Blut der Probanden, die Eltern und sechs gesunden Spendern gewonnen. Die DIN-Werte der neun gDNA Proben reichten bis 6,7 – 7,9 (Abbildung 2 und Tabelle 4). FAM und HEX als Fluoreszenz-Farbstoffen für die C und T Allel bzw. dienten. Die grünen und gelben Flecken auf die Position Grundstücke stellen FAM-positiv und HEX-positiven Partitionen bzw.(Abbildung 3). Die blauen Flecken sind negative Partitionen für FAM und HEX. Der schwarze Hintergrund entspricht Partitionen, wo das Reaktionsgemisch nicht hinzugefügt wurde. Viele positive Partitionen C und T Allele wurden in der Probanden nachgewiesen, während einige positive Partitionen für das C-Allel in der proband Vater oder der NTC festgestellt wurden und in den letzteren, positiven Partitionen des T Allel nicht erkannt wurden. Die Signaltrennung zwischen C und T Allele war klar auf das zweidimensionale (2D) Streudiagramm, und die meisten positiven Signale des HEX und FAM waren einander (Abbildung 3B). VAF von den Probanden war 13,2 %, das ist ähnlich wie mit NGS (12,7 %) ermittelt (Tabelle 4). Die VAFs der Probanden Eltern und gesunden Spendern waren < 0,1 %. Die Nachweisgrenze für die APC -c.834 + 2 t > C Mutation wurde auf 0,3 % geschätzt mit 3 x die Standardabweichung für die wiederholten Messungen mit 10 – 11 ng des gesamten gDNA10.

Die Größe der Amplifikate in dPCR Assay für APC c.834 + 2 t > C wurde vorhergesagt, 123 bp. Um zu bestätigen, dass das dPCR Produkt wie ein einzelnes Band verstärkt wurde, war das dPCR Produkt aus dem definierten Chip gesammelt. Elektrophorese, ein single-Band wurde klar erkannt und die Produktgröße Stand im Einklang mit der Vorhersage (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1 : Punkte, die für die dPCR Assay mit Chip-in-Rohr-Format beachten. (A) dieses Panel zeigt, wie der 8-Röhre Streifen in den Autoloader einrichten. (B) dieses Panel zeigt defekte Chips. (C) dieses Panel zeigt wie der Chip kurz nach (i) be- und (Ii) Abdichtung Oberflächen. (Iii) eine Pfütze von Flüssigkeit ist im Falle einer unvollständigen Abdichtung sichtbar. (D) dieses Panel zeigt das positionsdiagramm im Falle einer Kreuzkontamination. (E) dieses Panel zeigt das positionsdiagramm bei einer ungleichmäßigen Verteilung. (F) dieses Panel zeigt Luftblasen wie auf der Rohroberfläche in Wasser getaucht. (G) dieses Panel zeigt Luftblasen im Inneren der Röhre. Während die gesamte Figur schwarz-weiß Pfeilspitzen zeigen defekten Chip Stücke und Luftblasen, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Vertreter Electropherograms von Blut gDNA. Electropherograms von Blut gDNA mit DIN-Werten von 6,7 und 7,9 erscheinen im oberen und unteren Bereich. Das Sternchen gibt einen niedrigeren Marker. DIN: DNA-Integrität-Nummer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Repräsentative Ergebnisse der APC somatische Mosaikbildung dPCR mit dem Chip-in-Rohr-Format verwenden. (A) die Position Grundstücke und (B) Scatterplots keine-Template-Kontrolle (NTC), der proband und der Vater sind hier zu sehen. HEX und FAM entsprechen bzw. die Referenz und Variante Allel. Vertikalen und horizontale Linien zeigen die Schwellen von HEX und FAM Intensitäten, beziehungsweise. Diese Zahl wurde von Kahyo Et Al. modifiziert 10. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Sammlung von dPCR Produkte aus dem definierten Chip. Die gesammelten und konzentrierte dPCR Produkte wurden Elektrophorese unterzogen. Die prognostizierte Zielgröße war 123 bp. Diese Zahl wurde von Kahyo Et Al. modifiziert 10. NTC: keine-Template-Kontrolle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Reagenz Konzentration
der Stammlösung
Volumen (μL) Endkonzentration Empfohlen
Endkonzentration
DNase/RNase-freie destilliertes Wasser - 1.75 - -
2 x PCR Master mix - 7.5 - -
LNA-Sonde für große Allel 2 ΜM 0,5 66,7 nM 3.33 – 100 nM
LNA-Sonde für kleinere Allel 2 ΜM 0,5 66,7 nM 3.33 – 100 nM
Forward primer 1 ΜM 0,5 33,3 nM 3.33 – 50,0 nM
Rückwärts-primer 1 ΜM 0,5 33,3 nM 3.33 – 50,0 nM
20 x dPCR Lösung - 0,75 - -
gDNA 3.33 ng/μl 3 666 Pg/μL 20 Pg/μL – 2.000 Pg/μl1

Tabelle 1: Reagenzien für die dPCR Assay. 1 Je nach erwarteter Präzision und Feingefühl.

Schritt Temperatur Zeit Zyklen
Initial denaturieren 95 ° C 5 m 1
Denaturieren
Glühen und Erweiterung
95 ° C
58 ° C
50 s
90 s
42
Letzte Erweiterung 70 ° C 5 m 1

Tabelle 2: Thermocycler Bedingungen.

Name Sequenz1 Tm Wert2
Forward primer 5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3 ' 60,8 ° C
Rückwärts-primer 5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3 ' 59,8 ° C
LNA-Sonde für T Allel 5'-HEX-ATTT [A] CCTGACCA-IBFQ-3 " Abgestimmt: 62,6 ° C
Nicht übereinstimmende: 45,3 ° C
LNA-Sonde für C-Allel 5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3 " Abgestimmt: 61,7 ° C
Nicht übereinstimmende: 50,5 ° C

Tabelle 3: Gestaltung der Primer und Sonden. 1 Klammern und unterstrichenen Buchstaben sind die LNA und gezielte Variante bzw.. 2 Nach Schritt 2 des Protokolls berechnet.

NGS3 dPCR4
Beispiel1 Gewebe Eingabe DNS (ng) DIN2 VAF (%) Variante (Kopien) Referenz (Kopien) VAF (%)
Meine RSD
NTC - - - - 1.23 0 N/A N/A
Proband Blut 11.3 7.6 12.7 379 2,48 x 103 13.2 0.0353
Vater Blut 10.3 7.7 0.0167 1.08 3,42 x 103 0.0341 0.439
Mutter Blut 10.8 7.6 0.0136 0.956 3,04 x 103 0.0313 0,637
Spender-1 Blut 11.7 7.3 - 1.64 3.01 x 103 0.0543 0.414
Spender-2 Blut 10.5 7.6 - 1.06 2,90 x 103 0,0406 0.539
Spender-3 Blut 17.6 7.9 - 4.24 5,65 x 103 0.0713 0.783
Spender-4 Blut 12.3 7.6 - 2.38 4.16 x 103 0.0666 0.557
Spender-5 Blut 19.2 7 - 1,48 6,79 x 103 0.0213 0.571
Spender-6 Blut 14.4 6.7 - 3.44 4.67 x 103 0.0728 0.729

Tabelle 4: Ergebnisse der dPCR assay für APC somatische Mosaikbildung. 1 NTC: keine-Template-Kontrolle; Spender: gesunden Spenders. 2 DIN: DNA-Integrität-Nummer. 3 Iwaizumi Et al. 9, Hum Genom var. 2 15057 (2015). 4 Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und unabhängig wiederholten 3 X laufen; die Daten sind als Mittelwert ausgedrückt; RSD: relative Standardabweichung; N/a: nicht zutreffend. Die Tabelle wurde von Kahyo Et Al. modifiziert 10.

Discussion

DIN-Wert dient oft beschädigte DNA (z.B. gDNA aus Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Gewebe) vor der Quantifizierung oder Sequenzierung, zu beurteilen, da eine fortgeschrittene Schädigung der gDNA minderwertige Daten führen kann. DIN Bewertung wird somit ein wichtiger Schritt in der Qualitätskontrolle von menschlichen gDNA11. Da die gDNA in der repräsentativen Experiment verwendet 4 – 11 Jahre nach der Extraktion aus Blut bei 4 ° C aufbewahrt wurden, wurden die DIN-Werte für eine Qualitätskontrolle vor der dPCR-Assay bestimmt. Dieser Schritt ist besonders empfohlen, wenn die Materialien verdächtigt werden, beschädigt werden. Die Konzentration des gDNA wurde auch durch Elektrophorese bestimmt. Da der Dynamikbereich des dPCR nicht so breit wie für qPCR aufgrund der Einschränkungen der Partitionen ist, ist ein Maß für die Konzentration gDNA ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche dPCR Assay. Als die Menge an Eingaben DNA wurde mit der gesamtcopy Variante und Referenz Allele in der dPCR Assay korreliert (R-Quadrat = 0.935; ( Tabelle 4), Elektrophorese eignet sich zur Messung der Konzentration der gDNA vor dPCR Assay.

Das Laden und Abdichtung Prozesse sind wichtige Schritte für erfolgreiche Ergebnisse. Es ist entscheidend für die entsprechende Montage der PCR Mischung auf der Plattform zu bestätigen und sichern den Kontakt zwischen dem Chip und der Plattform (Abb. 1A). Vorwölbung des PCR Mischung aus den Schieberegler kann ungültige Verteilung auf dem Chip. Bestätigt die Verteilung der positiven und negativen Partitionen auf einem positionsdiagramm ist auch notwendig für eine genaue Analyse, da davon ausgegangen wird, in der Poisson-Statistik, dass DNA-Templates nach dem Zufallsprinzip in Kammern1unterteilt sind. In die repräsentativen Ergebnisse wurden den Chip (Abbildung 3) positive Partitionen verteilt. Dieses Ergebnis erfüllt die Anforderung Poisson Statistiken und zeigt, dass das Laden und Versiegelungsverfahren wirksam waren. Wenn die Rohre in die Abdichtung Enhancer einrichten, die Chips könnte gebrochen werden wenn der zentrale Teil der oberen Deckel zu stark gedrückt wird (Abbildung 1B). Um dies zu vermeiden, schieben Sie die Kante der oberen Deckel. Wenn es ist eine künstliche Ansammlung von positiven Partitionen (Abbildung 1-D), kann die Kopienzahl aufgrund einer Kreuzkontamination zwischen Partitionen überschätzt werden. Die Abdichtung Verfahren sollte verbessert werden, wenn eine Pfütze von Flüssigkeit auf der Oberfläche (Abbildung 1C) sichtbar ist (z. B.durch erneutes Ausführen nacheinander die Abdichtung Enhancer für 1 min). Ist eine ungleichmäßige Verteilung der positiven Partitionen (Abbildung 1E), kann die Kopienzahl aufgrund unzureichender Verstärkung oder Kontamination der Abdichtung Flüssigkeit und Wasser unterschätzt werden. Die PCR-Bedingungen sollte angepasst werden, in diesem Fall [z. B.durch tuning die Temperatur oder die Dauer der PCR (Schritt 3.11 des Protokolls), oder dadurch, dass die Abdichtung Flüssigkeit und Wasser gegossen in die Vorrichtung sauber sind]. Fluoreszenz-Signale werden von den 8-Röhre Streifen eingetaucht in destilliertem Wasser entdeckt. Wenn Luftblasen an der Rohroberfläche halten, gibt es die Möglichkeit, dass sie die Signalerkennung (Abb. 1F) eingreifen können. Daher sollte die Bläschen mit einem Tool wie eine feine PIPETTENSPITZE geklärt werden. Darüber hinaus können Luftblasen im Inneren der Rohre bilden, wenn sie in der Spannvorrichtung (Abbildung 1G) festgelegt sind. Wenn die Bläschen im Inneren der Rohre groß genug sind, um den Chip zu decken, sollten sie auch gelöscht werden. Die Bläschen können klar, wenn man sie für einige Minuten bei Raumtemperatur.

Der NTC könnte einige positive Partitionen erkannt werden. Zur Vermeidung eine Kontamination der DNA-Vorlagen halten Sie die Bank sauber zu und wenn möglich, machen Sie eine saubere Unterkunft mit einem Ventilator-Filter-Einheit. Bei auf eine Kontamination der DNA Vorlagen Verdacht gründlich reinigen Sie den Raum bzw. verwerfen Sie die verwendeten Reagenzien zu. Im Gegensatz dazu, wenn die positiven Partitionen des Referenz-Allels in Anwesenheit von gDNA nicht erkannt werden, bestätigen Sie die Konzentrationen der gDNA, Primer und Sonden. Insbesondere wurden die Primer bei einer niedrigeren Konzentration im repräsentativen Experiment, im Vergleich zu konventionellen PCR (Tabelle 1)12verwendet. Es ist auch entscheidend für die Ramp-Rate, zu bestätigen, die selten in der konventionellen PCR verändert wird.

Was dPCR mit dem Chip-in-Rohr-Format einzigartig macht, ist die Aufteilung der PCR Mischung innerhalb der universal 8-Röhre Streifen8,13. Eine Übertragung der Partitionierung Kammern in ein PCR-Röhrchen ist nicht in diesem System erforderlich, wodurch das Kontaminationsrisiko. Es gibt auch ein Vorteil im dPCR System mit Chip-in-Rohr-Format; Es dauert 4 h < bis Ende 96 Tests in diesem dPCR System, während es mindestens 5 h dauert, die gleiche Anzahl von Assays in Tröpfchen-basierte dPCR14zu beenden. Darüber hinaus ermöglicht die universelle 8-Röhre Streifen die Verwendung von einem konventionellen Thermocycler, im Gegensatz zu Chip-basierte dPCR weitere15, wonach ein Thermocycler mit einem flachen Block. Außerdem können das angesammelte Wissen und Reagenzien für die konventionelle PCR auf dPCR System angewendet werden. Dies wird für die Erweiterung der Anwendungen von dPCR hilfreich sein.

Es sei darauf hingewiesen, dass diese dPCR mehrere Einschränkungen hat. In dPCR mit dem Chip-in-Rohr-Format ist die Partitionsnummer des Chips relativ gering im Vergleich zu denen in anderen dPCR Plattformen. Weitere Verbesserung mit dem Chip-Gerät müssen den Dynamikbereich zu erhöhen, die abhängig von der Anzahl der Partitionen. Da der Innenraum der universal Röhre begrenzt ist, ist eine bahnbrechendes Design für die Chip-Gerät erforderlich, um die Anzahl der Partitionen erhöht. Die Automatisierung des gesamten dPCR Verfahrens in Zukunft würde erheblich vermindern, menschliches Versagen, was zu noch zuverlässigere Ergebnisse. Wegen seiner hohen Durchsatz und hochempfindlichen Natur soll dPCR mit Chip-in-Rohr-Format angewendet werden, um eine Anzahl von Proben für flüssigen Biopsien und Umwelt DNA zu behandeln.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Studie wurde unterstützt durch eine Beihilfe für Scientific Research (C) der Japan Society für Promotion of Science (JSPS) (Nr. 15 K 08397), Tomoaki Kahyo und Zuschüsse aus der Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) (Nr. 927960719), Beihilfe für die Explorative Forschung (Nr. 16K 15256), Ausgaben für assoziierte Projekte eines Incentive spezielle Budgets für die Förderung einer Reform der Nationaluniversität in Management Kosten Zuschüsse (Nr. 1019253) und das Rauchen Forschungsgemeinschaft Haruhiko Sugimura. Die Autoren danken Dr. Iwaizumi und Dr. Kurachi für ihre klinische Unterstützung. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Erstellung des Manuskripts. Abbildung 3 Abbildung 4und Tabelle 4 sind angepasst und nachgedruckt aus einem Artikel von Kahyo Et al. 10, mit freundlicher Genehmigung von Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAamp DNA Blood Maxi Kit Qiagen 51194 Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA
NanoDrop 1000 ThermoFisher SCIENTIFIC ND-8000 Before Protocol 1: Spectrophotometer
8-strip tube Agilent Technologies 401428 Protocol 1
Genomic DNA sample buffer Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
DNA ladder Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
MS3 Basic Small Shaker IKA 3617000 Protocol 1: Vortex mixer
Genomic DNA ScreenTape Agilent Technologies 5067-5365 Protocol 1: Gel device
2200 TapeStation system Agilent Technologies G2965AA Protocol 1: Electrophoresis instrument
TapeStation Analysis Software Agilent Technologies Bundled with G2965AA Protocol 1: Analysis software
DNA oligo primers IDT Custom order Protocol 2
LNA probes IDT Custom order Protocol 2
Software tool IDT Web site: http://biophysics.idtdna.com/ Protocol 2
dbSNP database NCBI Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Protocol 2
TE buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 12090015 Protocol 3
DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher SCIENTIFIC 10977015 Protocol 3 (Table 1)
Clarity Digital PCR Probe Mastermix JN Medsys 12013 Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix
A component of #10011
Clarity Sealing Fluid JN Medsys 12005 Protocol 3: Sealing fluid
A component of #10011
Clarity JN Solution JN Medsys 12006 Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution
A component of #10011
Clarity Tube-strip JN Medsys 12007 Protocol 3: Chip-in-a-tube
A component of #10011
Clarity Sample Loading Kit JN Medsys 12008 Protocol 3: Loading platform and slider
A component of #10011
Clarity Auto Loader JN Medsys 11002 Protocol 3: Auto loader
A component of #10001
Clarity Sealing Enhancer JN Medsys 11003 Protocol 3: Sealing enhancer
A component of #10001
Clarity Reader JN Medsys 11004 Protocol 3: Reader
A component of #10001
Life Eco Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC Protocol 3: Thermal cycler
Clarity Software JN Medsys Bundled with #10001 Protocol 3: Analysis software
High Sensitivity D1000 screen tape Agilent Technologies 5067-5584 Protocol 4: Gel device for high sensitivity

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Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format
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Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).More

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).

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