Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

Published: August 20, 2018 doi: 10.3791/58199
Automatic Translation
1, 1
1Department of Tumor Pathology, Hamamatsu University School of Medicine

Summary

תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (PCR) הוא כלי שימושי עבור גילוי רגישות גבוהה של נוקלאוטיד יחיד גרסאות ו- DNA עותק מספר גרסאות. . הנה, נדגים שיקולים מרכזיים למדידת גרסאות נדיר הגנום האנושי באמצעות PCR דיגיטלי עם התבנית שבב-ב--שפופרת.

Abstract

ניתוח כמותי של וריאציה גנטית אנושי חיוני להבנת המאפיינים המולקולריים של בעיות רפואיות רציניות, כגון גידולים. בגלל תגובות שרשרת של פולימראז דיגיטלי (PCR) לאפשר כימות מדויק של ה-DNA עותק מספר גרסאות, הם הופכים להיות כלי חיוני עבור גילוי ואריציות גנטיות נדירים, כמו מוטציות עמידים לתרופות. הוא צפוי כי האבחנות מולקולרית באמצעות PCR דיגיטלי (dPCR) יהיו זמינים הקלינית בעתיד הקרוב; לכן, כיצד לנהל ביעילות את dPCR עם החומר הגנטי האנושי הוא נושא חם. כאן, אנחנו מציגים שיטה לזיהוי קולי Adenomatous polyposis (APC) פסיפס סומאטית באמצעות dPCR עם הפורמט שבב-ב--שפופרת, אשר מאפשר תגובות dPCR שמונה להתנהל בו זמנית. כדאי לשים לב בעת מילוי ואיטום תערובת התגובה עם הצ'יפס. מאמר זה מדגים כיצד להימנע נגמר - ו underestimation של מחיצות חיובי. יתר על כן, אנו מציגים את הליך פשוט עבור איסוף המוצר dPCR המחיצות עם הצ'יפס, אשר יכול לשמש לאחר מכן כדי לאשר הגברה מסוימת. אנו מקווים כי דו ח זה שיטות יעזור לקדם את dPCR עם השיטה שבב-ב--שפופרת במחקר גנטי.

Introduction

ה-PCR כמותי (qPCR) משמש לעתים קרובות כדי לכמת וריאציה גנטית האנושי, כולל גרסאות נוקלאוטיד יחיד (SNVs) ו- DNA עותק מספר וריאציות (CNVs). ב- qPCR, תגובת פולימראז מבוצעת כל שפופרת באותה צורה כמו PCR מובילים קונבנציונאלי, אות הגברה היא רכשה מהצינור לאחר כל מחזור תרמי. לעומת זאת, ב- dPCR, כלומר dPCR מובילים בדו ח זה, התערובת PCR נטען רבים צ'יימברס מיקרוסקופיים, כינה מחיצות, היכן תבניות DNA להציג או נעדר לדילול המגביל, ואת כל מחיצה המכילה תערובת PCR מוערך כ שלילי או חיובי לאחר ה-PCR מלאה. בעוד זה קל להעריך כי ישנם אין תבניות DNA במחיצות שלילי, זה לא ברור כמה עותקים של תבניות DNA קיימים המחיצות חיובי. לכן, מספר תבניות DNA ב המחיצות חיובית מוערכת בהתבסס על התפלגות פואסון, באמצעות הרוזן מחיצות שלילי1. dPCR יקר יותר, יש טווח דינמי קטן יותר בהשוואה qPCR, אך שיטה זו מאפשרת כימות מוחלטת של ומציעה של רגישות גבוהה יותר, דיוק רב יותר2.

אחד היישומים העיקריים של dPCR היא האימות של המשתנים המזוהה על-ידי הדור הבא רצפי (הגדרות). במיוחד במקרה של גרסאות נדיר, משמעות נמוכה variant שברים, אימות חיונית עקב רצף שגיאות שעלולות להתרחש המיתרים3. בעוד סנגר רצף qPCR הם כלים שימושיים עבור האימות של SNVs ו- CNVs, הרגישות שלהם הוא נמוך בהשוואה ל- dPCR. לכן, טכנולוגיה dPCR הוא בביקוש מחקרים גנטיים התמודדות עם גרסאות נדיר. לאחרונה, הזיהוי על ידי ביופסיה נוזלי נדיר משתנים הקשורים מאפייני סרטן, כגון עמידות לתרופות, הפך נושא חם בטיפול4ואבחון מולקולרי. הטכנולוגיה dPCR מופיע מתאימים ללימודי ביופסיה נוזלי, צפויה להיות ליישומים קליניים חשובים בעתיד הקרוב, למרות שיפורים הקשורים הטווח הדינמי, עלות נדרשים עדיין ניתן ליישם.

DPCR זמין מסחרית טכנולוגיה יכולה להיות בערך מחולקת פלטפורמות מבוססות-droplet, מבוסס שבב; ההבדל הוא איך התבניות DNA הן למחיצות5,6,7. ב- dPCR השבב-ב--שפופרת בתבנית, התערובת PCR מופץ על ידי נימיות לתוך המחיצות על שבב. האסימונים מובנים. טורפדו שמונה רצועות, הצוות מעבדה רבות אשר כבר יהיה מוכר, ו, לכן, שמונה דגימות יכולים להיות מטופלים ב זמן אחד8. בשלב הקריאה, זה לוקח < h 1 לטיפול דגימות 96 על ידי גילוי של תמונה שלמה של השבב, לא כל מחיצה. מאז dPCR עם התבנית שבב-ב--שפופרת של תפוקה גבוהה בהשוואה למערכות אחרות dPCR, שימושיות ויעילות הם היתרונות העיקריים עבור המשתמשים שלה.

בדו ח זה, פסיפס סומאטית של הגן APC לחולה עם סדיר פוליפוזיס משמש נציג מקרה, התוצאות של dPCR ושל הגדרות מושווים. המטרה העיקרית של דו ח זה הוא בבירור לכמת משתנה נוקלאוטיד יחיד באמצעות dPCR עם התבנית שבב-ב--שפופרת. אנו מקווים כי דו ח זה הוא מועיל עבור חוקרים שהתעניינו באימוץ הפלטפורמה dPCR העבודה שלהם.

Protocol

תכנון המחקר אושרה על ידי לוחות סקירה המוסדי של המלונות בהם צפיתי מהפקולטה לרפואה באוניברסיטה (G-260-4). בכתב הסכמה מדעת היה המתקבלים החולה והוריו.

1. בקרת איכות של דנ א גנומי

הערה: הדנ א (gDNA) היה שחולצו מן הדם ההיקפיים בשיטת ומבוססת סיליקה-ממברנה מבוססי DNA טיהור. Advance של להלן נהלים, הריכוז של gDNA נקבע באמצעות ספקטרופוטומטרים.

  1. הכינו את הדגימה gDNA-ריכוז של 10 – 100 ng/µL.
  2. להוסיף 10 µL מאגר דגימת ה-DNA רצועת 8-שפופרת.
  3. להוסיף 1 µL של סולם הדנ א או gDNA הצינורות. מערבולת התערובת במשך 1 דקה באמצעות הקובץ המצורף microplate.
  4. טען את הצינור, ג'ל התקן פיפטה טיפים לתוך כלי אלקטרופורזה (טבלה של חומרים) ולהתחיל לרוץ על-ידי לחיצה על כפתור "התחל".
    הערה: מערכת אלקטרופורזה יפעל באופן אוטומטי בלחיצה אחת על לחצן התחל.
  5. לאשר כי בסמן התחתון הכלולים במאגר דגימת DNA מוקצה כראוי על electropherograms. אם זה מוקצה באופן שגוי, להקצות באופן ידני את סמןמצב Electroherogram"של התוכנה.
    הערה: המספר שלמות הדנ א (דין) באופן אוטומטי מחושבים. הערך דין מגיע שלמות הדנ א. גבוה ונמוך ערכי דין מציינים gDNA ומתפקד מפורק חריפה מאוד, בהתאמה.
  6. ציין את האזור בגודל gDNA (> 200 bp) ב- 'מצב האזור' של התוכנה כדי לחשב באופן אוטומטי את ריכוז gDNA (> 200 bp).

2. פריימר ועיצוב בדיקה

  1. לחשב את ערכי טמפרטורה (Tm) ההיתוך באמצעות כל כלי גישה פתוחה בתנאים הבאים: 10 – 25 בסיסים, 50 מ מ נה+/K+, dNTPs מ"מ 0.80 ו- 3 מ מ ג2 + (טבלה של חומרים). לעצב את תחל ואחורה כדי להגביר את האזור גנומית המכיל אללים היעד עם הערךm T בסביבות 60 ° C, אורך אמפליקון ב bp 100 – 300.
    הערה: עיין טבלה 1 לקבלת הריכוז של oligonucleotides.
  2. עיצוב חומצות גרעין נעול (מגבר קדם) רגשים עבור אללים הפניה וגרסא מבוסס על התנאים הבאים: (i) 1 – 6 LNAs נמצאים כל בדיקה; (ii) הפלורסנט ו כ'חטיף נוכחים-5'- ו 3'-terminuses של כל בדיקה, בהתאמה; (iii) ההבדל בין ערכיm T הגששים מתאימים, שאינם תואמים הוא > 10 ° C; (iv) ערכיm T של הגששים תואמים, לא תואמת הם גבוהות ונמוכות יותר מאלה של תחל בהתאמה [למשל, פריימר לפנים: 60.8 ° C, פריימר הפוכה: 59.8 ° C, הפניה אלל בדיקה (מתאימים/תואמים): 62.6/45.3 ° C, משתנה בדיקה אלל (מתאימים/תואמים): 61.7/50.5 ° C]. ערכיm T חושבו באמצעות הכלי גישה פתוחה לשימוש גם עבור שלב 2.1.
  3. ודא כי תחל מעוצב של הגששים לא להקיף את פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד עם תדירות של > 0.1% כפי שנקבע ממסדי [למשל, מסד הנתונים פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (dbSNP)].

3. PCR דיגיטלי

  1. להכין את צבעי בסיס, הגששים ופתרונות gDNA מניות בריכוזים המתוארות בטבלה 1 עם מאגר טה ואחסן אותם ב-20 – 4 ° C.
  2. מערבבים את ריאגנטים בטמפרטורת החדר הנפח הכולל של µL 15 כדי ריכוז הסופי כפי שמתואר בטבלה 1.
    1. להוסיף 3 µL של מים מזוקקים במקום gDNA פקד לא-תבנית (NTC).
    2. להכין 3.5 x כמות התערובת PCR שהפקידים להביא בחשבון השגיאה pipetting.
  3. Pipette את התערובת PCR מעלה ומטה כדי לערבב את הכל.
  4. הגדר פלטפורמת העמסה על גבי האסימונים נבנה ברצועת 8-שפופרת ולהעלות אותם על טוען סרטים אוטומטי. ודא כי קיים קשר בין השבב לרציף הטעינה.
  5. מתאים מחוון טעינה על פלטפורמת והחזק את המחוון עם בלם רד במטען.
  6. פיפטה µL 15 של תערובת PCR על הרציף ליד הקצה של המחוון (איור 1א').
  7. הפעל את טוען על ידי לחיצה על הלחצן של מטעין (עבור-1 דקות).
    הערה: זו לא בעיה אם כמות קטנה של תערובת PCR נשאר על הרציף. זה אפשרי ברצף הפעלה מחדש בטען.
  8. הגדר את הצ'יפ-ב--הצינור ממולא תערובת PCR בתוך החריץ בצד של משפר איטום. לדחוף את המכסה שקופית לבין הקצה של המכסה העליון לא לשבור השבב (איור 1B).
  9. הפעל את שיפור האטימה (כ- 2 דקות). ברצף הפעל מחדש את מגבר איטום 1 דקות אם שלולית נוזל עדיין גלוי בגלל איטום לא שלם גורם של זיהום צולב של האותות חיובי (דמויות 1C וד' 1).
  10. הוסף µL 230 של איטום נוזל, מגיב על בסיס שמן, את הצינורות.
    הערה: האסימונים צריכים עכשיו להיות שקוע בתוך הנוזל.
  11. להגדיר את הצינורות הצנטרפוגה תרמי. הפעל הצנטרפוגה תרמי כמפורט בטבלה מס ' 2 (עבור 2h). לכוון את הטמפרטורה או משך ה-PCR אם יש הפצה אחידה של מחיצות חיובי (איור 1E).
    הערה: מומלץ לקבוע את קצב הרמפה סביב 1 ° C/s.
  12. השאירו את הצינורות הצנטרפוגה תרמי למשך לפחות 15 דקות כדי להפחית את הרעש בסיסית.
    הערה: הצינורות ניתן יהיה להשאיר למשך הלילה גם כן. קרינה פלואורסצנטית אותות אותרו אפילו למחרת.
  13. להגדיר את הצינורות על החגיגה זיהוי ויוצקים 6 מ של מים מזוקקים לתוך החגיגה. אם בועות אוויר גלויים האחורה הצינורות, לנקות אותם (דמויות 1F ו 1 G).
  14. טען לנענע הגלאי ולהפעיל אותו באמצעות לחיצה על לחצן 'הפעל' של התוכנה לאחר בחירת כרטיסיות Fluorescene, ניסוי, דוגמת/NTC (טבלה של חומרים).
    הערה: זיהוי צבע כפול שמונה דגימות בעוצמה ברירת המחדל לוקח כ 4-5 דקות.
  15. לאשר את מיקום מגרש, היסטוגרמה עלילה פיזור 2D.
    הערה: iIf עוצמת קרינה פלואורסצנטית המחיצות שלילי גבוה, להתאים את עוצמת בלחיצה על הלחצן ' קביעות ' של התוכנה כך שהוא נופל בטווח של 30-70.
  16. לחשב את השבר אלל variant (VAF) באמצעות הנוסחה הבאה:
    Equation 1
    Cv ו- Cr הנה העתק המספרים של variant, אלל הפניה, בהתאמה.
    הערה: הם מחושבים באופן אוטומטי בתוכנית תוכנה המבוססת על סטטיסטיקה פואסון.

4. אוסף של מוצר ה-PCR

  1. הסר נוזל איטום באמצעות הרכבת התחתית.
  2. להוסיף 100 µL טה מאגר ברכבת התחתית. מערבולת נמרצות במשך 30 s ו בקצרה צנטריפוגה הצינור.
  3. להעביר את הפתרון טה צינור אחר ולהוסיף µL 30 של 3 מ' סודיום אצטט µL 200 של אתנול.
  4. מגניב הפתרון ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. Centrifuge הפתרון למשך 30 דקות ב 16,000 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
  6. להוסיף 300 µL של 80% כוהל שפופרת ואת מערבולת.
  7. Centrifuge הפתרון למשך 15 דקות ב 16,000 x g ולהסיר את תגובת שיקוע. לאפשר את התמיסה על מילה נהדרת עבור 5 דקות.
  8. להמיס את התמיסה ב- 1-5 µL טה מאגר לאחר air-drying.
  9. במידת הצורך, להעריך את גודל המוצר באמצעות מכשיר אלקטרופורזה ביחס שלב 1. לטעון µL 1 של הפתרון למכשיר ג'ל רגישות גבוהה (טבלה של חומרים).

Representative Results

אנו שנסקרו סומאטית פסיפס של הגן APC לחולה עם סדיר פוליפוזיס לפי ההליכים המתוארים לעיל. מחקר קודם, APC c.834 + 2T > מוטציה C נמצאה אצל המטופל, אך לא את ההורים שלהם, באמצעות סנגר רצף ו המיתרים9. העיצובים של תחל וזונדים המשמשים את התוצאות נציג מוצגים בטבלה3. הדנ א היה שחולצו מן הדם את proband, את ההורים ואת ששת התורמים בריא. ערכי דין הדגימות gDNA תשעה נע אל 6.7 – 7.9 (איור 2 , טבלה 4). FAM ו HEX שימשו את צבעי זריחה עבור אללים C ו- T, בהתאמה. הכתמים ירוק וצהוב על מיקום החלקות מייצגים FAM-חיוביות ומחיצת HEX-חיובית, בהתאמה (איור 3א). המקומות הכחולים מייצגים מחיצות שלילי עבור המשפחה והן הקס. הרקע השחור מקביל מחיצות איפה תערובת התגובה לא נוסף. הרבה מחיצות חיובית של אללים C ו- T אותרו ב- proband, בעוד כמה מחיצות חיובית של אלל C אותרו אבא של proband או של NTC, במחיצות האחרון, חיובי של ה-T אלל לא אותרו. האות מההפרדה בין אללים C ו- T היה ברור scatterplot דו-ממדית (2-D), ולא האותות החיובית של הקס, FAM מלבד אחד לשני (איור 3ב). VAF של proband היה 13.2%, אשר דומה לזה שנקבע באמצעות הגדרות (12.7%) (טבלה 4). VAFs של ההורים של proband ותורמים בריא היו < 0.1%. מגבלת זיהוי APC c.834 + 2T > מוטציה C נאמדת 0.3% באמצעות 3 x סטיית התקן עבור המידות חוזרות עם 10-11 ננוגרם של gDNA הכולל10.

. זה במידה אמפליקון וזמינותו dPCR APC c.834 + 2T > C נובא עליו להיות 123 bp. כדי לוודא כי המוצר dPCR היה מוגבר כלהקה יחיד, המוצר dPCR נאסף מהשבב assayed. באמצעות אלקטרופורזה, להקה אחת זוהתה בבירור, גודל המוצר היה עקבי עם התחזית (איור 4).

Figure 1
איור 1 : נקודות לציין עבור וזמינותו dPCR עם צ'יפ-ב--שפופרת בפורמט. (א) לוח זה מראה כיצד להגדיר רצועת 8-שפופרת טוען סרטים אוטומטי. (B) לוח זה מראה שבורה צ'יפס. (ג) לוח זה מראה איך משטחים השבב. בדיוק אחרי (i) וטעינה של איטום (ii). (iii) שלולית נוזל מוצגת במקרה איטום לא שלם. (D) לוח זה מציג את העלילה עמדה במקרה זיהום צולב. (E) לוח זה מציג את העלילה עמדה במקרה הפצה אחידה. (F) לוח זה מראה כמה אוויר בועות על פני השטח צינור שקוע בתוך המים. (G) לוח זה מציג בועות אוויר בתוך הצינור. לאורך כל הדמות, ראשי חץ שחור ולבן לציין שבב שבור לחתיכות, אוויר בועות, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : Electropherograms נציג של דם gDNA. Electropherograms של דם gDNA עם ערכי דין 6.7 ו- 7.9 מוצגים העליונה, בחלונית התחתונה, בהתאמה. הכוכבית מציינת בסמן התחתון. דין: ה-DNA תקינות מספר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : התוצאות נציג של APC פסיפס סומאטית באמצעות dPCR עם התבנית שבב-ב--שפופרת. (א) המיקום חלקות ו scatterplots (B) של הפקד לא-תבנית (NTC), את proband ואת האב מוצגות כאן. HEX ואת FAM תואמות הפניה וגרסא אללים, בהתאמה. קווים אנכיים ואופקיים מצביעים על הסף של עוצמות HEX ואת FAM, בהתאמה. דמות זו שונתה מ. Kahyo et al. 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : אוסף של מוצרים dPCR השבב assayed. המוצרים dPCR נאסף ומרוכז היו נענשים אלקטרופורזה. גודל היעד החזוי היה 123 bp. דמות זו שונתה מ. Kahyo et al. 10. NTC: תבנית ללא שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מגיב ריכוז
של פתרון מניות		 נפח (μL) ריכוז סופי מומלץ
ריכוז סופי
DNase/RNase ללא מים מזוקקים - 1.75 - -
2 x מיקס מאסטר PCR - 7.5 - -
מגבר קדם רגש אלל הגדולות 2 ΜM 0.5 66.7 nM 3.33-100 ננומטר
מגבר קדם בדיקה עבור קטין אלל 2 ΜM 0.5 66.7 nM 3.33-100 ננומטר
פריימר לפנים 1 ΜM 0.5 33.3 nM 3.33 – 50.0 nM
פריימר הפוכה 1 ΜM 0.5 33.3 nM 3.33 – 50.0 nM
20 x dPCR פתרון - 0.75 - -
gDNA 3.33 ng/μL 3 עמוד 666/μL pg pg/μL – 2,000 20/μL1

טבלה 1: ריאגנטים המשמש וזמינותו dPCR. 1 בהתאם הצפוי דיוק ורגישות.

שלב טמפרטורה זמן מחזורים
Denature ראשוני 95 ° C 5 מ' 1
Denature
חישול והסיומת		 95 ° C
58 ° C		 50 s
90 s		 42
סיומת הסופי 70 ° C 5 מ' 1

טבלה 2: תנאים הצנטרפוגה תרמי.

שם רצף1 Tm ערך2
פריימר לפנים 5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3′ 60.8 ° C
פריימר הפוכה 5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3′ 59.8 ° C
מגבר קדם בדיקה עבור T אלל 5'-HEX-ATTT [א]-CCTGACCA-IBFQ-3' מתאימים: 62.6 ° C
לא תואם:-45.3 ° C
מגבר קדם רגש אלל C 5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3' מתאימים: 61.7 ° C
לא תואם: 50.5 מעלות צלזיוס

טבלה 3: תכנון תחל הגששים. 1 אותיות המסומנות בקו תחתון ואת המוקף בסוגריים הם מגבר קדם יישוב משתנה, בהתאמה. 2 מחושב לפי שלב 2 של הפרוטוקול.

המיתרים3 dPCR4
דוגמה1 רקמה קלט DNA (ng) דין2 VAF (%) Variant (עותקים) הפניה (עותקים) VAF (%)
זאת אומרת RSD
NTC - - - - 1.23 0 N/A N/A
Proband דם 11.3 7.6 12.7 379 2.48 x 103 13.2 0.0353
אבא דם 10.3 7.7 0.0167 1.08 3.42 x 103 0.0341 0.439
אמא דם 10.8 7.6 0.0136 0.956 3.04 x 103 0.0313 0.637
התורם-1 דם 11.7 7.3 - 1.64 3.01 x 103 0.0543 0.414
התורם-2 דם 10.5 7.6 - 1.06 2.90 x 103 0.0406 0.539
התורם-3 דם 17.6 7.9 - 4.24 5.65 x 103 0.0713 0.783
התורם-4 דם 12.3 7.6 - 2.38 4.16 x 103 0.0666 0.557
התורם-5 דם 19.2 7 - 1.48 6.79 x 103 0.0213 0.571
התורם-6 דם 14.4 6.7 - 3.44 4.67 x 103 0.0728 0.729

בטבלה 4: תוצאות dPCR assay עבור APC פסיפס סומאטית. 1 NTC: לא-תבנית שליטה; התורם:. תורם בריא 2 דין: ה-DNA תקינות מספר. 3 . Iwaizumi et al. 9, זמזום הגנום הפונקציה var 15057 2 (2015). 4 הניסויים היו להפעיל ב- x 3 triplicate, באופן עצמאי חוזרות; הנתונים מבוטא את הערך הממוצע; RSD: סטיית תקן יחסית; N/A: לא ישים. השולחן השתנה מ. Kahyo et al. 10.

Discussion

הערך דין משמש לעתים קרובות כדי להעריך דנ"א פגום (למשל, gDNA מרקמות פורמלין-קבוע פרפין-מוטבע) לפני כימות או רצף, כי השפלה מתקדם של gDNA יכול לגרום נתונים באיכות נמוכה. הערכת דין, לפיכך, הופכת צעד חשוב בבקרת איכות של האדם gDNA11. מאז gDNA המשמשים את הניסוי נציג היה אוחסנו ב 4 ° C 4-11 שנים לאחר החילוץ שלו מהדם, ערכי דין שלו היו נחושים עבור פקד איכות לפני וזמינותו dPCR. השלב זה מומלץ במיוחד אם החומרים החשודים להינזק. הריכוז של gDNA נקבע גם על ידי אלקטרופורזה. בגלל הטווח הדינמי של dPCR אינו רחב באשר qPCR בגלל המגבלות של המחיצות, מידת הריכוז gDNA היא צעד חשוב עבור וזמינותו dPCR מוצלח. כמו כמות הקלט דנ א היה בקורלציה עם המספר הכולל עותק של אללים variant והפניה ב וזמינותו dPCR (R בריבוע = 0.935; טבלה 4), אלקטרופורזה שימושי למדידת ריכוז gDNA לפני dPCR וזמינותו.

תהליכי ההעמסה ואיטום הם שלבים חשובים עבור תוצאות מוצלחות. זה חיוני לאשר את הרכבה המתאים של תערובת PCR על פלטפורמת ולהבטיח מגע בין השבב על פלטפורמת (איור 1א'). בליטה של PCR תערובת של המחוון יכול לגרום הפצה לא חוקית על השבב. המאשר את חלוקת המחיצות חיוביים ושליליים על מגרש מיקום הוא גם הכרחי עבור ניתוח מדויק, כי ההנחה היא בסטטיסטיקה פואסון תבניות DNA הם למחיצות באקראי לתוך תאי1. בתוצאות נציג, מחיצות חיובי הופצו ברחבי השבב (איור 3). התוצאה פוגש את הדרישה הפואסונית סטטיסטיקה, ומשקף כי תהליכי ההעמסה ואיטום היו יעילים. בעת הגדרת הצינורות ' משפר האטימה, הצ'יפס יכול להישבר אם החלק המרכזי של המכסה העליון הוא דחף בכוח רב מדי (איור 1B). כדי למנוע זאת, דחף בעדינות את הקצה של המכסה העליון. אם קיים אשכול מלאכותי של מחיצות חיובי (איור 1D), המספר עותק אולי טיפשה או כתוצאה זיהום צולב בין מחיצות. ההליך איטום צריך להשתפר אם שלולית נוזל גלויה על פני השטח (איור 1C) (למשל, על ידי ברצף והרצתי את מגבר איטום 1 דקות). אם יש הפצה אחידה של מחיצות חיובי (איור 1E), המספר עותק יכול לזלזל הגברה לא מספיקות או זיהום של נוזל איטום והמים. התנאים PCR צריך להיות מותאם במקרה זה [למשל, על-ידי כיוונון הטמפרטורה או משך ה-PCR (שלב 3.11 לפרוטוקול), או על-ידי הבטחת נוזל ומים איטום נשפך לתוך החגיגה נקיות]. קרינה פלואורסצנטית אותות מזוהים מרצועת 8-צינור שקוע בתוך מים מזוקקים. אם בועות אוויר לדבוק פני השטח צינור, יש האפשרות כי הם עלולים להפריע זיהוי האות (איור 1F). לכן, בועות צריך לנקות באמצעות כלי, כגון טיפ פיפטה משובחים. בנוסף, בועות אוויר עלולה להיווצר בתוך הצינורות כאשר הן שוכנות. החגיגה (איור 1G). אם הבועות בתוך הצינורות גדול מספיק כדי לכסות את השבב, הם גם חשוד. הבועות אולי לנקות אם הן יישארו למשך מספר דקות בטמפרטורת החדר.

אולי ניתן לאתר כמה מחיצות חיובי המעבר הלאומית. כדי למנוע זיהום של תבניות DNA, לשמור על הספסל נקי ולעשות, במידת האפשר, רווח נקי עם יחידת מסנן מאוורר. אם חשוד על הכישלון של תבניות DNA, ביסודיות לנקות את השטח ו/או למחוק את ריאגנטים בשימוש. לעומת זאת, אם המחיצות חיובית של אלל הפניה לא מזוהים בנוכחות gDNA, לאמת את הריכוזים של gDNA, תחל, הגששים. ראוי לציין, תחל שימשו-ריכוז נמוך לניסוי נציג, בהשוואה ל- PCR (טבלה 1) קונבנציונאלי12. חשוב גם לאשר את קצב הרמפה, אשר לעתים נדירות היא שונה ב- PCR קונבנציונלי.

מה הופך את dPCR עם התבנית שבב-ב--צינור ייחודי הוא חלוקת התערובת PCR בתוך רצועת 8-שפופרת אוניברסלית8,13. העברה של התאים מחיצות לתוך צינור PCR לא נדרש במערכת זו, ובכך להקטין את הסיכון לזיהום. יש גם יתרון במערכת dPCR עם צ'יפ-ב--שפופרת תבנית; זה לוקח < 4 שעות כדי לסיים מבחני 96 במערכת הזאת dPCR ', בזמן זה לוקח לפחות 5 שעות כדי לסיים את אותו מספר של מבחני מבוסס-droplet dPCR14. יתר על כן, רצועת 8-שפופרת אוניברסלית מאפשר את השימוש הצנטרפוגה תרמי קונבנציונאלי, בניגוד עוד מבוססי שבב dPCR15, המחייב של הצנטרפוגה תרמי עם בלוק שטוח. בנוסף, ידע מצטבר של ריאגנטים עבור ה-PCR קונבנציונאלי ניתן להחיל על המערכת dPCR. זה יהיה מועיל להרחבת היישומים של dPCR.

יצוין, שכי dPCR יש מספר מגבלות. ב- dPCR עם התבנית שבב-ב--שפופרת, מחיצה מספר השבב הוא נמוך יחסית לעומת אלה פלטפורמות אחרות dPCR. שיפור נוסף למכשיר שבב יידרשו כדי להגדיל את טווח דינמי, התלוי מספר המחיצות. מכיוון חלל פנימי של הצינור אוניברסלי הוא מוגבל, בעיצוב פריצת דרך עבור ההתקן שבב נדרשת כדי להגדיל את מספר מחיצות. האוטומציה של ההליך כולו dPCR בעתיד יפחית במידה רבה טעות אנוש, וכתוצאה מכך תוצאות אמינות אפילו יותר. בשל טבעה תפוקה גבוהה, רגישות גבוהה, dPCR עם צ'יפ-ב--שפופרת בפורמט צפוי להיות מיושם כדי לטפל במספר דוגמאות נוזלי ביופסיות ו הדנ א איכות הסביבה.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענק של הסיוע עבור Scientific Research (C) מן האגודה יפן עבור הקידום של המדע (JSPS) (מספר 15 K 08397) כדי Tomoaki Kahyo, ועל ידי מענקים מהסוכנות יפן למחקר רפואי, פיתוח (AMED) (מספר 927960719). מענק מחקר גישוש (מס 16K 15256), הוצאות על הפרוייקטים המשויכים תקציב מיוחד תמריץ לקידום רפורמה האוניברסיטה הלאומית של ניהול הוצאות מענקים (מספר 1019253), וכן עישון מחקר לקרן הסיוע Haruhiko Sugimura. המחברים מודים ד ר Iwaizumi, ד ר Kurachi על תמיכתם קליניים. התורמים שחיים היה אין תפקיד ההכנה של כתב היד. איור 3, איור 4ו- 4 טבלה של דברים והתאמתם מתפרסם מאמר מאת Kahyo. et al. 10, באישור Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAamp DNA Blood Maxi Kit Qiagen 51194 Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA
NanoDrop 1000 ThermoFisher SCIENTIFIC ND-8000 Before Protocol 1: Spectrophotometer
8-strip tube Agilent Technologies 401428 Protocol 1
Genomic DNA sample buffer Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
DNA ladder Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
MS3 Basic Small Shaker IKA 3617000 Protocol 1: Vortex mixer
Genomic DNA ScreenTape Agilent Technologies 5067-5365 Protocol 1: Gel device
2200 TapeStation system Agilent Technologies G2965AA Protocol 1: Electrophoresis instrument
TapeStation Analysis Software Agilent Technologies Bundled with G2965AA Protocol 1: Analysis software
DNA oligo primers IDT Custom order Protocol 2
LNA probes IDT Custom order Protocol 2
Software tool IDT Web site: http://biophysics.idtdna.com/ Protocol 2
dbSNP database NCBI Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Protocol 2
TE buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 12090015 Protocol 3
DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher SCIENTIFIC 10977015 Protocol 3 (Table 1)
Clarity Digital PCR Probe Mastermix JN Medsys 12013 Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix
A component of #10011
Clarity Sealing Fluid JN Medsys 12005 Protocol 3: Sealing fluid
A component of #10011
Clarity JN Solution JN Medsys 12006 Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution
A component of #10011
Clarity Tube-strip JN Medsys 12007 Protocol 3: Chip-in-a-tube
A component of #10011
Clarity Sample Loading Kit JN Medsys 12008 Protocol 3: Loading platform and slider
A component of #10011
Clarity Auto Loader JN Medsys 11002 Protocol 3: Auto loader
A component of #10001
Clarity Sealing Enhancer JN Medsys 11003 Protocol 3: Sealing enhancer
A component of #10001
Clarity Reader JN Medsys 11004 Protocol 3: Reader
A component of #10001
Life Eco Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC Protocol 3: Thermal cycler
Clarity Software JN Medsys Bundled with #10001 Protocol 3: Analysis software
High Sensitivity D1000 screen tape Agilent Technologies 5067-5584 Protocol 4: Gel device for high sensitivity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision. PLoS One. 10 (3), 0118833 (2015).
  2. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
  3. Chen, L., Liu, P., Evans, T. C., Ettwiller, L. M. DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science. 355 (6326), 752-756 (2017).
  4. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
  5. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Analytical Chemistry. 80 (23), 8975-8981 (2008).
  6. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  7. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
  8. Low, H., Chan, S. J., Soo, G. H., Ling, B., Tan, E. L. Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1869-1875 (2017).
  9. Iwaizumi, M., et al. A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis. Human Genome Variation. 2, 15057 (2015).
  10. Kahyo, T., et al. Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism. Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).
  11. Kanai, Y., et al. The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International. 68 (2), 63-90 (2018).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  13. Cao, L., et al. Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications. Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).
  14. Bio-Rad Laboratories. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf (2018).
  15. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf (2013).

Tags

לחקר הסרטן גיליון 138 PCR דיגיטלי וריאציה גנטית אנושי אבחון מולקולרי בדיקה פלורסצנטיות עיצוב שבב-ב--שפופרת פסיפס
פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital… More

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter