Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Assay цифровой полимеразной цепной реакции для генетической вариации в спорадических семейное аденоматозное Polyposis пациента, используя формат чип в трубе

doi: 10.3791/58199 Published: August 20, 2018

Summary

Цифровая полимеразной цепной реакции (ПЦР) является полезным инструментом для обнаружения высок чувствительности единичных нуклеотидных вариантов и ДНК копирования число вариантов. Здесь мы демонстрируем ключевые соображения для измерения редкие варианты в геноме человека, используя цифровые ПЦР с форматом чип в трубе.

Abstract

Количественный анализ человеческого генетического разнообразия имеет решающее значение для понимания молекулярные характеристики серьезных заболеваний, таких как опухоли. Поскольку цифровые полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяют точное количественное определение ДНК копирования число вариантов, они становятся важным инструментом для выявления редких генетических вариаций, например резистентных мутаций. Ожидается, что молекулярные диагнозов, с использованием цифровых ПЦР (dPCR) будут доступны в клинической практике в ближайшем будущем; Таким образом как эффективно проводить dPCR с генетического материала человека является горячей темой. Здесь мы представляем метод для определения соматических мозаичностью аденоматозное polyposis coli (APC) с использованием dPCR с чип в трубе формат, который позволяет восемь dPCR реакции проводиться одновременно. Когда для наполнения и запечатки реакционную смесь на фишки следует соблюдать осторожность. Эта статья демонстрирует как избежать над - и недооценка положительных разделов. Кроме того мы представляем простой процедуры для сбора dPCR продукт из разделов на фишки, которые затем могут быть использованы для подтверждения конкретных амплификации. Мы надеемся, что этот доклад методы будут способствовать dPCR с методом чип в трубе в генетических исследованиях.

Introduction

Количественная ПЦР (ПЦР) часто используется для количественной оценки человеческого генетического разнообразия, включая единичных нуклеотидных варианты (SNVs) и ДНК копировать количество вариаций (CNVs). В ПЦР реакция полимеразы выполняется в каждой тюбике таким же образом, как и обычные концевой PCR, и усиление сигнала приобретается из трубки после каждого цикла теплового. Напротив, в dPCR, что означает конечную точку dPCR в настоящем докладе, смесь ПЦР загружается в много микроскопических камеры, называют разделы, где ДНК шаблоны представляют или отсутствовал на ограничение разрежения и каждый раздел, содержащий смесь ПЦР оценивается как отрицательный или положительный после полного ПЦР. Хотя это легко оценить, что есть нет шаблонов ДНК в отрицательных разделов, неясно, сколько копий ДНК шаблонов присутствуют в положительных разделов. Таким образом количество ДНК шаблонов в секции положительных оценивается на основании распределения Пуассона, используя счетчик от негативных разделов1. dPCR является более дорогим и имеет меньше динамический диапазон по сравнению с ПЦР, но этот метод позволяет абсолютной количественной оценки и предлагает более высокая чувствительность и большей точности2.

Одним из главных применений dPCR является проверка вариантов, определенных секвенирование нового поколения (НГС). Особенно в случае редких вариантах, смысл низкий вариант фракций, проверки важно из-за последовательности ошибок, которые могут произойти в NGS3. Хотя Сэнгер последовательности и ПЦР являются полезными инструментами для проверки SNVs и CNVs, их чувствительности является низким по сравнению с dPCR. Таким образом технология dPCR находится в спрос на генетических исследований, посвященных редких вариантах. Недавно обнаружение жидкого биопсии редких вариантов, связанных с раком характеристики, такие как лекарственной устойчивости, стал горячей темой в молекулярной диагностики и терапии4. Технология dPCR появляется подходит для исследования жидких биопсии и, как ожидается, будут иметь важные клинические приложения в ближайшем будущем, хотя улучшения, связанные с динамическим диапазоном и стоимость по-прежнему обязаны быть реализованы.

Имеющиеся dPCR технологии можно подразделить примерно капелька чип основанные и платформ; Разница заключается, как шаблоны, ДНК, секционированные5,6,7. В dPCR с чип в трубе формат смесь ПЦР распространяется действие капиллярных разделов на чипе. Чипы построены в восьми Тюбе полоски, который многие сотрудники лаборатории будет уже быть знакомы с, и, таким образом, восемь образцов могут рассматриваться один раз8. В чтении шаг он принимает < 1 h для лечения 96 образцов, обнаруживая весь образ чипа и не каждого раздела. Так как dPCR с чип в трубе формат имеет высокую пропускную способность по сравнению с другими dPCR системами, удобство использования и производительность являются ключевых преимуществ для своих пользователей.

В настоящем докладе соматические мозаичностью гена APC в пациента с спорадические семейное аденоматозное polyposis используется как представитель случай и сравниваются результаты dPCR и NGS. Основная цель настоящего доклада заключается в четко количественно единичных нуклеотидных вариант с использованием dPCR с форматом чип в трубе. Мы надеемся, что этот доклад является полезным для исследователей, заинтересованных в принятии dPCR платформу для их собственной работы.

Protocol

Дизайн исследования был одобрен институциональные наблюдательные советы Хамамацу университета Школа медицины (G-260-4). Письменное информированное согласие было получено от пациента и его родителей.

1. контроль качества геномной ДНК

Примечание: Геномной ДНК (геномная ДНК) был извлечен из периферической крови, с помощью метода очистки устоявшихся на основе кремния мембраны ДНК. Заранее ниже процедур, концентрация геномная ДНК был определен с помощью спектрофотометра.

  1. Подготовка образца геномная ДНК в концентрации 10-100 нг/мкл.
  2. 10 мкл буфер образца ДНК, в 8-трубки газа.
  3. Добавьте 1 мкл лестница ДНК или геномная ДНК в трубы. Вихрь смеси за 1 мин, с использованием Гонав вложение.
  4. Нагрузки, трубки, гель устройства и пипетки советы в инструмент электрофореза (Таблица материалов) и начать запустить, нажав на кнопку «начать».
    Примечание: Электрофорез система будет автоматически работать с одним щелчком мыши на кнопку Пуск.
  5. Подтвердите, что нижний маркер, содержащийся в буфер образца ДНК правильно назначен на electropherograms. Если он неправильно назначен, вручную назначьте маркер в «Electroherogram режим» программного обеспечения.
    Примечание: Число целостности ДНК (DIN) будут автоматически рассчитываться. DIN значение происходит из целостности ДНК. Высоких и низких DIN указывают высоко нетронутыми и сильно деградированных геномная ДНК, соответственно.
  6. Укажите размер региона геномная ДНК (> 200 bp) в «режиме региона» программного обеспечения автоматически рассчитать концентрацию геномная ДНК (> 200 bp).

2. грунтовка и Конструкция зонда

  1. Рассчитать плавления температура (mT) значения, с помощью любого инструмента открытого доступа при следующих условиях: 10 – 25 баз, 50 мм Na+/k+, дНТФ 0,80 мм и 3 мм Mg2 + (Таблица материалов). Дизайн прямого и обратного Праймеры для того чтобы усилить геномной область, содержащая целевой аллели с значениеm T около 60 ° C и amplicon длиной в 100 – 300 ВР.
    Примечание: Обратитесь к таблице 1 для концентрации олигонуклеотиды.
  2. Заблокированный нуклеиновой кислоты (LNA) датчики для ведения и вариант аллели дизайн основан на следующих условиях: (i) МШУ 1 – 6, присутствуют в каждом зонд; (ii) Люминесцентная краска и утоления присутствуют на 5'-3'-terminuses каждого зонда и соответственно; (iii отличается от значенияm T соответствующих и несоответствующих зондов > 10 ° C; (iv) Tm зонды соответствующих и несоответствующих значений выше и ниже, чем те из грунтовки, соответственно [например, вперед грунтовка: 60.8 ° C, обратной грунтовка: 59,8 ° C, ссылка аллеля зонд (соответствия/несоответствия): 62.6/45.3 ° C, вариант аллель зонд (соответствия/несоответствия): 61.7/50.5 ° C]. Значенияm T были рассчитаны с использованием инструмента открытого доступа, также используются для шага 2.1.
  3. Убедитесь, что разработанные грунты и зонды не охватывают единичных нуклеотидных полиморфизмов с частотой > 0,1% как определено из баз данных [например, одного полиморфизма нуклеотидных баз данных (dbSNP)].

3. Цифровые PCR

  1. Подготовить грунты, зонды и геномная ДНК акций решения в концентрациях, описанных в таблице 1 с буфером TE и хранить их в -20-4 ° C.
  2. Смешайте реактивы в общем объеме 15 мкл до конечной концентрации при комнатной температуре, как описано в таблице 1.
    1. 3 мкл дистиллированной воды вместо геномная ДНК, в элементе управления нет шаблон (NTC).
    2. Подготовьте 3,5 x количество смеси ПЦР в трех экземплярах для учета для дозирования ошибки.
  3. Пипетка смесь ПЦР вверх и вниз, чтобы смешать его.
  4. Установите грузовая платформа на фишки, построенный в 8-трубки газа и установите их на автопогрузчик. Убедитесь, что нет контакта между чипом и грузовая платформа.
  5. Соответствовать загрузки ползунок на платформе и удерживайте слайдер с пробкой офф загрузчик.
  6. Пипетка 15 мкл смеси ПЦР на платформе недалеко от оконечности ползунка (рис. 1А).
  7. Запуск загрузчика, нажав на кнопку загрузчик (для примерно 1 мин).
    Примечание: Это не проблема если остается небольшое количество смеси ПЦР на платформе. Это позволяет последовательно запустите загрузчик.
  8. Установите чип в в трубе заполнены с смесь ПЦР в стороне слот герметизации усилитель. Нажмите крышку слайд и краем верхней крышки не перерыв чип (рис. 1Б).
  9. Запустите герметизации усилитель (около 2 мин). Последовательно повторно герметизации усилитель 1 мин, если лужа жидкости до сих пор видны, потому что неполной герметизации вызывает перекрестное загрязнение положительный сигналах (цифры 1 c и 1 D).
  10. 230 мкл уплотняющей жидкости на масляной основе реагент, к трубкам.
    Примечание: Чипы теперь должен быть погружен в жидкость.
  11. Установка трубки в тепловая велосипедист. Запустите тепловая велосипедист, как описано в таблице 2 (около 2 ч). Настройте температуру или время ПЦР, если существует неравномерное распределение положительных перегородок (1 рисунокE).
    Примечание: Рекомендуется установить уровень рамп около 1 ° C/сек.
  12. Оставьте трубы в тепловой cycler для по крайней мере 15 минут для снижения шума базовой линии.
    Примечание: Трубы можно оставить на ночь также. Флуоресценции сигналы были обнаружены даже на следующий день.
  13. Установите трубы на джиг обнаружения и налить 6 мл дистиллированной воды в джиг. Если внутри и снаружи трубы видны пузырьки воздуха, снимите их (цифры 1F и 1 G).
  14. Загрузить джиг в детекторе и запустить его с помощью клика на кнопку «выполнить» программного обеспечения после выбора вкладки флуоресценции, эксперимент и образец/NTC (Таблица материалов).
    Примечание: Обнаружение двойной цвет восьми образцов с интенсивностью по умолчанию занимает около 4-5 мин.
  15. Подтвердите позицию сюжет, гистограммы и 2D точечная.
    Примечание: iIf интенсивности флуоресценции негативные разделов высок, отрегулировать интенсивность одним нажатием на кнопку настройки программного обеспечения, таким образом, чтобы он падает в диапазоне 30 – 70.
  16. Вычислите вариант аллеля дроби (VAF) по следующей формуле:
    Equation 1
    Здесь Cv и Cr являются числами копирования вариант и ссылка аллеля, соответственно.
    Примечание: Они автоматически рассчитывается в программе программного обеспечения, основанный на статистике Пуассона.

4. сбор продукта PCR

  1. Удаление уплотнительной жидкости из трубки.
  2. Добавьте 100 мкл буфера TE в трубку. Вихрь энергично для 30 s и кратко центрифуги трубки.
  3. TE решение передать другой трубки и добавьте 30 мкл ацетат натрия 3 М и 200 мкл этанола.
  4. Прохладный решение при-20 ° C на ночь.
  5. Центрифуга решение для 30 мин на 16000 x g и удалить супернатант.
  6. Добавьте 300 мкл 80% этанола в трубку и вихря.
  7. Центрифуга решение для 15 мин на 16000 x g и удалить супернатант. Разрешить преципитат высохнуть в течение 5 мин.
  8. Растворяют осадок в 1 – 5 мкл буфера TE после воздушной сушки.
  9. При необходимости оценить размер продукта с помощью электрофореза инструмент со ссылкой на шаге 1. Загрузите 1 мкл раствора на гель устройство для высокой чувствительности (Таблица материалов).

Representative Results

Мы рассмотрели соматических мозаичностью гена APC в пациента с спорадические семейное аденоматозное polyposis согласно процедуре, описанной выше. В предыдущем исследовании, APC c.834 + 2T > C мутации был найден в пациента, но не в их родителей, используя Сэнгер последовательности и NGS9. Конструкции праймеров и датчики, используемые в результатах представителя указаны в таблице 3. Геномная ДНК был извлечен из крови proband, родителей и шесть здоровых доноров. DIN значения девяти геномная ДНК образцов до 6,7 – 7,9 (рис. 2 и Таблица 4). FAM и HEX были использованы как флуоресценции красители для C и T аллелей, соответственно. Зеленые и желтые пятна на позицию участки представляют разделы FAM-позитивных и HEX-позитивных, соответственно (рис. 3А). Синие пятна представляют собой негативные разделов для FAM и HEX. Черный фон соответствует разделов, где реакционную смесь не был добавлен. Многие позитивные разделов C и T аллелей были обнаружены в proband, в то время как в proband отца или НПС были обнаружены несколько положительных разделов аллеля C и, в последний, позитивные перегородки T аллелей не были обнаружены. Разделения сигнала между аллели C и T было ясно на двумерные (2-D) рассеяния, и были наиболее позитивные сигналы HEX и FAM включают друг друга (рис. 3B). VAF из proband был 13,2%, который аналогичен определяется с использованием NGS (12,7%) (Таблица 4). VAFs proband родителей и здоровых доноров были < 0,1%. Предел обнаружения для APC c.834 + 2T > C мутации составил 0,3%, с использованием 3 x стандартное отклонение для повторных измерений с 10-11 нг геномная ДНК всего10.

Ампликон размер в dPCR assay для APC c.834 + 2T > C было предсказано быть 123 bp. Чтобы убедиться, что продукт dPCR был усилен как одну группу, продукт dPCR была собрана из Оксиметрический анализ чип. С помощью электрофореза, однодиапазонный явно был обнаружен, и размер продукта соответствует прогнозирования (рис. 4).

Figure 1
Рисунок 1 : Моменты для dPCR assay с чип в трубе формате. (A) Эта группа показывает как настроить 8-трубки газа в автопогрузчик. (B) Эта группа показывает сломанной чипов. (C) Эта панель показывает, как чип поверхности сразу после (i) загрузки и (ii) уплотнения. (iii) луже жидкости является видимым в случае неполной герметизации. (D) Эта группа показывает позицию печати в случае перекрестного загрязнения. (E) Эта группа показывает позицию печати в случае неравномерного распределения. (F) Эта панель показывает как воздушные пузырьки на поверхности трубы погружен в воду. (G) Эта группа показывает пузырьки воздуха внутри трубки. На протяжении всей фигуры черно-белые стрелки указывают на куски сломанной чип и воздушные пузыри, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель electropherograms крови геномная ДНК. Electropherograms крови геномная ДНК с DIN значения 6.7 и 7,9 отображаются в верхней и нижней панели, соответственно. Звездочка указывает нижний маркер. Дин: Номер целостности ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Представитель результаты APC соматических мозаичностью с использованием dPCR с чип в трубе формате. (A) положения участков и (B) scatterplots без шаблон управления (ПНС), proband и отец приведены здесь. ШЕСТИГРАННЫЕ и FAM соответствуют ссылки и вариант аллелей, соответственно. Вертикальные и горизонтальные линии указывают пороговые значения HEX и FAM света, соответственно. Этот показатель был изменен с Kahyo и др. 10. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Коллекция dPCR изделий из Оксиметрический анализ чип. Собранные и концентрированные dPCR продукции были подвергнуты электрофореза. Предсказал целевого размера был 123 bp. Этот показатель был изменен с Kahyo и др. 10. НПС: без шаблон элемента управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Реагент Концентрация
запасов решения
Объем (мкл) Конечная концентрация Рекомендуется
конечная концентрация
DNase/РНКазы бесплатная дистиллированная вода - 1.75 - -
2 x ПЦР Мастер микс - 7.5 - -
МШУ зонд для крупных аллеля 2 МКМ 0.5 66,7 Нм 3,33 – 100 Нм
МШУ зонд для незначительных аллеля 2 МКМ 0.5 66,7 Нм 3,33 – 100 Нм
Форвард грунтовка 1 МКМ 0.5 33.3 Нм 3,33 – 50,0 Нм
Обратный грунтовка 1 МКМ 0.5 33.3 Нм 3,33 – 50,0 Нм
20 x dPCR раствор - 0.75 - -
Геномная ДНК 3,33 нг/мкл 3 666 pg/мкл 20 ПГ/мкл – 2000 ПГ/мкл1

Таблица 1: Реагенты используемые для dPCR assay. 1 В зависимости от ожидаемого точностью и чувствительностью.

Шаг Температура Время Циклы
Денатурируйте первоначальный 95 ° C 5 m 1
Денатурируйте
Отжиг и расширение
95 ° C
58 ° C
50 s
90 s
42
Окончательное расширение 70 ° C 5 m 1

Таблица 2: Тепловая велосипедист условий.

Имя Последовательности1 Значениеm T2
Форвард грунтовка 5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3′ 60,8 ° C
Обратный грунтовка 5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3′ 59,8 ° C
МШУ зонд для аллель T 5'-HEX-АТТТ [] CCTGACCA-IBFQ-3' Соответствие: 62.6 ° C
Несоответствие: 45.3 ° C
МШУ зонд для аллеля C 5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3' Соответствие: 61.7 ° C
Несоответствие: 50,5 ° C

Таблица 3: дизайн праймеров и зонды. 1 Квадратные скобки и подчеркиванием буквы являются МШУ и целевой вариант, соответственно. 2 Рассчитано по данным шаг 2 протокола.

NGS3 dPCR4
Пример1 Ткани Ввод ДНК (НГ) DIN2 VAF (%) Вариант (копий) Ссылка (копий) VAF (%)
Среднее RSD
NTC - - - - 1.23 0 Н/Д Н/Д
Proband Кровь 11.3 7.6 12.7 379 2.48 x 103 13.2 0.0353
Отец Кровь 10.3 7.7 0.0167 1.08 3,42 x 103 0.0341 0.439
Мать Кровь 10.8 7.6 0,0136 0.956 3.04 x 103 0.0313 0.637
Доноры-1 Кровь 11.7 7.3 - 1.64 3.01 x 103 0.0543 0.414
Доноры-2 Кровь 10.5 7.6 - 1.06 2,90 х 103 0.0406 0.539
Доноры-3 Кровь 17,6 7.9 - 4.24 5,65 х 103 0.0713 0.783
Доноры-4 Кровь 12.3 7.6 - 2.38 4.16 x 103 0,0666 0.557
Доноры-5 Кровь 19.2 7 - 1.48 6.79 x 103 0.0213 0.571
Доноры-6 Кровь 14.4 6.7 - 3.44 4,67 x 103 0.0728 0,729

Таблица 4: результаты dPCR анализа для APC соматических мозаичностью. 1 НПС: без шаблон элемента управления; Донор: здоровых доноров. 2 Дин: Номер целостности ДНК. 3 Iwaizumi и др. 9, hum генома Var. 2 15057 (2015). 4 Эксперименты были проведены в трех экземплярах и самостоятельно неоднократные 3 x; Данные выражаются как среднее значение; RSD: относительная стандартное отклонение; Н/д: не применяется. Таблица была изменена от Kahyo и др. 10.

Discussion

DIN значение часто используется для оценки поврежденной ДНК (например, геномная ДНК от формалин Исправлена парафин врезанных тканей) до количественной или последовательности, поскольку расширенные деградации геномная ДНК может привести к низкого качества данных. DIN оценки таким образом, становится важным шагом в контроле качества человека геномная ДНК11. Так как геномная ДНК, используемые в представитель эксперимента хранился при температуре 4 ° C для 4-11 лет после его извлечения из крови, ее DIN значения были определены для контроля качества перед dPCR assay. Этот шаг особенно рекомендуется если материалы предположительно быть повреждены. Концентрация геномная ДНК также определяется электрофореза. Поскольку динамический диапазон dPCR не так велик, как для ПЦР из-за ограничений разделов, измерение концентрации геномная ДНК является важным шагом для успешного dPCR assay. Как количество входных данных ДНК коррелировалось с полной копией количество вариант и ссылка аллелей в dPCR assay (R-квадрат = 0.935; Таблица 4), электрофорез полезен для измерения концентрации геномная ДНК до dPCR assay.

Загрузка и герметизации процессы являются важные шаги для достижения успешных результатов. Важно подтвердить соответствующие монтажные смеси ПЦР на платформе и обеспечить контакт между чипа и платформы (рис. 1А). Выступ ПЦР смеси от ползунка может вызвать недопустимый распределения на чипе. Подтверждающий распределение положительные и отрицательные разделов на участке позиции необходима также для точного анализа, потому что в Poisson статистики предполагается, что шаблоны ДНК случайным образом разделена на камеры1. В результатах представительных позитивные разделы были распространены во всем чип (рис. 3). Этот результат удовлетворяет потребность в статистике Пуассона и отражает, что загрузка и герметизации процедуры являются эффективными. При задании трубы в герметизации enhancer, чипы можно разорвать, если слишком сильно толкнул Центральная часть верхней крышки (рис. 1Б). Чтобы избежать этого, аккуратно вставьте край верхней крышки. Если есть искусственные кластер положительных разделов (рис. 1D), номер копии может переоценить из-за перекрестного загрязнения между разделами. Уплотнение процедуры следует улучшить, если лужа жидкости видна на поверхности (рис. 1C) (например, путем последовательного перезапуска герметизации усилитель 1 мин). В случае неравномерного распределения положительных разделов (Рисунок 1E), копия номер может быть недооценена вследствие недостаточной усиления или загрязнение уплотнительной жидкости и воды. Условия PCR должна быть скорректирована в данном случае [например, путем настройки температуры или продолжительность ПЦР (шаг 3.11 Протокола), или путем обеспечения чистой уплотнительной жидкости и заливали воду в джиг]. Флуоресценции сигналы обнаружены от 8-трубки газа в дистиллированной воде. Если пузырьки воздуха присоединиться к поверхности трубы, существует возможность, что они могут мешать обнаружения сигнала (Рисунок 1F). Таким образом пузыри должны быть очищены с помощью инструмента, как кончик тонкой пипеткой. Кроме того воздушные пузыри могут образовывать внутри трубы, когда они установлены в джиг (рис. 1G). Если пузыри внутри трубы являются достаточно большими, чтобы покрыть чип, они также должны быть очищены. Пузыри могут снять, если они оставили на несколько минут при комнатной температуре.

Некоторые позитивные перегородки могут быть обнаружены в НПС. Чтобы избежать загрязнения шаблоны ДНК, чистоту скамейке и, если возможно, сделать чистое пространство с блоком фильтра вентилятора. При подозрении на заражение ДНК шаблонов, тщательно очистить пространство и/или отменить используются реагенты. Напротив если позитивные разделы аллеля ссылка не обнаруживаются при наличии геномная ДНК, подтвердите концентрации геномная ДНК, грунтовки и зонды. В частности праймеры использовались на более низкой концентрации в представитель эксперимента, по сравнению с обычными ПЦР (Таблица 1)12. Важно также подтвердить уровень пандуса, который редко меняется в обычных ПЦР.

Что делает dPCR с чип в трубе формат уникальным является секционирование смеси ПЦР внутри универсальный 8-трубки газа8,13. Передача перегородки камер в ПЦР-пробирку не требуется в этой системе, тем самым уменьшая риск загрязнения. Существует также является преимуществом в системе dPCR с чип в трубе формат; Он принимает < 4 ч до конца 96 анализов в этой системе dPCR, в то время как он занимает по меньшей мере 5 h закончить одинаковое количество анализов на основе капелька dPCR14. Кроме того универсальный 8-трубки газа позволяет использовать обычные тепловая велосипедист, в отличие от другого на основе чипа dPCR15, который требует тепловая велосипедист с блоком плоских. Кроме того накопленные знания и реагенты для обычных ПЦР может применяться к системе dPCR. Это будет полезно для расширения приложений dPCR.

Следует отметить, что dPCR имеет несколько ограничений. В dPCR с форматом чип в метро номер раздела чип является относительно низким по сравнению с теми, кто в других платформах dPCR. Дальнейшее улучшение чип устройство будет необходимо увеличить динамический диапазон, который зависит от количества секций. Потому, что внутреннее пространство универсальные трубки является ограниченным, инновационный дизайн для чипа устройства требуется увеличить количество секций. Автоматизации всего dPCR процедуры в будущем значительно уменьшит человеческой ошибки, что приводит к еще более надежные результаты. Ожидается, что по причине своей высокой пропускной способности и высокой чувствительностью, dPCR с чип в трубе формат применяться для лечения ряда образцов для жидких биопсии и экологические ДНК.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано субсидий для Scientific Research (C) от японского общества для поощрения науки (JSP) (№ 15 K 08397) чтобы Томоаки Kahyo и на гранты от агентства Японии для медицинских исследований и развития (AMED) (№ 927960719), Субсидий для поисковых исследований (№ 16K 15256), расходы для соответствующих проектов стимулирования специального бюджета для продвижения реформы национального университета управления расходы грантов (№ 1019253), и для некурящих исследовательский фонд, чтобы Haruhiko Sugimura. Авторы благодарят за их клинической поддержки д-р Iwaizumi и д-р Kurachi. Спонсоры имел никакой роли в подготовке рукописи. Рисунок 3 Рисунок 4и Таблица 4 адаптированы и перепечатано из статьи, Kahyo и др. 10, с разрешения Elsevier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAamp DNA Blood Maxi Kit Qiagen 51194 Before Protocol 1: Extraction of genomic DNA
NanoDrop 1000 ThermoFisher SCIENTIFIC ND-8000 Before Protocol 1: Spectrophotometer
8-strip tube Agilent Technologies 401428 Protocol 1
Genomic DNA sample buffer Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
DNA ladder Agilent Technologies 5067-5366 Protocol 1:
A component of Genomic DNA Screen Tape Assay
MS3 Basic Small Shaker IKA 3617000 Protocol 1: Vortex mixer
Genomic DNA ScreenTape Agilent Technologies 5067-5365 Protocol 1: Gel device
2200 TapeStation system Agilent Technologies G2965AA Protocol 1: Electrophoresis instrument
TapeStation Analysis Software Agilent Technologies Bundled with G2965AA Protocol 1: Analysis software
DNA oligo primers IDT Custom order Protocol 2
LNA probes IDT Custom order Protocol 2
Software tool IDT Web site: http://biophysics.idtdna.com/ Protocol 2
dbSNP database NCBI Web site: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Protocol 2
TE buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 12090015 Protocol 3
DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher SCIENTIFIC 10977015 Protocol 3 (Table 1)
Clarity Digital PCR Probe Mastermix JN Medsys 12013 Protocol 3 (Table 1): 2xPCR Master Mix
A component of #10011
Clarity Sealing Fluid JN Medsys 12005 Protocol 3: Sealing fluid
A component of #10011
Clarity JN Solution JN Medsys 12006 Protocol 3 (Table 1): 20xdPCR solution
A component of #10011
Clarity Tube-strip JN Medsys 12007 Protocol 3: Chip-in-a-tube
A component of #10011
Clarity Sample Loading Kit JN Medsys 12008 Protocol 3: Loading platform and slider
A component of #10011
Clarity Auto Loader JN Medsys 11002 Protocol 3: Auto loader
A component of #10001
Clarity Sealing Enhancer JN Medsys 11003 Protocol 3: Sealing enhancer
A component of #10001
Clarity Reader JN Medsys 11004 Protocol 3: Reader
A component of #10001
Life Eco Thermal Cycler Bioer Technology TC-96GHbC Protocol 3: Thermal cycler
Clarity Software JN Medsys Bundled with #10001 Protocol 3: Analysis software
High Sensitivity D1000 screen tape Agilent Technologies 5067-5584 Protocol 4: Gel device for high sensitivity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision. PLoS One. 10, (3), 0118833 (2015).
  2. Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59, (6), 892-902 (2013).
  3. Chen, L., Liu, P., Evans, T. C., Ettwiller, L. M. DNA damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science. 355, (6326), 752-756 (2017).
  4. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discovery. 6, (5), 479-491 (2016).
  5. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Analytical Chemistry. 80, (23), 8975-8981 (2008).
  6. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, (22), 8604-8610 (2011).
  7. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314, (5804), 1464-1467 (2006).
  8. Low, H., Chan, S. J., Soo, G. H., Ling, B., Tan, E. L. Clarity™ digital PCR system: a novel platform for absolute quantification of nucleic acids. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, (7), 1869-1875 (2017).
  9. Iwaizumi, M., et al. A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis. Human Genome Variation. 2, 15057 (2015).
  10. Kahyo, T., et al. Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism. Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).
  11. Kanai, Y., et al. The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses. Pathology International. 68, (2), 63-90 (2018).
  12. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  13. Cao, L., et al. Advances in digital polymerase chain reaction (dPCR) and its emerging biomedical applications. Biosensors and Bioelectronics. 90, 459-474 (2017).
  14. Bio-Rad Laboratories. Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/Isr/literature/Bulletin_6311.pdf (2018).
  15. Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.garvan.org.au/research/capabilities/molecular-genetics/documents/qs-3d-user-guide.pdf (2013).
Assay цифровой полимеразной цепной реакции для генетической вариации в спорадических семейное аденоматозное Polyposis пациента, используя формат чип в трубе
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).More

Kahyo, T., Sugimura, H. Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format. J. Vis. Exp. (138), e58199, doi:10.3791/58199 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter