Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een High-throughput Platform voor de Screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection, Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

Salmonella spp. /Shigella spp. zijn gemeenschappelijke ziekteverwekkers toegeschreven aan diarree. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer platform voor de screening van Salmonella spp. /Shigella spp. PCR in real time te gebruiken in combinatie met begeleide cultuur.

Abstract

Fecaal-orale transmissie van acute gastro-enteritis gebeurt van tijd tot tijd, vooral wanneer mensen behandeld voedsel en water zijn besmet door Salmonella spp.,/Shigella spp. De methode van de gouden standaard voor het opsporen van Salmonella spp.,/Shigella spp. is directe cultuur, maar dit is arbeidsintensief en tijdrovend. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer platform voor Salmonella spp./Shigella spp. screening, met behulp van real-time polymerasekettingreactie (PCR) in combinatie met begeleide cultuur. Er zijn twee belangrijke fasen: PCR in real time en de begeleide cultuur. Voor de eerste fase (real-time PCR), leggen we elke stap van de methode: proeven collectie, vóór verrijking, DNA-extractie en PCR in real time. Als de real-time PCR-resultaat positief is, dan de tweede fase (begeleide cultuur) wordt uitgevoerd: selectieve cultuur, biochemische identificatie en karakterisering van de serologische. We illustreren ook representatieve resultaten gegenereerd op basis van het. Het protocol beschreven hier zou een waardevol platform voor de snelle, specifieke, gevoelige en high-throughput screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Introduction

Diarree is nog steeds een gemeenschappelijk probleem voor de volksgezondheid met een hoge incidentie tarief wereldwijd1,2. Hoewel de sterfte relatief laag is, sommige patiënten tonen verschillende symptomen voor weken (zoals losse en waterige ontlasting, een urgentie te gaan naar de badkamer), waardoor de socio-economische impact zeer hoog3,4. Erger nog, sommige patiënten kunnen zelfs het ontwikkelen van Prikkelbare darmsyndroom indien verlaten onbehandeld5. Er zijn verschillende soorten bacteriën, virussen en parasieten die leiden diarree6 tot kunnen. Salmonella spp. /Shigella spp. behoren tot de meest voorkomende bacteriën voordeoverdracht van acute gastro-enteritis7,8,9,10,11. Daarom veel provincies hebben afgegeven wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen voor regelmatige Salmonella spp. /Shigella spp. screenen bij mensen die voedsel en water zou behandelen. Bijvoorbeeld, de Chinese regering wetten voor verplichte Salmonella spp. hebben uitgegeven /Shigella spp. screening eenmaal per jaar.

De methode van de gouden standaard voor Salmonella spp. /Shigella spp. detectie is bacteriën cultuur. Door bacteriën cultuur en opeenvolgende biochemische identificatie en serologische karakterisatie, kunnen we identificeren van de soorten van bacteriën, die zou kunnen vergemakkelijken, beheer van de uitbraak van de ziekte en antimicrobiële profiling steun van de behandeling van patiënten 12. het kan ook helpen met het traceren van de bron van besmetting tijdens de Salmonella spp. /Shigella spp. uitbraak13. Deze methode is echter arbeidsintensieve (vereisen handmatige bediening) en tijdrovend (rekening met enkele dagen), met name voor het testen van grote aantallen monsters7. Bovendien, levensvatbare maar niet-culturable (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spp.kunnen bestaan in sommige kruk monsters14. Met het oog op deze nadelen, veel laboratoria hebben geprobeerd te ontwikkelen van nieuwe technieken voor het opsporen van Salmonella spp. /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. al deze methoden gebruiken de nucleaire zure amplificatie test (NAAT), waaronder de polymerase-kettingreactie (PCR) de meest voorkomende is. Een belangrijke beperking van deze methoden NAAT gebaseerd is dat dode bacteriën, zelfs bacteriële puin met onvolledige genomic DNA, kon laten zien positieve resultaten26, die grotendeels de accurate diagnose van de ziekte kunnen beïnvloeden. Blanco et al. toonde dat moleculaire assay is hoogst-gevoelig, niet alleen voor levensvatbare Salmonella in culturen, maar ook voor gedeeltelijke genomen en dode of niet-levensvatbare bacteriën uit verleden infecties of besmetting26. Daarom moet nieuwe technologie worden ontwikkeld.

We beschreven hier, een nieuwe methode dat combineert de NAAT gebaseerd methode en kweken. Zoals blijkt uit Figuur 1, deze nieuwe methode geldt screening van de eerste PCR in real time en dan positieve monsters voor bacteriën cultuur en identificatie worden verzonden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het protocol volgt de richtsnoeren van de ethische commissie van de menselijke onderzoek van Zhuhai International Travel gezondheidszorg Center. Gebruik steriele standaardwerking tijdens het experiment.

1. voedingsbodems samenstelling en voorbereiding

  1. Nutrient Broth bereiden: Los 1% pepton, 0,3% rundvlees extract, 0,5% keukenzout, 0,1% glucose in H2O en breng pH 7.5 en autoclaaf in 121 ° C gedurende 15 minuten.
  2. Seleniet Cystine medium bereiden: Los 0,5% pepton, 0,4% lactose, 1% Na2HCO3, 0,4% waterstof Natriumseleniet, 0,001% L-Cystine in H2O, breng pH op 7.0 en koken voor 5 min.
  3. Bereiden de Xylose, Lysine, Deoxycholate agarplaat (XLD): Los 0,3% gistextract, 0,5% L-lysine 0.375% xylose, 0,75% lactose, 0,75% sucrose, 0,5% natriumchloride, 0,008% fenol rood, 0,68% natrium thiosulfate, 0,08% ijzer(III) ammoniumcitraat, 0,25% natrium deoxycholate, 1,5% agar in H2O, en breng de pH aan 7.4. Vervolgens gedurende 5 minuten koken en giet het in 90 mm platen.
  4. De Salmonella chromogenic agarplaat bereiden: los van 1,5% agar, 0,7% pepton en gist extract, 1.29% selectief reagens in de H2O. Vervolgens gedurende 5 minuten koken en giet het in 90 mm platen.
  5. De plaat nutriëntagar bereiden: Los 1% pepton, 0,3% rundvlees extract, 0,5% natriumchloride, 1,5% agar in H2O en breng pH op 7.3. Vervolgens autoclaaf in 121 ° C gedurende 15 minuten staan en giet het in 90 mm platen.
  6. Voorbereiden van de MacConkey-agarplaat (MAC): los 2% pepton, 1% lactose, 0,5% natriumchloride, 0,5% OX Bile Salt, 0.0025% neutraal rood, 1,5% agar, 0,0001% kristalviolet in H2O en breng pH op 7,2. Vervolgens autoclaaf in 115 ° C gedurende 20 min en giet het in 90 mm platen.

2. real-time PCR

  1. Sample collectie
    1. Een anale swab invoegen van de patiënt anus 3-5 cm diep, en draaien 360° rondom.
    2. De anale swab gestoken in een steriele collectie buis. Mark monster ID.
    3. Het monster zo spoedig mogelijk naar laboratorium verzenden.
      Opmerking: Monsters kunnen worden bewaard bij 4 ° C gedurende ten hoogste 24 uur.
  2. Pre verrijking
    1. Voeg 3 mL Bouillon van de nutriënten in elk monster in de buis van de collectie.
    2. Incubeer bij 36 ° C gedurende 6 uur in een broedmachine.
  3. Monster mengen (optioneel)
    1. Verzamelen van 100 µL van iedere cultuur pre verrijking en meng 8-10 monsters 1 monster in een 1,5 mL-buis als er meer dan 10 monsters.
    2. Goed markeren.
  4. DNA-extractie
    1. Centrifugeer de cultuur van de pre verrijking bij 800 x g gedurende 2 min om grote deeltjes te settelen, en overdracht de bovendrijvende substantie aan een nieuwe buis en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant door aspiratie.
    2. Voeg 100 µL van DNA extractieoplossing (0,01 M pH 8,0 Tris-EDTA, 0,01% Nonidet P 40 (NP40)) naar de pellet. Vortex krachtig gedurende 1 minuut.
    3. Koken bij 100 ° C gedurende 5 minuten op een droge bad.
    4. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 5 min. verzamelen de bovendrijvende vloeistof met behulp van een nieuwe buis, die de sjabloon voor de daaropvolgende analyse voor real-time PCR zullen.
  5. PCR in real time
    1. Instellen van het reactiemengsel als volg: voor elk monster, 12,5 µL van 2 x reactiemengsel 0.4 µM voor elke primer, 0,2 µM van elke sonde (sequenties in tabel 1)27, 5 µL van de sjabloon die opgesteld zijn in stap 2.4.4 toevoegen en gebruiken van ddH2O om toe te voegen van maximaal 25 µL totale volume.
    2. De fietsen programma als volgt Setup: 95 ° C gedurende 3 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 34 s. verzamelen fluorescerende signalen van 6-carboxy-fluoresceïne (FAM) en Hexachlorofluorescein (HEX) kanalen op de rek stap (72 ° C) automatisch door de fluorescerende real-time PCR-machine.
    3. Uitvoeren van PCR in real time op een fluorescerende real-time PCR machine, volgens de instructies van het instrument.
    4. Gaat u rechtstreeks naar stap 4 en de afgifte van negatieve verslagen als negatieve resultaten op de kanalen van de FAM/HEX, wat betekent optreden dat de monsters zijn negatief voor Salmonella spp. /Shigella spp.
    5. Ga naar stap 3.1 en/of 3.2 als positieve resultaten optreden op de HEX en/of FAM kanalen, wat betekent dat het monster kan positief voor Salmonella spp. en/of Shigella spp., respectievelijk.
      Opmerking: Als monster mengen is uitgevoerd in stap 2.3, vervolgens PCR in real time op afzonderlijke monsters die samengesteld van degene die positief moet worden uitgevoerd om het scherm uit de echte positief monster.

3. begeleide cultuur

  1. Salmonella spp. PCR positief monster
    1. Selectieve cultuur op middellange
      1. Voeg 100 µL van pre verrijking cultuur in 5 mL seleniet Cystine voedingsbodem in een reageerbuis. Incubeer bij 36 ° C gedurende 18-24 uur in een broedmachine.
    2. Scheiden van cultuur op plaat
      1. Verzamelen van één lus van de cultuur met een micro-lus en verspreid op een XLD plaat of Salmonella chromogenic agarplaat. Incubeer bij 36 ° C voor 18-24 uur in een broedmachine.
    3. Biochemische identificatie
      1. Selecteer verdachte kolonie op XLD plaat (roze kolonie met/zonder donker hart, donkere kolonie; gele kolonie met/zonder donker hart) of Salmonella chromogenic agarplaat (paars of prunosus kolonie, gladde en ronde) (Figuur 2).
      2. Onderwerp verdachte kolonie voor biochemische identificatie op geautomatiseerde microbiële identificatiesysteem, volgens de instructies van het instrument.
    4. Serologische karakterisatie
      1. O de karakterisering van het antigeen
        1. Een druppel van het O-antigeen polyvalente sera op een schone dia toevoegen.
        2. Verzamelen van één lus van de kolonie met een micro-lus en grind in de sera.
        3. Ga naar stap 3.1.4.1.4 als het eruit stroomt zand, wat betekent dat de kolonie reactief naar de sera (Figuur 3 is). Ga anders door naar stap 3.1.4.1.5.
        4. Hiermee kunt u dat O antigeen monovalent sera Herhaal stap 3.1.4.1.1 aan de 3.1.4.1.3 totdat de specifieke O-antigeen wordt gekenmerkt.
        5. Hiermee kunt u dat Vi sera Herhaal stap 3.1.4.1.1 tot 3.1.4.1.3. Verzamelen die Vi sera reactieve kolonies in een buis en koken bij 100 ° C gedurende 5 minuten in een droge bad. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 5 min. verzamelen de pellet en herhaal de stappen 3.1.4.1.1 om 3.1.4.1.4 tot specifieke O-antigeen wordt gekenmerkt.
      2. H antigeen karakterisering
        1. Een druppel van de polyvalente sera uit de H-antigeen in een schone dia toevoegen.
        2. Verzamelen van één lus van de kolonie met een micro-lus en grind in de sera.
        3. Ga naar stap 3.1.4.2.4 als het eruit stroomt zand, wat betekent dat de kolonie reactief naar de sera is.
        4. Hiermee kunt u dat H antigeen monovalent sera Herhaal stap 3.1.4.2.1 tot 3.1.4.2.3 tot specifieke H antigeen wordt gekenmerkt.
          Opmerking: Soms serum inductie kan nodig zijn te karakteriseren van de tweede fase H-antigeen. Zo ja, dan is de volgende optionele stappen moeten worden uitgevoerd.
        5. (Optioneel) Voeg één druppel specifieke H antigeen sera op nutriëntagar bord. Wacht totdat alle de sera worden geabsorbeerd.
        6. (Optioneel) Verzamelen van één lus van de kolonie met een micro-lus en verspreiding op het bord waar specifieke H antigeen sera worden geabsorbeerd. Incubeer bij 36 ° C voor 18-24 uur in een broedmachine.
        7. (Optioneel) Hiermee kunt u dat H antigeen monovalent sera Herhaal stap 3.1.4.2.1 tot 3.1.4.2.3 tot tweede fase H antigeen wordt gekenmerkt.
        8. Ga naar stap 4.
  2. Shigella spp. PCR positief monster
    1. Scheiden van cultuur op plaat
      1. Verzamelen van één lus van de cultuur van de pre verrijking met een micro-lus en verspreid op een XLD plaat of MAC plaat. Incubeer bij 36 ° C gedurende 18-24 uur in een broedmachine.
    2. Biochemische identificatie
      1. Verzamelen van verdachte kolonie op XLD plaat (gladde, ronde, transparante en rode kolonie) of MAC plaat (gladde, ronde, doorzichtig en kleurloos kolonie met 2-3 mm diameter; Shigella sonnei kan worden groter en draai aan het licht roze als de rek van de incubatietijd) (Figuur 4).
      2. Onderwerp verdachte kolonie voor biochemische identificatie op geautomatiseerde microbiële identificatiesysteem, volgens de instructies van het instrument.
    3. Serologische karakterisatie
      1. Een druppel van de Shigella spp. polyvalente sera op een schone dia toevoegen.
      2. Verzamelen van één lus van de kolonie met een micro-lus en grind in de sera.
      3. Ga naar stap 3.2.3.4 als het eruit stroomt zand, wat betekent dat de kolonie reactief naar de sera is.
      4. Hiermee kunt u dat Shigella spp. monovalent sera Herhaal de stappen 3.2.3.1 aan 3.2.3.3 specifieke Shigella spp. wordt gekenmerkt.
      5. Ga naar stap 4.

4. verslag

  1. Positieve of negatieve verslagen volgens de bovenstaande resultaten geven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het protocol werd toegepast voor de screening van Salmonella spp. /Shigella spp. in anale kruk monsters van mensen die voedsel en water zou behandelen.

In de real-time PCR-stap, zoals afgebeeld in Figuur 5A, was er een succesvolle versterking in HEX kanaal, wat betekende dat de gemengd monster positief voor Salmonella spp. was Dan een verdere PCR in real time werd uitgevoerd op afzonderlijke monsters die positieve enerzijds samengesteld. Zoals aangetoond in Figuur 5B, was monster 2 positief. Daarom, monster 2 werd gekozen voor de begeleide cultuur van Salmonella spp. In Figuur 5Cwas er een succesvolle versterking in het kanaal van de FAM, wat betekende dat de gemengd monster positief voor Shigella spp. was Dan een verdere PCR in real time werd uitgevoerd en monster 10 bleek te zijn positieve (Figuur 5D). Daarom, monster 10 werd gekozen voor de begeleide cultuur van Shigella spp.

In de begeleide cultuur van Salmonella spp. waren er roze kolonies en paarse kolonies op XLD plaat en Salmonella chromogenic agarplaat, afzonderlijk, zoals weergegeven in Figuur 2. Deze kolonies werden vervolgens onderworpen aan biochemische identificatie op geautomatiseerde microbiële identificatiesysteem. Resultaten bleek het om Salmonella spp., met onbekende soorten. Daarom, serologische karakterisatie was uitgevoerd (Figuur 3) en het was reactieve O4, O12, Hb, H1, 2. Volgens de wit-Kauffmann-Le secundaire regeling, werd monster 2 ten slotte gerapporteerd als positief voor Salmonella paratyphi B. Terwijl ze voor de begeleide cultuur van Shigella spp., waren er roze rood en kleurloze kolonies op XLD plaat en MAC plaat, afzonderlijk, zoals weergegeven in Figuur 4. Deze kolonies werden dan ook onderworpen aan biochemische identificatie op geautomatiseerde microbiële identificatiesysteem. Resultaten toonde aan dat het Shigella sonnei. Om te bevestigen zijn specifieke serotype, serologische karakterisatie was uitgevoerd (Figuur 3) en het was reactieve sonnei fase II. Daarom, monster 10 tot slot als positief werd gemeld voor Shigella sonnei fase II.

Figure 1
Figuur 1 : Het diagram van het protocol. Twee grote stappen werden getoond en gescheiden door dash lijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Representatief cultuur resultaten van Salmonella spp. op XLD plaat en Salmonella chromogenic agarplaat. Op XLD plaat, er waren roze kolonies met/zonder donker hart, terwijl op Salmonella chromogenic agarplaat, waren er paarse kolonies. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Representatief serologische karakterisatie resultaat. Als de kolonie reactief naar de sera was, leek het wel stroomt zand (links). Anders was het troebel (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Representatief cultuur resultaten van Shigella spp. op XLD plaat en MAC plaat. Op XLD plaat, waren er rode kolonies, terwijl op MAC plaat, waren er kolonies van doorzichtig en kleurloos. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Representatieve resultaten in real time PCR. (A) HEX kanaal voor mix monsters. (B) HEX kanaal voor afzonderlijke monsters. (C) FAM kanaal voor mix monsters. (D) FAM kanaal voor afzonderlijke monsters. PC: positieve controle. NC: negatieve controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Pathogen Naam Sequence(5'-3')
Salmonella Sal-F
Sal-R
Sal-sonde		 gctcatattaattccggcatttac
caggtcaatagccagaaagg
HEX-ataagtaatccaatccgaaatgcctgcgt-Eclipse
Shigella Shi-F
Shi-R
Shi-sonde		 ccgggataaagtcagaactc
cagtggagagctgaagtttc
FAM-aggccaggtagacttctatctcatccac-Eclipse

Tabel 1: Primers en sondes gebruikt. De naam en de sequenties van de primers en sondes werden verstrekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sinds Salmonella spp. /Shigella spp. worden vaak geassocieerd met voedselvergiftiging en faecale-orale overdracht van acute gastro-enteritis28,29 en de gebruikelijke methode is arbeidsintensief of tijdrovende 7, beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer platform voor de Salmonella spp. /Shigella spp. screening, met behulp van PCR in real time gecombineerd met begeleide cultuur.

Er zijn verschillende stappen moeten rekening houden met het maximaliseren van het vermogen van dit platform. De eerste is de pre verrijking stap voor samples in Nutrient Broth (stap 2.2). Hoewel geen pre verrijking stap is nodig voor kruk monsters verzameld uit die patiënten met duidelijke symptomen, zoals diarree, etc., is een algemene 6 h pre verrijking stap nog steeds nodig voor anale Swabmonsters, wanneer verzameld tijdens de pre-employment lichamelijk onderzoek voor de mensen die zou omgaan met voedsel en water, als die mensen vooral gezond of ten minste asymptomatische volwassenen waren. Als het protocol alleen voor het opsporen van Salmonella spp. toegepast was, kan vervolgens pre verrijking plaatsvinden in seleniet Cystine medium om te verhogen van de gevoeligheid. De tweede cruciale stap is de identificatie van verdachte kolonies (stap 3.1.3.1 en 3.2.2.1). Er zijn veel storende achtergrond flora in de kruk monsters die de detectie en de isolatie van doel ziekteverwekkers30 maskeren kunnen. Daarom moet het kenmerk van de verdachte kolonies als omschreven in stap 3.1.3.1 en 3.2.2.1 in gedachten worden gehouden tijdens het experiment. De derde cruciale stap is de serologische karakterisatie van Salmonella spp. Als een meerderheid van Salmonella spp. bevatten een tweede fase voor H antigeen31, hoeft serum inductie te worden uitgevoerd. Echter de serum-inductie is niet altijd succesvol en verschillende rondes van inductie kunnen nodig zijn om de juiste tweede fase van het H.

Het protocol is zeer specifieke en gevoelige als geverifieerd door onze vorige studie-27. De hoge specificiteit van het protocol wordt aangetoond door haar vermogen, tot welke Salmonella spp. /Shigella spp. kan worden onderscheiden van andere verwante ziekteverwekkers27. De ondergrens voor detectie van het protocol is 104 CFU/mL en 103 CFU/mL voor Salmonella spp. en Shigella spp., respectievelijk27, die vergelijkbaar zijn met vorige verslagen7,32 , 33 , 34. zoals we hierboven vermeld, de gevoeligheid van Salmonella spp. detectie kan verder worden verhoogd door seleniet Cystine pre verrijking als het protocol, alleen voor de opsporing van Salmonella spp. gelden was Bovendien, het protocol kan de positieve verhogen door twee plooien en afname van de werkbelasting/mediaan ommekeer tijd aanzienlijk27.

Gelijkaardig aan andere NAAT-testen, een belangrijke beperking van het protocol, in vergelijking met de methode van de cultuur van de klassieke bacteriën, is dat het protocol Salmonella spp. alleen kon identificeren /Shigella spp., terwijl andere gemeenschappelijke diarree-veroorzakende bacteriën 7weggelaten. Daarentegen tijdens klassieke bacteriën cultuur, kon die bacteriën worden geïdentificeerd in parallel als ze bestaan. Een andere beperking van het protocol is dat aantal Salmonella spp. /Shigella spp. niet kon worden geïdentificeerd door de PCR in real time te wijten aan de reeks variaties27. Echter als negatieve resultaten in real time PCR wordt weergegeven voor deze monsters van patiënten met duidelijke klinische symptomen, laboranten aandacht zou moeten besteden en andere experimenten om de resultaten te bevestigen kunnen voeren. Tijdens een grote uitbraak, we kunnen het gebruiken van één sample in plaats van samengevoegde monsters voor de eerste ronde van PCR screening.

Kortom, het protocol hier kon dienen als een waardevol platform voor de screening van Salmonella spp. /Shigella spp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de wetenschap en technologie programma van Zhuhai, China (subsidie nummer 20171009E030064), de wetenschap en technologie programma van Guangdong, China (subsidie nummer 2015A020211004) en de wetenschap en technologie programma van General Administration van Quality Supervision, Inspection and Quarantine van de Volksrepubliek China (subsidie nummer 2016IK302, 2017IK224).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

Tags

Immunologie en infecties probleem 141 acute gastro-enteritis, Salmonella spp. Shigella spp. screening PCR in real time begeleide cultuur
Een High-throughput Platform voor de Screening van <em>Salmonella</em> spp. /<em>Shigella</em> spp.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N.,… More

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N., Su, Y., Wang, H. B. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter