Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Published: November 7, 2018 doi: 10.3791/58200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Diarrhea Disease Detection, Zhuhai International Travel Healthcare Center

Summary

סלמונלה spp /שיגלה spp. הם נפוצים פתוגנים לייחס שלשול. כאן, אנו מתארים פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp / spp.שיגלה באמצעות PCR בזמן אמת בשילוב עם תרבות מודרכים.

Abstract

מחזור צואה-פה שידור של להרעלתו חריפה מתרחשת מפעם לפעם, במיוחד כאשר אנשים שטיפל מזון ומים נגועים על ידי סלמונלה spp/Shigella spp. שיטת תקן זהב עבור הגילוי של סלמונלה spp/Shigella spp. היא תרבות ישירה אבל זו שדורשת ולגזול. כאן, אנו מתארים פלטפורמה תפוקה גבוהה עבור/Shigella spp. סלמונלה spp ההקרנה, משתמש בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) בשילוב עם תרבות מודרכים. ישנם שני שלבים עיקריים: בזמן אמת PCR ותרבות מודרכים. השלב הראשון (PCR בזמן אמת), להסביר כל שלב של השיטה: לטעום אוסף, העשרה קדם, מיצוי DNA ו- PCR בזמן אמת. התוצאה PCR בזמן אמת היא חיובית, אם מתבצע השלב השני (תרבות מודרך): תרבות סלקטיבית, הביוכימי זיהוי ואפיון סרולוגית. אנחנו גם להמחיש את התוצאות נציג שהופקו ממנה. הפרוטוקול המתואר כאן יהיה פלטפורמה יקר להקרנה מהירה, ספציפית, רגיש, תפוקה גבוהה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Introduction

שלשול הוא עדיין בעיית בריאות משותפת עם שכיחות גבוהה שיעור כללי1,2. למרות התמותה היא נמוכה יחסית, חלק מהחולים מראים סימפטומים שונים במשך שבועות (כגון רפוי, דומעות שרפרפים, דחוף ללכת לשירותים), שהופכים את ההשפעה חברתי-כלכלי גבוה מאוד3,4. יותר ברצינות, חלק מהחולים עשויים להתפתח גם תסמונת המעי הרגיז אם אינו מטופל5. ישנם סוגים שונים של חיידקים, וירוסים, טפילים שיכולים לגרום לשלשול6. סלמונלה spp /שיגלה spp. הם בין החיידק הנפוץ ביותר להעברת להרעלתו חריפה7,8,9,10,11. לכן, מדינות רבות פרסמו חוקים או תקנות רגיל סלמונלה spp / spp.שיגלה הקרנת בקרב אנשים היה מתמודד עם מים ואוכל. לדוגמה, הממשלה הסינית פרסמו חוקים עבור חובה סלמונלה spp / spp.שיגלה הקרנה פעם בשנה.

לשיטת תקן הזהב סלמונלה sppשיגלה spp. זיהוי זה התרבות חיידקים. דרך התרבות חיידקים, רצופים הביוכימי זיהוי ואפיון סרולוגית, נוכל לזהות המינים של חיידקים, אשר יכול להקל על ניהול התפרצות המחלה והגדרת פרופיל מיקרוביאלית לסייע לטיפול בחולים 12. זה גם יכול לעזור לאתר. את מקור זיהום במהלך סלמונלה spp /שיגלה spp. התפרצות13. עם זאת, שיטה זו היא מהגידולים (דרישת ידני), זמן רב (לוקח מספר ימים), במיוחד עבור בדיקה של מספר רב של דוגמאות7. יתר על כן, מעשית אלא ללא-culturable (VBNC) סלמונלה spp /שיגלה spp.קיים בדגימות צואה14. על רקע מחסרונות אלה, מעבדות רבות ניסו לפתח טכניקות חדשות עבור הגילוי של סלמונלה spp /שיגלה spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. כל השיטות האלה השתמש במבחן הגברה חומצת הגרעין (NAAT), ביניהם תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) היא הנפוצה ביותר. מגבלה אחת גדולה של השיטות NAAT מבוסס הוא כי חיידקים מתים, פסולת אפילו חיידקי. DNA גנומי לא שלם המכיל, יכול להראות תוצאות חיוביות26, אשר יכלו להשפיע במידה רבה על אבחנה מדויקת של המחלה. בלאנקו. et al. הראה שאת assay מולקולרית היא רגישה מאוד, לא רק קיימא סלמונלה בתרבויות, אלא גם על חלקי הגנום, חיידקים מתים או נבאדה דלקות בעבר או זיהום26. לכן, צריך לפתח טכנולוגיה חדשה.

כאן, אנחנו תיאר שיטה זה משלב NAAT מבוססי שיטה, culturing. כפי שמוצג באיור1, שיטה חדשה חל בזמן אמת PCR ההקרנה הראשונה, לאחר מכן נשלחים דוגמאות חיוביות התרבות חיידקים וזיהוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות שנקבעו על ידי ועדת האתיקה האנושית מחקר של מרכז בריאות נסיעות הבינלאומי Zhuhai. אנא השתמש בפעולת סטרילי רגיל במהלך הניסוי.

1. תרבות המדיה קומפוזיציה והכנות

  1. להכין מרק מזין: להמיס 1% peptone, תמצית בשר 0.3%, 0.5% נתרן כלורי, 0.1% גלוקוז H2O, להתאים את ה-pH 7.5 ו אוטוקלב זה 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  2. להכין הסלנייט ציסטין בינוני: להמיס peptone 0.5% לקטוז 0.4%, 1% נה2HCO3, 0.4% נתרן מימן סלניט, 0.001% L-ציסטין H2O, להתאים את ה-pH אל 7.0 והרתיחו אותו למשך 5 דקות.
  3. להכין את Xylose, ליזין, צלחת אגר (XLD) Deoxycholate: להמיס שמרים 0.3% תמצית, 0.5% L-ליזין 0.375% xylose, 0.75% לקטוז, 0.75% סוכרוז, 0.5% נתרן כלורי, 0.008% פנול אדום, 0.68% נתרן תיוסולפט, 0.08% אמוניום ferric ציטראט, 0.25% נתרן deoxycholate, 1.5% אגר H2O, ולהתאים את ה-pH ל 7.4. לאחר מכן מרתיחים זה 5 דקות, יוצקים אותו לתוך צלחות 90 מ מ.
  4. להכין צלחת אגר הדפסות כסף של סלמונלה : להמיס אגר 1.5%, כ- 0.7% תמצית peptone ושמרים, ריאגנט סלקטיבי 1.29% H2O. לאחר מכן מרתיחים זה 5 דקות, יוצקים אותו לתוך צלחות 90 מ מ.
  5. להכין צלחת אגר מזין את: להמיס 1% peptone, תמצית בשר 0.3%, 0.5% נתרן כלורי, 1.5% אגר H2O ו pH ל 7.3. ואז אוטוקלב זה 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ויוצקים אותו לתוך צלחות 90 מ מ.
  6. להכין צלחת אגר (MAC) של MacConkey: להמיס peptone 2%, 1% לקטוז, 0.5% נתרן כלורי, 0.5% מלח מרה שור, 0.0025% אדום ניטרלי, 1.5% אגר, 0.0001% קריסטל ויולט H2O, ולהתאים את ה-pH ל- 7.2. ואז אוטוקלב זה 115 מעלות למשך 20 דקות ויוצקים אותו לתוך צלחות 90 מ מ.

2. בזמן אמת PCR

  1. דוגמה אוסף
    1. הכנס מבדיקה אנאלית לתוך פי הטבעת של המטופל 3-5 ס מ עמוק, ולסובב אותה 360 מעלות מסביב.
    2. לשים את אנאלית לתוך צינור אוסף סטרילי. מארק מדגם מזהה
    3. שלח את הדגימה למעבדה בהקדם האפשרי.
      הערה: הדוגמאות שניתן לאחסנו ב 4 ° C עבור לא יותר מ 24 שעות.
  2. העשרה קדם
    1. להוסיף 3 מ ל מרק מזין לתוך כל מדגם בצינור אוסף.
    2. דגירה ב 36 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות בתוך אינקובטור.
  3. לדוגמה ערבוב (אופציונלי)
    1. לאסוף 100 µL של כל תרבות העשרה קדם ומערבבים 8-10 דוגמאות הדגימה 1 לתוך צינור 1.5 mL, אם קיימים יותר מ- 10 דוגמאות.
    2. לסמן כראוי.
  4. הפקת דנ א
    1. Centrifuge התרבות העשרה טרום ב g x 800 למשך 2 דקות לאפשר חלקיקים גדולים להתמסד, העברת תגובת שיקוע צינור חדש ו צנטריפוגה ב g 12,000 x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
    2. להוסיף 100 µL של פתרון הפקת דנ א (0.01 M pH 8.0 טריס-EDTA, 0.01% P Nonidet 40 (NP40)) כדי בגדר. מערבולת נמרצות במשך 1 דקה.
    3. מרתיחים ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על אמבט יבש.
    4. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דק. לאסוף את תגובת שיקוע באמצעות צינור חדש, אשר יהיה התבנית עבור הניתוח PCR מצליחה בזמן אמת.
  5. PCR בזמן אמת
    1. הגדרת את תערובת התגובה כמו בצע: עבור כל דגימה, להוסיף 12.5 µL של 2 x תערובת התגובה מיקרומטר 0.4 של כל פריימר, 0.2 µM של כל בדיקה (רצפי טבלה 1)27, µL 5 של תבנית מוכן בשלב 2.4.4 ולהשתמש ddH2O להוספת סה כ עד 25 µL נפח.
    2. הגדרת התוכנית אופניים כדלקמן: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריו 40 מחזורי 95 ° C 15 s, 55 ° C ל 30 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 34 ס' לאסוף אותות פלואורסצנט 6-carboxy-fluorescein (FAM) ו Hexachlorofluorescein (הקסדצימאלי) ערוצי בשלב התארכות (72 ° C) באופן אוטומטי ע י המכונה PCR פלורסנט בזמן אמת.
    3. לבצע PCR בזמן אמת על מכונת ה-PCR פלורסנט בזמן אמת, בהתאם להוראות של המכשיר.
    4. ללכת בשלב 4 ישירות, הנפקת דוחות השליליות אם תוצאה שלילית להתרחש על הערוצים FAM/HEX, מה שאומר כי הדגימות שלילית סלמונלה spp /שיגלה spp.
    5. עבור לשלב 3.1 ו/או 3.2 אם חיובי תוצאות להתרחש על הערוצים HEX ו/או המשפחה, מה שאומר כי המדגם עשוי להיות חיובי סלמונלה spp ו/או שיגלה spp., בהתאמה.
      הערה: אם הדגימה ערבוב בוצעה בשלב 2.3, אז PCR בזמן אמת על דגימות בודדים אשר המציא החיובי יש לבצעו לסנן את הדגימה חיובי מאוד.

3. מודרכים תרבות

  1. סלמונלה spp. PCR דוגמה חיובית
    1. תרבות סלקטיבי בינוני
      1. להוסיף 100 µL של תרבות העשרה מראש לתוך 5 מ של הסלנייט ציסטין בינוני במבחנה. דגירה ב 36 מעלות צלזיוס במשך 18 – 24 h בתוך אינקובטור.
    2. הפרדת התרבות בצלחת
      1. לאסוף את סיבוב אחד של התרבות עם לולאה מיקרו ולהתפשט אל XLD צלחת או צלחת אגר הדפסות כסף סלמונלה . דגירה ב 36 מעלות צלזיוס במשך 18-24 h בתוך אינקובטור.
    3. זיהוי הביוכימי
      1. בחר מושבת חשוד על צלחת XLD (המושבה ורוד עם/בלי הלב האפל; המושבה כהה המושבה צהוב עם/בלי הלב האפל) או צלחת אגר הדפסות כסף סלמונלה (סגול או prunosus המושבה עגולה וחלקה) (איור 2).
      2. נושא המושבה חשוד לזיהוי ביוכימי במערכת ממוכנת זיהוי חיידקים, לפי ההוראות של המכשיר.
    4. אפיון סרולוגית
      1. O אנטיגן אפיון
        1. הוסף טיפה אחת של sera ערכיות אנטיגן O לשקופית נקי.
        2. לאסוף את סיבוב אחד של המושבה עם מיקרו-לולאה, לטחון ב sera.
        3. ללכת צעד 3.1.4.1.4 אם זה נראה כמו זורם חול, מה שאומר המושבה תגובתי ל סרה (איור 3). אחרת, עבור לשלב 3.1.4.1.5.
        4. השתמש O אנטיגן סרה monovalent לחזור על שלבים 3.1.4.1.1 עד 3.1.4.1.3 עד O אנטיגן ספציפי מאופיין.
        5. השתמש סרה השישי לחזור על שלבים 3.1.4.1.1 כדי 3.1.4.1.3. לאסוף את המושבות תגובתי האלה סרה השישי בצינור והרתיחו ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות באמבט יבש. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דק. לאסוף את צניפה, חזור על שלבים 3.1.4.1.1 כדי 3.1.4.1.4 עד אנטיגן O מאופיין.
      2. אפיון אנטיגן H
        1. הוסף טיפה אחת של sera ערכיות אנטיגן H לשקופית נקי.
        2. לאסוף את סיבוב אחד של המושבה עם מיקרו-לולאה, לטחון ב sera.
        3. ללכת צעד 3.1.4.2.4 אם זה נראה כמו זורם חול, מה שאומר המושבה תגובתי ל sera.
        4. השתמש H אנטיגן סרה monovalent לחזור על שלבים 3.1.4.2.1 עד 3.1.4.2.3 עד אנטיגן ספציפי H מאופיין.
          הערה: לפעמים סרום אינדוקציה עשוי להיות נחוץ כדי לאפיין אנטיגן שלב H השני. אם כן, אז השלבים האופציונליים הבאים יש לבצעו.
        5. (אופציונלי) הוסף טיפה אחת של sera אנטיגן ספציפי של H על גבי צלחת אגר מזין. המתן עד כל סרה נספגים.
        6. (אופציונלי) לאסוף את סיבוב אחד של המושבה עם מיקרו-לולאה, התפשטות לצלחת איפה sera מסוימת של אנטיגן H נספגים. דגירה ב 36 מעלות צלזיוס במשך 18-24 h בתוך אינקובטור.
        7. (אופציונלי) השתמש H אנטיגן סרה monovalent לחזור על שלבים 3.1.4.2.1 עד 3.1.4.2.3 עד השלב השני אנטיגן H מאופיין.
        8. עבור לשלב 4.
  2. שיגלה spp. PCR דוגמה חיובית
    1. הפרדת התרבות בצלחת
      1. לאסוף את סיבוב אחד של התרבות העשרה מראש עם לולאה מיקרו ולהתפשט אל XLD צלחת או צלחת MAC. דגירה ב 36 מעלות צלזיוס במשך 18 – 24 h בתוך אינקובטור.
    2. זיהוי הביוכימי
      1. לאסוף את המושבה חשוד על צלחת XLD (חלק, עגול, שקוף ואדום המושבה) או בצלחת MAC (חלק, עגול, המושבה שקוף וחסר צבע עם 2-3 מ מ קוטר; שיגלה sonnei עשוי להיות גדול יותר, לפנות אור ורוד כמו התארכות של זמן הדגירה) (איור 4).
      2. נושא המושבה חשוד לזיהוי ביוכימי במערכת ממוכנת זיהוי חיידקים, לפי ההוראות של המכשיר.
    3. אפיון סרולוגית
      1. הוסף טיפה אחת של sera ערכיות spp. שיגלה לשקופית נקי.
      2. לאסוף את סיבוב אחד של המושבה עם מיקרו-לולאה, לטחון ב sera.
      3. ללכת צעד 3.2.3.4 אם זה נראה כמו זורם חול, מה שאומר המושבה תגובתי ל sera.
      4. השתמש שיגלה spp. סרה monovalent לחזור על שלבים 3.2.3.1 כדי 3.2.3.3 עד spp. שיגלה ספציפי מאופיין.
      5. עבור לשלב 4.

4. דו ח

  1. להנפיק דוחות חיוביים או שליליים על פי התוצאות לעיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול היה מוחל להקרנה של סלמונלה spp / spp.שיגלה בצואת אנאלי דוגמאות מאנשים יטפל מזון ומים.

בשלב ה-PCR בזמן אמת, כמוצג באיור 5א, הייתה הגברה מוצלחת ערוץ HEX, שאומר כי המדגם מעורב היה חיובי עבור סלמונלה spp ואז PCR בזמן אמת עוד יותר נערך על דגימות בודדים אשר המציא החיובי. כפי שמוצג באיור 5B, לדוגמה 2 היה חיובי. לכן, לדוגמה 2 נבחר לתרבות מודרכים סלמונלה spp איור 5C, היה הגברה מוצלח בערוץ FAM, שאומר כי המדגם מעורב היה חיובי עבור שיגלה spp. ואז PCR בזמן אמת עוד יותר נערך מדגם 10 נמצאה להיות חיובי (איור 5D). לכן, לדוגמה 10 נבחר לתרבות מודרכים שיגלה spp.

בתרבות מודרכים של סלמונלה spp, היו מושבות ורוד סגול מושבות על XLD צלחת, צלחת אגר הדפסות כסף סלמונלה , בנפרד, כפי שמוצג באיור2. אז מושבות אלו היו נענשים זיהוי של מערכת ממוכנת זיהוי חיידקים הביוכימי. תוצאות המחקר הראו שזה סלמונלה spp, עם מינים לא מוכרים. לפיכך, אפיון סרולוגית היה שבוצעו (איור 3) וזה היה תגובתי ל O4 O12, על בסיס חצי פנסיון, H1, 2. לפי לבן-Kauffmann-Le קטין, לדוגמה 2 סוף סוף דווח על חיובי עבור סלמונלה paratyphi B בעוד לתרבות מודרכים שיגלה spp., היו מושבות אדום וחסר צבע ורוד על XLD צלחת, צלחת MAC, בנפרד, כפי שמוצג באיור4. אז מושבות אלו היו גם נתון זיהוי של מערכת ממוכנת זיהוי חיידקים הביוכימי. תוצאות המחקר הראו שהיה זה שיגלה sonnei. כדי לוודא serotype הספציפי שלה, אפיון סרולוגית היה שבוצעו (איור 3) וזה היה תגובתי sonnei לשלב השני. לכן, לדוגמה 10 דווח סוף סוף חיובי עבור שיגלה sonnei שלב II.

Figure 1
איור 1 : הדיאגרמה של הפרוטוקול. שני שלבים עיקריים היו מוצגות ומופרדות באמצעות קו מפריד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תרבות נציג התוצאות של סלמונלה spp על XLD צלחת, צלחת אגר הדפסות כסף סלמונלה . בצלחת XLD, היו מושבות ורודות עם/בלי הלב האפל, ואילו על צלחת אגר הדפסות כסף סלמונלה , היו מושבות סגול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : אפיון סרולוגית נציג תוצאה. אם המושבה היתה תגובתי ל סרה, זה נראה כמו זורם חול (משמאל). אחרת, זה היה עכורים (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : תרבות נציג תוצאות שיגלה spp. על XLD צלחת, צלחת MAC. בצלחת XLD, היו מושבות אדום, בעוד בצלחת MAC, היו מושבות שקוף וחסר צבע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : נציג תוצאות בזמן אמת של PCR. (א) HEX ערוץ של דגימות מיקס. ערוץ (B) הקס של דוגמאות בודדות. (ג) FAM ערוץ של דגימות מיקס. (ד) FAM ערוץ של דוגמאות בודדות. PC: בקרה חיובית. NC: בקרה שלילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פתוגניות שם Sequence(5'-3')
סלמונלה סאל-F
סאל-R
סאל-בדיקה		 gctcatattaattccggcatttac
caggtcaatagccagaaagg
HEX-ataagtaatccaatccgaaatgcctgcgt-ליקוי חמה
שיגלה שי-F
שי-R
שי-בדיקה		 ccgggataaagtcagaactc
cagtggagagctgaagtttc
FAM-aggccaggtagacttctatctcatccac-ליקוי חמה

טבלה 1: תחל וזונדים להשתמש. השם ואת רצפים של צבעי יסוד, הגששים נמסרו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאז סלמונלה spp /שיגלה spp. הקשורים לעתים קרובות עם הרעלת מזון והעברת בצואה אורלי להרעלתו חריפה28,29 , השיטה שגרתית היא עתירי עבודה או זמן רב 7, נתאר פלטפורמה תפוקה גבוהה סלמונלה spp /שיגלה spp. ההקרנה, באמצעות PCR בזמן אמת בשילוב עם תרבות מודרכים.

ישנם מספר שלבים צריך שיקול דעת כדי למקסם את היכולת של הפלטפורמה. הראשון הוא השלב העשרה מראש של דוגמאות נזיד מזין (שלב 2.2). אמנם אין שלב טרום העשרה יש צורך דגימות צואה שנאסף אלה חולים עם תסמינים ברורים, כגון שלשולים, וכדומה, צעד קדם העשרה כללית 6 שעות עדיין הדרושים, לדוגמאות אנאלית, כאשר שנאספו במהלך העבודה מראש בדיקה גופנית לאנשים אשר יטפל מזון ומים, כמו האנשים האלה היו בעיקר בריא או לפחות אסימפטומטיים מבוגרים. אם הפרוטוקול היה מוחל רק על הגילוי של סלמונלה spp, ואז העשרה מראש יכול להתנהל הסלנייט ציסטין בינוני כדי להגביר את הרגישות. השלב הקריטי השני הוא זיהוי חשודים מושבות (שלב 3.1.3.1 ו 3.2.2.1). ישנם רבים פלורה רקע מפריעות דגימות צואה זה עשוי להסוות את זיהוי ובידוד של פתוגנים המטרה30. לכן, המאפיין של המושבות חשוד כשלב כהגדרתו 3.1.3.1 ו 3.2.2.1 יש לשמור בראש במהלך הניסוי. השלב הקריטי השלישי הוא אפיון סרולוגית סלמונלה spp כמו רוב של סלמונלה spp מכילים שלב שני H אנטיגן31, סרום אינדוקציה צריך להתבצע. עם זאת, אינדוקציה סרום הוא לא תמיד מצליח, כמה סבבים של אינדוקציה עשוי להיות נחוץ כדי לקבוע השלב הנכון H השני.

הפרוטוקול הוא מאוד ספציפי ורגיש כמו מאומת על ידי המחקר הקודם שלנו27. יחודיות גבוהה של הפרוטוקול מומחש יכולתה, באילו סלמונלה spp /שיגלה spp. יכול להיות נבדל אחרים הקשורים פתוגנים27. הגבול התחתון של זיהוי של הפרוטוקול הוא 104 CFU/mL ו- 103 CFU/mL סלמונלה spp, שיגלה spp., בהתאמה27, אשר דומות דוחות קודמים7,32 , 33 , 34. אנחנו כאמור לעיל, הרגישות של סלמונלה spp. זיהוי יכול להיות עוד יותר מוגברת על ידי העשרה קדם הסלנייט ציסטין אם הפרוטוקול מיושמת רק עבור הגילוי של סלמונלה spp יתר על כן, הפרוטוקול יכול להגביר את קצב חיובי על ידי שני קיפולים ולהקטין את עומס העבודה/החציון זמן טיפול משמעותי27.

מגבלה אחת גדולה של הפרוטוקול, בהשוואה לשיטה התרבות חיידקים קלאסי, בדומה מבחני NAAT אחרים, הוא כי הפרוטוקול יכול לזהות רק סלמונלה spp /שיגלה spp., ואילו אחרים חיידקים שכיחים הגורמים לשלשול הושמט7. לעומת זאת, במהלך התרבות חיידקים קלאסי, חיידקים אלו יכול להיות מזוהה במקביל אם הם קיימים. הגבלה נוספת של הפרוטוקול זה חלק סלמונלה spp /שיגלה spp. לא יכול להיות מזוהה על ידי PCR בזמן אמת בשל רצף וריאציות27. אולם, אם התוצאות השליליות PCR בזמן אמת מופיעה עבור הדגימות של חולים עם תסמינים קליניים ברורים, טכנאי מעבדה כדאי לשים לב, אפשר לערוך ניסויים אחרים כדי לאשר את התוצאות. במהלך התפרצות גדולה, אנו עשויים להשתמש דוגמה אחת במקום במאגר דגימות בסיבוב הראשון של ה-PCR ההקרנה.

לסיכום, פרוטוקול שסופק כאן יכול לשמש כפלטפורמה יקר להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המדע, טכנולוגיה תוכנית של Zhuhai, סין (20171009E030064 מספר גרנט), המדע התוכנית טכנולוגיה של גואנג-דונג, סין (2015A020211004 מספר גרנט), המדע ואת הטכנולוגיה של כללי ניהול הפרויקט של איכות הפיקוח, הביקורת ההסגר של הרפובליקה העממית של סין (2016IK302 מספר של גרנט, 2017IK224).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma 10708976001
EDTA Sigma 798681
NP40 Sigma 11332473001
ddH2O Takara 9012
PrimeSTAR HS (Premix) Takara R040Q
Nutrient Broth LandBridge CM106
Nutrient agar LandBridge CM107
Selenite Cystine medium LandBridge CM225
XLD LandBridge CM219
MAC  LandBridge CM908
Salmonella chromogenic agar CHROMagar SA130
Salmonella diagnostic serum Tianrun SAL60
Shigella diagnostic serum Tianrun SHI54
anal swab (collecting tube plus) Huachenyang
slide Mingsheng 7102
micro-loop Weierkang W511
incubator Jinghong DNP-9082
autoclave AUL SS-325
dry bath Jinghong KB-20
automated microbial identification system bioMérieux VITEK2 other equivalent system could be used
fluorescent real-time PCR machine ThermoFisher ABI7500 other equivalent machine could be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
  2. Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey. Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).
  3. Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).
  4. Henson, S. J., et al. Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada. International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).
  5. Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico. The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).
  6. Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay. Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).
  7. Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).
  8. Liu, J., et al. Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).
  9. Wang, S. M., et al. Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China. Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).
  10. Wikswo, M. E., Hall, A. J. Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010. MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).
  11. Shen, H., et al. The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China. Frontiers in Microbiology. 7, 1926 (2016).
  12. Tariq, A., et al. Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan. Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).
  13. Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Frontiers in Microbiology. 8, 2587 (2017).
  14. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).
  15. Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples. Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).
  16. Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections. Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).
  17. Van Lint, P., et al. Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples. Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).
  18. Kamkamidze, G., et al. Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases. Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).
  19. Li, Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens. Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).
  20. Zhuang, L., et al. Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene. Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).
  21. Shi, X. L., et al. Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).
  22. Mo, Q. H., et al. Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).
  23. Wang, H. B., et al. Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis. Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).
  24. Sun, H., et al. Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).
  25. Qi, W., et al. Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios. Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).
  26. Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers. Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).
  27. Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture. Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).
  28. Dekker, D. M., et al. Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).
  29. Gargano, J. W., et al. Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009. Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).
  30. Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).
  31. Herrera-Leon, S., et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes. Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).
  32. Cunningham, S. A., et al. Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).
  33. Eriksson, E., Aspan, A. Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry. BMC Veterinary Research. 3, 21 (2007).
  34. Dutta, S., et al. Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India. Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 141 דלקת הקבה והמעים חריפה, סלמונלה spp שיגלה spp. הקרנה PCR בזמן אמת מודרכים תרבות
פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של <em>סלמונלה</em> spp /<em>שיגלה</em> spp.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N.,… More

Yang, Z., Chen, X. B., Tu, C. N., Su, Y., Wang, H. B. A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.. J. Vis. Exp. (141), e58200, doi:10.3791/58200 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter