Summary
サルモネラ赤痢は下痢に起因する一般的な病原体。ここでは、サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォームについて述べる/リアルタイム PCR を用いた赤痢ガイド文化と組み合わせます。
Abstract
急性胃腸炎の糞口頭伝達発生時間の時間から、食料と水を処理する人がサルモネラ属/Shigella属菌に感染している場合は特にサルモネラ属/Shigella属菌の検出法のゴールド スタンダードは直接文化ですが手間と時間がかかる。ここでは、サルモネラ属/Shigella属菌スクリーニング、リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 導かれた文化と組み合わせるを使用しての高スループット プラットフォームについて述べる。2 つの主要な段階があります: リアルタイム PCR とガイド付きの文化。最初のステージ (リアルタイム PCR)、我々 はメソッドの各ステップを説明する: コレクション、前濃縮、DNA の抽出、PCR のサンプルします。リアルタイム PCR の結果が肯定的な場合 (ガイド文化) の 2 番目の段階を実行: 選択的文化、生化学的同定と血清学的解析。我々 はまたそれから生成された代表的な結果を示しています。ここで説明されているプロトコルは、サルモネラ属菌の迅速な特定、機密、高スループット スクリーニングのための貴重なプラットフォームになる/赤痢菌属
Introduction
下痢はまだ発生率が高いと一般的な健康問題レート1,2は、グローバルです。何人かの患者が週間 (ゆったりと水様便、バスルームに行き緊急) などの様々 な症状を示す死亡率が比較的低いが、経済効果の非常に高い3,4になります。もっと真剣に、一部の患者は過敏性腸症候群を開発可能性がありますも場合未処理5を左します。細菌、ウイルス、下痢6を引き起こす可能性が寄生虫の様々 な種類があります。サルモネラ属菌/赤痢、急性胃腸炎7,8,9,10,11の伝達のための最も一般的な細菌の中で。したがって、多くの郡が定期的サルモネラの法令を発行している/赤痢菌属は、食料や水の処理と人々 の間でスクリーニングします。たとえば、中国の政府は義務のサルモネラのための法律を発行している/赤痢菌属は、年に一度をスクリーニングします。
サルモネラ属菌の金本位法/赤痢菌属検出細菌文化。細菌文化と連続の生化学的同定と血清学的性状、を介して疾患アウトブレイク管理と抗菌薬の患者の治療を支援するためにプロファイリングを容易にすることができる細菌の種を識別できます。12.サルモネラ属中の感染のソースをトレースにも役立つかもしれない/赤痢菌属の発生13。ただし、このメソッドは、(手動操作を必要とする) 手間と時間のかかる (数日かけて)、特に多数のサンプル7のテストします。さらに、(VBNC)サルモネラ属菌培養が可能な/赤痢菌属がいくつかの糞便に存在する14。これらの欠点の観点から多くの実験室はサルモネラ属菌の検出のための新しい手法の開発を試してみました/赤痢菌属15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25します。 これらすべてのメソッドは、その中でポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は最も一般的な核酸増幅テスト (NAAT) を使用します。これらの NAAT ベースのメソッドの 1 つの主要な制限は死菌、細菌も破片含んでいる不完全なゲノム DNA が肯定的な結果26、主病の正確な診断に影響を与える可能性がありますを示すことができます。ブランコらは、その分子アッセイが可能なサルモネラの文化でも部分的なゲノムと過去の感染または汚染26から死んだまたは実行不可能な細菌だけではなく、機密性の高いを示しました。したがって、新しい技術を開発する必要があります。
ここでは、コンバイン、NAAT ベースの法と培養法について述べる。図 1に示すように、この新しいメソッドに適用されるリアルタイム PCR の最初のスクリーニング、細菌培養と同定のための肯定的なサンプルの送信されます。
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Protocol
プロトコル珠海国際旅行健康管理センターの人間研究倫理委員会の定めたガイドラインに従います。実験中に標準的な滅菌操作を使用してください。
1 培地の組成と調製
- 栄養流体培養基の準備: 1% ペプトン、牛肉エキス 0.3%、0.5% 塩化ナトリウム、H2O で 0.1% ブドウ糖を溶解、7.5 とオートクレーブに pH 調整 121 ° C、15 分で。
- 亜セレン酸シスチン メディアの準備: ディゾルブ 0.5% ペプトン乳糖 0.4%、1% Na2HCO30.4% 水素亜セレン酸ナトリウム、0.001% H2O、L シスチン 7.0 に pH を調整し、5 分間沸騰します。
- 準備キシロース、リジン、デオキシ コール酸寒天 (XLD): ディゾルブ 0.3% 酵母エキス、0.5 %l-リジン、0.375% キシロース、0.75% の乳糖、0.75% スクロース、塩化ナトリウム 0.5%、0.008% フェノール レッド、0.68% チオ硫酸ナトリウム、0.08% ● クエン酸鉄アンモニウム、ナトリウム 0.25%H2O、1.5% 寒天デオキシ コール酸と pH 7.4 に調整。5 分間沸騰し、90 mm の板にそれを注ぐ。
- サルモネラ酵素基質寒天プレートを準備: 1.5% 寒天、0.7% ペプトン、酵母エキス、H2o. 1.29% 選択試薬を溶解5 分間沸騰し、90 mm の板にそれを注ぐ。
- 寒天プレートを準備: 1% ペプトン、牛肉エキス 0.3%、0.5% 塩化ナトリウム、H2O、1.5% 寒天を溶解し、7.3 に pH を調整します。その後、オートクレーブ 121 ° C、15 分で 90 mm の板にそれを注ぐと。
- マッコンキー寒天培地 (MAC) 板を準備する: 溶解 2% ペプトン、1% の乳糖、塩化ナトリウム 0.5% 0.5% 牛胆汁酸塩、0.0025% 中立赤、1.5% 寒天、0.0001% H2O、クリスタル バイオレット 7.2 pH 調整と。オートクレーブ、115 ° C、20 分で、90 mm の板に注ぐ。
2. リアルタイム PCR
- サンプル コレクション
- 患者の肛門にアナル綿棒を挿入 3-5 cm、周囲 360 ° に回転させます。
- アナル綿棒を滅菌採取管に入れます。マーク サンプルの ID
- できるだけ早く研究室にサンプルを送る。
注: サンプルは 4 ° C、24 h 以上で格納できます。
- 前濃縮
- コレクションの管で各サンプルに栄養流体培養基の 3 mL を加えます。
- インキュベーターで 6 h 36 ° C で孵化させなさい。
- 混合 (オプション) サンプル
- 各事前集積培養の 100 μ L を収集し、以上 10 個のサンプルがある場合、1.5 mL チューブに 1 試料の 8-10 サンプルをミックスします。
- 正しくマークします。
- DNA の抽出
- 落ち着くのか、大きな粒子を許可するように 2 分間 800 x g で前培養を遠心し、新しい管、12,000 × g で 5 分間遠心する転送清吸引により上澄みを廃棄します。
- DNA 抽出液を 100 μ l 添加 (0.01 M pH 8.0 トリス-EDTA、0.01% ノニデット P 40 (NP40)) ペレットにします。1 分は積極的に渦。
- 乾燥浴上で 5 分間 100 ° C で沸騰します。
- 12,000 × g で 5 分間遠心する後続のリアルタイム pcr のテンプレートとなる新しいチューブを使用して上清を収集します。
- リアルタイム PCR
- 反応混合物をセットアップに従ってください: 各サンプルの反応混合物各プライマーの 0.4 μ M、0.2 μ M の各プローブ (表 1のシーケンス)272.4.4、準備したテンプレートの 5 μ L x 2 の 12.5 μ l 添加し ddH2O 合計最大 25 μ L を追加するを使用して、 ボリューム。
- セットアップ以下の通りサイクリング プログラム: 95 ° C、3 分に続いて 40 サイクル 95 ° C の 15 s、55 ° C、30 秒、6-カルボキシ-フルオレセイン (FAM) と Hexachlorofluorescein (HEX) 伸長段階 (72 ° C) でチャンネルから 34 s. 収集蛍光信号のための 72 ° C自動的にによって蛍光リアルタイム PCR マシン。
- リアルタイム PCR 蛍光リアルタイム PCR マシン、器械の指示に従って実行します。
- ステップ 4 に進んで、ファム/六角チャンネルは、サンプルがサルモネラ属菌が陰性であることを意味で否定的な結果が発生した場合の負のレポートを発行/赤痢菌属
- 肯定的な結果がサンプルはそれぞれサルモネラや赤痢菌属、肯定的な可能性があることを意味する HEX および/または家族のチャンネルで発生する場合は、3.1 および 3.2 の手順に進みます。
注: サンプルの混合を 2.3 の手順で実行されて場合、肯定的なものを作られた個々 のサンプルにリアルタイム PCR 行わなければならない現実肯定的なサンプルを選別します。
3. ガイド文化
-
サルモネラ属菌 PCR 陽性サンプル
- 媒体の選択的な文化
- 5 mL の試験管における亜セレン酸シスチン媒体に事前集積培養の 100 μ L を追加します。36 ° C、インキュベーターで 18-24 時間で孵化させなさい。
- プレートの文化を分離すること
- マイクロ ループと文化の 1 つのループを収集し、XLD プレートまたはサルモネラ酵素基質寒天培地に広げます。36 ° C、インキュベーターで 18-24 時間で孵化させなさい。
- 生化学的同定
- XLD プレート (ピンク コロニー/暗い心なし; 暗いコロニー; 黄色コロニー/暗い心なし) またはサルモネラ酵素基質寒天培地の選択疑わしいコロニー (紫または prunosus のコロニー、丸く) (図 2)。
- 対象楽器の指示に従っての自動微生物同定システムに関する生化学的同定の不審なコロニー。
- 血清学的キャラクタリゼーション
- O 抗原の解析
- きれいなスライドに O 抗原多価血清 1 滴を加えます。
- マイクロ ループと血清中に挽くコロニーの 1 つのループを収集します。
- 砂、流れるような場合 3.1.4.1.4 をステップに進む植民地は血清 (図 3) に反応。それ以外の場合、3.1.4.1.5 のステップに移動します。
- O 抗原一価血清を使用して、O 抗原の特徴まで 3.1.4.1.1 に 3.1.4.1.3 の手順を繰り返します。
- Vi の血清を使用して、3.1.4.1.1 に 3.1.4.1.3 の手順を繰り返します。管内それらの Vi の血清の反応性コロニーを収集し、乾燥風呂に 5 分間 100 ° C で沸騰します。12,000 × g で 5 分間遠心するは、O 抗原の特徴まで、ペレットと手順 3.1.4.1.4 に 3.1.4.1.1 を収集します。
- H 抗原解析
- きれいなスライドに H 抗原多価血清 1 滴を加えます。
- マイクロ ループと血清中に挽くコロニーの 1 つのループを収集します。
- 砂、流れるような場合 3.1.4.2.4 をステップに進む植民地は血清に反応。
- H 一価血清を使用して、特定の H 抗原の特徴まで 3.1.4.2.1 に 3.1.4.2.3 の手順を繰り返します。
注: 時々 血清誘導は 2 番目のフェーズ H 抗原を特徴付ける必要かもしれない。もしそうなら、次のオプションの手順を実行必要があります。 - (省略可能)寒天プレート上に特定の H 抗原血清 1 滴を加えます。すべての血清が吸収されるまで待機します。
- (省略可能)特定の H 抗原の血清が吸収されるマイクロ ループとプレート上に広がりのあるコロニーの 1 つのループを収集します。36 ° C、インキュベーターで 18-24 時間で孵化させなさい。
- (省略可能)H 一価血清を使用して、第 2 の H 抗原の特徴まで 3.1.4.2.1 に 3.1.4.2.3 の手順を繰り返します。
- 手順 4 に進みます。
- O 抗原の解析
- 媒体の選択的な文化
-
赤痢菌属 PCR 検体が陽性
- プレートの文化を分離すること
- マイクロ ループと前濃縮文化の 1 つのループを収集し、XLD プレートまたは MAC 板の上に 。36 ° C、インキュベーターで 18-24 時間で孵化させなさい。
- 生化学的同定
- XLD プレート (滑らかな、円形の赤と透明のコロニー) または MAC 板 (滑らかな、円形、直径 2-3 mm の透明で無色のコロニーに疑わしいコロニーを収集します。赤痢菌体が大きくなり、インキュベーション時間の伸長とピンク光に回して) (図 4)。
- 対象楽器の指示に従っての自動微生物同定システムに関する生化学的同定の不審なコロニー。
- 血清学的キャラクタリゼーション
- きれいなスライドに赤痢菌属多価血清 1 滴を加えます。
- マイクロ ループと血清中に挽くコロニーの 1 つのループを収集します。
- 砂、流れるような場合、3.2.3.4 をステップに進む植民地は血清に反応。
- 赤痢菌属一価血清を使用して、特定の赤痢菌属の特徴まで 3.2.3.1: に 3.2.3.3 の手順を繰り返します。
- 手順 4 に進みます。
- プレートの文化を分離すること
4. レポート
- 上記の結果によると、正または負のレポートを発行します。
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Representative Results
サルモネラ属菌のスクリーニングに応用プロトコル/アナル便で赤痢が食料や水を扱うだろう人たちからサンプルします。
リアルタイム PCR のステップ図 5Aに示すようにあった混合サンプルは、サルモネラ属菌の陽性を意味する HEX チャネルに正常な拡大肯定的な 1 つをした個々 のサンプルにさらにリアルタイム PCR を行った。図 5Bのように、サンプル 2 は肯定的だった。したがって、サンプル 2 はサルモネラ属菌のガイド付きの文化に選ばれました図 5C、FAM チャンネルは、赤痢の混合サンプルが陽性のもので正常な拡大があったさらにリアルタイム PCR を行ったし、サンプル 10 の肯定的なことが判明しました (図 5D)。したがって、サンプル 10 は赤痢のガイド付きの文化に選ばれました
サルモネラ属菌のガイド付きの文化、ピンク植民地とあった XLD プレート、サルモネラ酵素基質寒天培地、紫色コロニー別に、図 2に示します。その後、これらの植民地は自動微生物同定システムに関する生化学的同定に服従しました。結果、サルモネラ属菌、未知の種のだった。したがって、血清学的性状が実行されます (図 3)、それ O4, O12, Hb, H1 に反応した 2。ホワイト ・ カウフマン-ル マイナーな方式に従って、サンプル 2 は、最終的にパラチフス Bの正として報告されました。赤痢菌属のガイド付きの文化の中別途、図 4に示す XLD プレート、MAC 板ピンク赤と無色のコロニーがあった。その後、これらの植民地は、自動微生物同定システムに関する生化学的同定にも受けた。結果、赤痢菌体だった。その特定の血清型を確認する血清学的性状が実行されます (図 3)、それ体フェーズ II に反応しました。したがって、サンプル 10 は最終的に、赤痢菌体フェーズ IIの陽性として報告されました。
図 1: プロトコルのダイアグラム。2 つの主要な手順は、表示され、破線で区切られました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:サルモネラ属菌 XLD プレートとサルモネラ酵素基質寒天培地プレート上の代表的な文化の結果。XLD の皿の上にピンク色のコロニーがあった/暗い心なしサルモネラ酵素基質寒天培地中に、あった紫色コロニー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 代表的な血清学的解析結果です。植民地は血清に反応された場合 (左) 砂の流れに似ていた。それ以外の場合、混濁 (右) だった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: XLD 板と MAC 板に赤痢菌属の代表的な文化の結果。XLD プレート、赤色のコロニーがあった MAC 板の中に透明な無色のコロニーがあった。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 代表的なリアルタイム PCR の結果。ミックスの試料の 16 進数 (A) チャネル。個々 のサンプルの 16 進数 (B) チャネル。(C) FAM チャネル ミックスのサンプル。個々 のサンプルの FAM (D) チャネル。PC: 肯定的な制御。NC: 否定的な制御。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 病原体 | 名 | Sequence(5'-3') |
| サルモネラ | Sal F サル R Sal プローブ |
gctcatattaattccggcatttac caggtcaatagccagaaagg 六角 ataagtaatccaatccgaaatgcctgcgt 日食 |
| 赤痢菌 | 市 F 市 R 市プローブ |
ccgggataaagtcagaactc cagtggagagctgaagtttc FAM aggccaggtagacttctatctcatccac 日食 |
表 1: プライマーとプローブを使用します。名前とプライマー、プローブの配列は提供されました。
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Discussion
サルモネラ属菌以来/赤痢、食中毒や急性胃腸炎28,29の糞便口頭伝達に関連付けられてと定期的な方法は手間や時間がかかる7、サルモネラ属の高スループット プラットフォームについて述べる/赤痢菌属のスクリーニング、リアルタイム PCR を用いたガイド文化と組み合わせます。
このプラットフォームの機能を最大化への配慮を必要とするいくつかの手順があります。最初の 1 つは、(手順 2.2) の栄養流体培養基のサンプルの前濃縮ステップです。事前の雇用の間に収集されたとき一般的な 6 時間前濃縮のステップでアナル綿棒サンプルが必要とされるまだ明らかな症状は、下痢など、それらの患者から採取した糞便の前濃縮のステップは必要ありませんがそれらの人々 が主に健康や少なくとも無症候性の成人にも食料や水を扱うだろう人々 の身体検査。サルモネラ属菌の検出のためのプロトコルを塗っただけの場合、亜セレン酸シスチン中、感度を上げるための前濃縮を実施できます。2 番目の重要なステップは、疑わしいコロニー (ステップ 3.1.3.1 と 3.2.2.1) の id です。マスクの検出と分離対象病原体30の糞便に多く干渉背景植物があります。したがってで定義されたステップ 3.1.3.1 と 3.2.2.1 として疑わしいコロニーの特徴は、実験中に留めておかれる必要があります。3 番目の重要なステップはサルモネラの血清学的特徴です。サルモネラ属菌の大部分は、H 抗原31の第 2 段階を含んでいる、血清の誘導を実行する必要があります。ただし、血清の誘導が常に成功しないと誘導のいくつかのラウンドは正しい 2 H 位相を決定する必要があります。
プロトコルは極めて特殊で、機密性の高い私たちの以前の研究27で確認です。プロトコルの高い特異性を行い, その能力は、サルモネラ属菌、赤痢菌属は、他の関連病原体の27から区別すること/。プロトコルの検出下限は 104 CFU/mL と 10 の前レポート7,32に匹敵するサルモネラ属、赤痢菌属、それぞれ27,3 CFU/mL,33,34プロトコルはサルモネラ属菌の検出にのみ適用された場合にサルモネラ属菌検出の感度がさらに亜セレン酸シスチン前濃縮により増加私たちが上記のよう。また、プロトコルが 2 つのひだの肯定的な率を高める、ワークロード/中央値を減少させる所要時間27が大幅。
他の NAAT の試金と同様に、古典的な細菌培養法と比較した場合、プロトコルの 1 つの主要な制限はプロトコルではサルモネラ属菌を識別できるだけ/赤痢、他の一般的な下痢の原因となる細菌は、7をは省略。対照的に中古典的な細菌文化、それらの細菌が識別される並行彼らが存在する場合。プロトコルのもう一つの制限は、サルモネラ属菌の一部/シーケンス バリエーション27によるリアルタイム PCR によって、赤痢を識別できませんでした。ただし、リアルタイム PCR 陰性は、明らかな臨床症状の患者からサンプルを表示する場合、技工士は注意を払う必要があります、他の実験結果を確認するために行うことができます。大流行した中に PCR のスクリーニングの最初のラウンドの御府内ではなく 1 つのサンプルを使用できます。
結論としては、ここで提供されるプロトコルは、サルモネラ属菌のスクリーニングのための貴重なプラットフォームとして役立つことができる/赤痢菌属
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、科学と技術プログラムの珠海、中国 (許可番号 20171009E030064)、科学と技術プログラムの広東省、中国 (許可番号 2015A020211004) と科学と技術プログラムの一般的な管理によって支えられました。品質監督、検査および中国 (許可番号 2016IK302、2017IK224) の共和国の検疫。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
References
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