Summary
Hier presenteren we een methode waarin menselijke low-density neutrofiele granulocyten (LDN), postoperatieve peritoneale lavage vloeistof, verhaald produceren enorme neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en efficiënt trap gratis tumorcellen die vervolgens groeien.
Abstract
Geactiveerd neutrofielen release neutrofiele extracellulaire vallen (netten), die kunnen vangen en microben te vernietigen. Recente studies suggereren dat de netten zijn betrokken bij verschillende ziekteprocessen, zoals auto-immune ziekte, trombose en tumor uitzaaiingen. Hier, laten we een gedetailleerde in vitro -techniek netto activiteit tijdens de vangst van gratis tumorcellen, die na gehechtheid aan netten groeien detecteren. Ten eerste, wij lage dichtheid neutrofiele granulocyten (LDN) van postoperatieve peritoneale lavage vloeistof van patiënten die onderging laparotomies verzameld. Op korte termijn kweken van LDN resulteerde in enorme netto formatie die werd gevisualiseerd met groen fluorescent nucleaire en chromosoom-counterstain. Na een incubatieperiode van Co van menselijke maagkanker cellijnen MKN45, OCUM-1 en NUGC-4 met de netten, werden vele tumorcellen opgesloten door de netten. Vervolgens de bijlage volledig werd afgeschaft door de afbraak van netten met DNase I. tijd-tijdspanne video geopenbaard dat tumorcellen gevangen door de netten niet sterven, maar in plaats daarvan krachtig groeide in een continue cultuur. Deze methoden kunnen worden toegepast op de detectie van zelfklevende interacties tussen netten en verschillende soorten cellen en materialen.
Introduction
Polymorf nucleaire neutrofielen in het bloed circuleren zijn het meestal gescheiden van mononucleaire cellen via de dichtheid kleurovergang voorbereiding methode. Sommige neutrofiele granulocyten bekend als low-density neutrofiele granulocyten (LDN), met CD11b(+), CD15(+), CD16(+) en CD14(-) fenotypen, zijn echter mede gezuiverde met mononucleaire cellen. Het relatieve aantal LDN aanzienlijk verhoogt in verscheidene pathologische condities, zoals auto-immune ziekten1,2, sepsis3en kanker4,5. Eerdere studies hebben aangetoond dat LDN een fenotypische en functioneel verschillend soort neutrofielen6. Opgemerkt moet worden dat LDN in het circulerende bloed hebben meer kans op produceren neutrofiele extracellulaire vallen dan normale dichtheid neutrofielen2,7(netten). Netten zijn web-achtige structuren samengesteld van nucleïnezuren, histonen, proteasen en korrelig en cytosolische eiwitten, en ze kunnen efficiënt vangen en het vernietigen van ziekteverwekkers8.
Onlangs, netten zijn gebleken om vast te leggen niet alleen microben, maar ook bloedplaatjes en circulerende tumorcellen die bij trombose vorming9 en tumor uitzaaiingen10,11 helpen kunnen. De moleculaire mechanismen achter de zelfklevende interacties tussen netten en bloedplaatjes of tumorcellen zijn echter nog onduidelijk. Meer recentelijk, een hechting in vitro assay geopenbaard dat myeloïde leukemie cellen (K56212) en Long carcinoom cellen (A54913) aan netten via β1 en β3 integrins hechten. De auteurs gebruikt NET voorraad geïsoleerd van neutrofielen en geactiveerd door phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) als de hechting substraat14. Hoewel deze test maakt de ontdekking van echte interactie met netto componenten in de afwezigheid van neutrofiele granulocyten, is het betwistbaar of de "cel-vrij NET voorraad" geïsoleerd door middel van centrifugeren high-speed behoudt de molecuulstructuur identiek aan netten geproduceerd in vivo. Onlangs, vonden we dat peritoneale lavage vloeistof na abdominale heelkunde vervatte veel volwassen LDN, die enorme netten gegenereerd en gekoppeld aan tumorcellen peritoneale metastasen15veroorzaakt. In deze studie onderzochten we met succes de hechting van de tumorcellen aan intact netten zonder enige fysieke manipulatie. Hier, laten we details van een techniek voor het detecteren van zelfklevende interacties tussen netten en gratis tumorcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LDN patiënten ingeschreven in deze studie werden verkregen en zijn goedgekeurd door de institutionele Review Board van Jichi medische universiteit.
1. isolatie van LDN uit de buikholte Lavages en netto detectie
- Monster overname
- Infundeer 1000 mL normaal steriele zoutoplossing rechtstreeks in de buikholte vóór afsluiting van de wond bij patiënten die een abdominale chirurgie als gevolg van gastro-intestinale maligniteit hebben ondergaan.
Opmerking: Monsters zijn verkregen van patiënten die onderging een Gastrectomie, colectomy of esophagectomy zonder vooringenomenheid op basis van leeftijd of geslacht. Saline werd overgebracht naar een container en gegoten in de hele buik binnen één minuut. Dit is routinematig uitgevoerd als een postoperatieve peritoneale wassen zonder aanzienlijke gevolgen voor de patiënten. - Lavage de buikholte uitgebreid voor minstens 1 min.
Opmerking: Het wordt aanbevolen dat de geïnfundeerd vloeistof langzaam wordt geroerd met de surgeon's handen zodat de monsters uniform zijn. - Herstellen van 200 mL lavage vloeistof met vier spuiten van 50 mL.
Opmerking: Soms wordt een rubber-connector gebruikt tot het nemen van de vloeistoffen.
- Infundeer 1000 mL normaal steriele zoutoplossing rechtstreeks in de buikholte vóór afsluiting van de wond bij patiënten die een abdominale chirurgie als gevolg van gastro-intestinale maligniteit hebben ondergaan.
- Zuivering van peritoneale LDN granulocyt specifieke mAb, CD66b16gebruiken uitvoeren
Opmerking: Omdat de tussenliggende laag na dichtheid kleurovergang centrifugeren vele mononucleaire cellen bevat, positieve selectie van polymorf neutrofiele granulocyten met behulp van mAb CD66b werd uitgevoerd.- De vloeistof peritoneale lavage overbrengen in een tube van 50 mL.
Opmerking: In deze stap passeren de vloeistoffen een 100 µm nylon filter voor het verwijderen van onzuiverheden. - Centrifugeer het buikvlies vocht bij 270 x g gedurende 7 min op RT.
- Resuspendeer de pellets in 5 mL PBS met 0,02% EDTA.
- Zorgvuldig bedekken de 5 mL celsuspensie op een dichtheid van de kleurovergang oplossing in 3 mL.
- Centrifugeer bij 1700 x g gedurende 15 minuten op RT zonder alle einden.
- Oogst de ~ 2-3 mL oplossing met de tussenliggende lagen (figuur 1A) met behulp van een precisiepipet en meng dit met 10 mL PBS met 0,02% EDTA.
- Centrifugeer het buikvlies vocht bij 400 x g gedurende 7 min op RT en verwijder het supernatant.
- Voeg een ander 10 mL PBS met 0,02% EDTA en centrifuge bij 270 x g gedurende 7 min op RT. Discard het supernatant.
- Los de cel pellet (1 x 107) in 60 µL van buffer voor de magnetische cel scheiding kit.
- Voeg toe 20 µL van Fc blok aan de pellets en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Voeg 20 µL van de anti-CD66b geconjugeerd met microbeads en incubeer gedurende een extra 10 min bij 4 ° C.
- Wassen en resuspendeer de pellets in 500 µL van MACS buffer.
- De celsuspensie van toepassing op een magnetische kolom in het magnetisch veld van een geschikt magnetische scheidingsteken en verzamelen de doorstroming met CD66b(-) cellen door het wassen van de kolom met 15 mL buffer.
- Verwijder de kolom uit de magnetische scheidingsteken en onmiddellijk spoelen de magnetisch gelabelde CD66b(+) cellen door stevig de zuiger te duwen in de kolom.
Opmerking: De CD66b(+)-celpopulatie bestaat meestal uit neutrofielen zoals bepaald door FACS analyse waaruit blijkt dat > 95% van de CD66(+)-fractie zijn voor CD11b, CD15 en CD16 positief, maar negatief voor de CD14.
- De vloeistof peritoneale lavage overbrengen in een tube van 50 mL.
- Generatie van netten
- Na centrifugeren bij 270 x g gedurende 7 min op RT, resuspendeer de geïsoleerde LDN (5 x 106) in 1 mL RPMI1640 met 10% FCS.
- Cultuur de LDN op een 6-well poly-L-lysine beklede plaat (6 cm diameter) gedurende 2 uur op 37 ˚C in 5% CO,2.
- De groen fluorescente counterstain (een membraan-ondoordringbare kleurstof om vlek de celkern en de chromosomen) op de uiteindelijke concentratie van 5 µM toevoegen.
- Onmiddellijk observeren de morfologie van netten (de extracellulaire DNA componenten de LDN onder fluorescentie microscopie uitgezet).
2. kleuring van tumorcellen met rode fluorescerende cel Linker kleurstof
- Bereiden menselijke kanker cellijnen, MKN45, NUGC en OCUM-1.
- Wassen van 1 x 107 cellen met PBS + 0,02% EDTA in een tube van 15 mL en centrifuge op 270 x g gedurende 7 minuten op RT.
- Voeg 1 mL van oplossing voor kleurstof vlekken aan de pellets en Pipetteer zachtjes.
- 4 µL van rood fluorescerende cel Linker kleurstof in 1 mL van oplossing voor vlekken los en meng met de celsuspensie uit stap 2.2.
- Incubeer de pellets voor 4 min op RT.
- Voeg 4 mL DMEM (10% FBS) om te stoppen met de kleuring reactie.
- Centrifugeer 270 x g gedurende 7 minuten en verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 2.6 en 2.7 tweemaal.
- Neem contact op met een fluorescentie Microscoop (excitatie = 551 nm, uitstoot = 567 nm) dat de tumorcellen rood worden gekleurd.
3. analyse van Tumor cel adhesie aan netten
- Resuspendeer de rode fluorescerende gebeitst tumorcellen (1 x 106) in 1 mL RPMI 1640 aangevuld met 0,1% BSA.
- De tumorcellen aan de LDN cultuur dat de netten geproduceerd zoals beschreven in stap 1.3 toevoegen.
- Incubeer gedurende 5 min op 37 ˚C, waarmee de tumorcellen contact opnemen met de netten.
Opmerking: Lange incubatie induceert tumor cel adhesie LDN of aan de platen. - Verwijder het medium en zachtjes was de putjes goed door toevoeging van 2 mL voorverwarmde media (0,1% BSA + RPMI 1640) en zwenken van de schotel.
- Herhaal de procedure wassen in stap 3.4 tweemaal.
Opmerking: Sinds netten zwak hechten aan de plaat, zo voorzichtig mogelijk om verwijdering van de netten zich wassen moet worden gedaan. - Voeg de groen fluorescente kleurstof voor de kleuring van de kern en de chromosomen op een eindconcentratie van 5 µg/mL voor visualisatie van de netten.
- Observeren van de netten en aangesloten tumorcellen met behulp van de juiste filters (groen, excitatie = 504 nm, uitstoten = 523 nm; rood, excitatie = 551 nm, uitstoot = 567 nm).
- Het samenvoegen van de cijfers om aan te tonen van de tumorcellen die zijn gevangen door de netten.
Opmerking: In sommige experimenten, DNA afbraak enzym is toegevoegd aan de LDN cultuur (eindconcentratie van 100 U/mL) 5 min vóór co incubatie gedurende 5 min.
4. time Lapse Video-analyse van de gevangen tumorcellen
- Cultuur de peritoneale LDN in een 35 mm ronde schotel bedekt met poly-L-lysine zoals beschreven in stap 1.3.
- Voeg de groen fluorescente kleurstof voor de kleuring van de kern en de chromosomen te visualiseren netten zoals beschreven in stap 1.3.
- Verwijder het medium na 1 min van incubatie, en voeg 2 mL 0,1% BSA + RPMI 1640.
- Verwijder de media en voeg onbevlekt 1 x 106 MKN45 cellen gesuspendeerd in 0,1% BSA + RPMI 1640. Incubeer gedurende 5 min op RT.
- Verwijder eventuele niet-vastgemaakte tumorcellen door voorzichtig wassen zoals beschreven in stap 3.4 en DMEM met 10% FCS aangevuld met 100 u/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine toevoegen.
- Monteren van de schotel van cultuur in een systeem voor de observatie van uitzicht op de gehele cel en selecteert u het desbetreffende veld in welke tumor cellen zijn gevangen door de netten.
- Blijven samen cultuur voor een extra 2 dagen en nemen continue foto's van het veld elke 6 min onder normaal licht en fluorescentie, die MKN45 cellen en netten, respectievelijk detecteert.
- De beelden op elk timepoint superponeren en time-lapse video's met behulp van Image Viewer software te bouwen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de 2-uur-cultuur, CD66b(+) LDN afgeleid van peritoneale lavage vloeistof toonde tekenreeks structuren gekleurd met groen-fluorescerende kleurstof voor nucleaire en chromosoom (figuur 1B), terwijl CD66b(-) mononucleaire cellen niet (Figuur 1 c). Echter, wanneer de LDN culturen werden voorbehandeld met 100 U/mL DNase ik, de karakteristieke structuur was vernietigd (Figuur 1 d), die aangeeft dat zij samengesteld uit extracellulaire DNA neutrofielen uitgezet waren. Wanneer LDN werden gekweekt op kunststof platen zonder coating, veel netto clusters drijvend in werden media waargenomen, met enkele netten op de bodem (figuur 1E).
Vervolgens te onderzoeken hechting van de tumor cellijnen aan netten, waren MKN45 cellen voorzien van rode fluorescerende kleurstof toegevoegd aan de netten en co gedurende 5 minuten geïncubeerd. Na het zachte wassen aangesloten vele MKN45 cellen werden aangetroffen (figuur 2A en 2 C). Daarentegen weinig MKN45 cellen gekoppeld wanneer LDN werden voorbehandeld met DNase I (figuur 2B en 2 C). De samengevoegde afbeelding toonde duidelijk aan dat een meerderheid van de bijgevoegde MKN45 cellen waren mede gelokaliseerde met netten, gezien als structuren gevormd aan de onderkant van de plaat (figuur 2D). Vergelijkbare hechting patronen werden waargenomen met OCUM-1 en NUGC-4 (figuur 2E en 2F).
Aangezien de netten zijn gebleken te zijn cytotoxisch zijn voor bacteriën, we vervolgens onderzocht of tumorcellen door netten sterven gevangen of overleven in een continue co cultuur met behulp van time-lapse video. Interessant, terwijl netten geleidelijk binnen enkele uren verdwenen, de cellen MKN45 gevangen door netten begon te vermenigvuldigen energiek daarna (Video 1).
Figuur 1: netto vorming na de cultuur van peritoneale LDN. (A) na dichtheid kleurovergang centrifugeren van postoperatieve lavage vloeistof, hersteld van de tussenliggende laag cellen worden weergegeven. (B) vervolgens CD66b(+) LDN werden gescheiden van CD66b(-) mononucleaire cellen en gekweekt op poly-L-lysine gecoate 6-Wells-platen, gevolgd door toevoeging van nucleaire kleuring kleurstof en directe observatie met fluorescentie microscopie. (C) hetzelfde aantal CD66b(-) mononucleaire cellen werden gekweekt onder dezelfde voorwaarden. (D) de LDN enkelgelaagde was geïncubeerd met DNase ik voor 5 minuten voor nucleaire kleuring. (E) CD66b(+) LDN werden gekweekt op kunststof platen zonder coating. Witte staven 100 µm. Dit cijfer werd vanaf een eerdere publicatie15gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: hechting van tumor cellen aan netten. (A) peritoneale LDN werden gekweekt op poly-L-lysine gecoate 6-Wells-platen gedurende 2 uur, die enorme netten. Rode MKN45 met fluoresceïne-geëtiketteerd werden vervolgens toegevoegd. Niet-vastgemaakte cellen werden verwijderd door het zachte wassen na een 5 minuten durende incubatie, en resterende tumorcellen werden waargenomen onder een fluorescentie Microscoop. (B) vóór de toevoeging van MKN45, was de LDN enkelgelaagde voorbehandeld met DNase ik voor 5 min. (C) In experimenten (A) en (B), het aantal aangesloten MKN45 cellen werden geteld in 3 willekeurige velden onder de fluorescentie Microscoop en bedoel ± SD werd uitgedrukt. (D) na het zachte wassen, groen fluorescente kleurstof voor nucleaire en chromosoom is toegevoegd aan de co-cultuur. Foto's van de aangesloten MKN45 en NET structuren werden genomen met behulp van passende optische golflengte filters in representatieve velden, en de twee cijfers werden samengevoegd. De dezelfde experimenten uitgevoerd in (D) werden ook uitgevoerd voor OCUM-1 (E) en NUGC-4 (F). Witte staven 100 µm. Dit cijfer werd vanaf een eerdere publicatie15gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Video 1: na adhesie gedrag van de gevangen tumorcellen. LDN werden gekweekt op poly-L-lysine gecoate 6-Wells-platen gedurende 2 uur, en NET vorming werd bevestigd door de groen fluorescente kleurstof voor nucleaire en chromosoom. Dan, onbevlekt MKN45 cellen werden toegevoegd en co gedurende 5 minuten geïncubeerd, en niet-vastgemaakte cellen waren verwijderd door het zachte wassen en bleef mede worden gekweekt in 10% FCS + DMEM. Met behulp van een systeem voor de observatie van uitzicht op de gehele cel, werden gebieden waar de tumorcellen werden gevangen door netten zocht. Foto's van het veld werden vervolgens elke 6 minuten onder normaal licht en fluorescentie, waardoor de duidelijke cijfers van tumorcellen en netten, respectievelijk genomen. Ten slotte, de beelden werden bovenop met Image Viewer software, en een time-lapse video werd gemaakt met een 3600 x hogere snelheid dan real-time. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eerdere studies hebben gemeld dat circulerende tumorcellen kan worden gevangen door netto substraten in vivo10,11. Metastatische borstkanker kankercellen is gebleken stimuleren neutrofielen en vorming van netten, die in de groei van de cel van de tumor in de target orgel17 helptinduceren. Daarnaast vonden we dat op korte termijn culturen van LDN van postoperatieve lavage vloeistof geproduceerd enorme netten die efficiënt tumorcellen zonder verdere stimulatie15kon vangen. Deze opmerkingen suggereren een mogelijke rol voor mechanische betrokkenheid van netten in de gemetastaseerde proces. De gedetailleerde moleculaire mechanismen die bemiddelen zelfklevende interacties tussen de netten en de tumorcellen is echter nog onduidelijk. Recente studies hebben de betrokkenheid van integrine in dit proces door het gebruik van netto voorraad geïsoleerd van geactiveerde neutrofielen die als de hechting substraat12,13 dienenbetrokken. Gezuiverde en geconcentreerde netten onderdelen moeten echter grotendeels verschillende moleculaire structuren uit oorspronkelijke netten hebben. Ter vergelijking: onze methode gebruikt intact netten zonder fysieke manipulatie, wat een sterk voordeel bij het onderzoek naar de precieze werking van zelfklevende interacties met netten. Met deze simpele techniek, kunnen onderzoekers detecteren de specifieke gehechtheid van vele tumorcellen aan netten snel (binnen 5 min).
De belangrijkste functie van het protocol is het gebruik van een plaat poly-L-lysine gecoate te lossen de netto structuren op de onderkant van de plaat. Toen intact plastic platen werden gebruikt voor de LDN cultuur, werden alleen een paar netten ontdekt aan de onderkant. Bovendien werden veel groen-positieve clusters waargenomen als vrij zwevend in de cultuurmedia, als ze moeten losgemaakt van de plaat (Figuur 1 d zijn had). Wij hebben ook onderzocht netto vorming op platen bedekt met collageen, fibronectine en laminin, waardoor de detectie van web-achtige structuren in de onderste laag. Echter de netten leek te hechten aan de substraten minder strak dan poly-L-lysine, en ze waren gemakkelijk los door de procedure wassen. Deze andere opties zijn dus onvoldoende voor hechting testen. In feite, als we platen zonder poly-L-lysine coatings gebruiken, kunnen netten en eventuele bijgevoegde tumorcellen worden gemakkelijk verwijderd van de plaat door simpelweg het toevoegen van media in de putjes.
De kritische stap in de bepaling van de wrijvingscoëfficiënt is de incubatietijd van de co cultuur met de tumorcellen. Vijf minuten is voldoende voor tumorcellen te binden aan de netten. Onder de experimentele omstandigheden, bij het toevoegen van de oplossing met tumorcellen aan de 6-well plaat, maken alle tumorcellen fysiek contact met de netto structuren gevormd aan de onderkant van de plaat. Echter, mede kweken voor een langere periode (bijv langer dan 10 minuten) resultaten in de binding van tumorcellen LDN of poly-L-lysine substraten. Daarom moet de incubatietijd kort te sporen specifieke binding aan de netten zijn. De manoeuvres van zachte wassen is een ander essentieel punt. We hebben zeker Voeg langzaam de verwarmde media van de zijwand van elk goed, zachtjes swing van de plaat, en verwijder de bovendrijvende vloeistof met een aspirator. Aangezien netten aan de plaat zwak vasthouden, moet dit proces worden uitgevoerd in een bijzonder voorzichtige manier.
Deze techniek wijst erop dat een ander moleculaire mechanisme nodig is voor de tumorcellen binden aan netten binnen minuten, dan dat het aangetoond in een bepaling van de hechting met een ~ 30-60 minuten incubatie NET12,,13 voorraden. Blokkeren van experimenten met behulp van deze methode kan het verhelderen van de gedetailleerde moleculaire mechanismen waarin echte netten val verschillende materialen. Een beperking van deze techniek is echter dat het wasproces verschillen kunt wanneer de zelfklevende interacties tussen netten en tumor cellen in vivo plaatsvinden. In de klinische setting is de dichtheid van tumorcellen veel lager dan die is gebruikt in dit protocol, die een andere beperking kan opleveren.
Time-lapse video-analyse is zeer nuttig voor het toezicht op de resultaten van de verschillende cellulaire gebeurtenissen over een periode van dagen. Met behulp van het geheel-cel view systeem, laten we zien dat netten geleidelijk afgebroken zijn, vermoedelijk door DNAse opgenomen in serum, overwegende dat MKN45 door de netten begin gevangen te energiek daarna verspreiden. Deze video toonde alleen de verdeling van de tumorcellen die zijn aangesloten op de netten, met niet te vergelijken met MKN45 gekoppeld aan de plaat. Verontreinigde neutrofielen en de toegevoegde nucleaire kleuring kleurstof kunnen hebben ook beïnvloed de groei van de tumorcellen. Daarom kunnen we niet een duidelijke conclusie over het netto effect van netten op tumor celgroei trekken. Deze analyse geeft echter aan dat de tumorcellen worden niet gedood door de netten en in feite kunnen overleven na entrapment door netten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken mevrouw J. Shinohara en I. Nieda voor technische en administratieve werkzaamheden. Wij danken ook, Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta Kentaro Kurashina en Kazuya Takahashi voor hun samenwerking voor monster acquisitie in de operatiekamer. Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek van het ministerie van onderwijs, wetenschap, sport, en cultuur van Japan en de Society van Japan voor de promotie van wetenschap (17K 10606).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
