Summary
Aqui, apresentamos um método no qual neutrófilos baixa densidade humanos (LDN), recuperados do líquido de lavagem peritoneal pós-operatórias, produzem maciço dos neutrófilos extracelulares armadilhas (redes) em armadilha eficientemente as células do tumor gratuito que crescem posteriormente.
Abstract
Ativado os neutrófilos liberação dos neutrófilos extracelular armadilhas (redes), que podem capturar e destruir micróbios. Estudos recentes sugerem que as redes estão envolvidas em vários processos de doença, tais como metástases de tumor, trombose e doenças auto-imunes. Aqui, nós mostramos uma técnica detalhada em vitro para detectar atividade NET durante a captura de células de tumor gratuito, que crescem após a ligação a redes. Primeiramente, coletamos neutrófilos de baixa densidade (LDN) de líquido de lavagem peritoneal no pós-operatório de pacientes que se submeteram a laparotomias. Cultivo a curto prazo da LDN resultou na maciça formação líquida que foi visualizada com verde fluorescente nuclear e corante de contraste do cromossomo. Após a incubação co de linhas de células de câncer gástrico humano MKN45, OCUM-1 e NUGC-4 com as redes, muitas células de tumor foram aprisionadas por redes. Posteriormente, o acessório foi totalmente revogado pela degradação de redes com DNase I. tempo-lapso vídeo revelou que células tumorais capturadas pelas redes não morreu, mas em vez disso, cresceu vigorosamente em uma cultura contínua. Esses métodos podem ser aplicados para a detecção de adesivas interações entre redes e vários tipos de células e materiais.
Introduction
Os neutrófilos nucleares polimorfo, na circulação de sangue normalmente são separados de células mononucleares através do método de preparação de gradiente de densidade. No entanto, alguns neutrófilos conhecidos como neutrófilos baixa densidade (LDN), com fenótipos CD11b(+), CD15(+), CD16(+) e CD14(-), são co purificados com células mononucleares. O número relativo de LDN aumenta significativamente em diversas condições patológicas, incluindo doenças auto-imunes,1,2, sepse3e câncer4,5. Estudos anteriores mostraram que LDN são uma classe fenotipicamente e funcionalmente distinta de neutrófilos6. Deve notar-se que LDN na circulação de sangue são mais propensos a produzir neutrófilos armadilhas extracelulares (redes) do que a densidade normal neutrófilos2,7. As redes são estruturas semelhantes a web compostas de ácidos nucleicos, histonas, proteases e proteínas cytosolic e granulares, e eficientemente podem enganar e destruir patógenos8.
Recentemente, as redes foram mostradas para capturar não só os micróbios, mas também plaquetas e circulantes de células de tumor que podem ajudar no trombo formação9 e tumor metástases10,11. No entanto, os mecanismos moleculares por trás as interações adesivas entre redes e plaquetas ou células tumorais são ainda pouco claras. Mais recentemente, um ensaio de adesão em vitro revelou que células de leucemia mieloide (K56212) e células de carcinoma de pulmão (A54913) anexar a redes através de integrinas β1 e β3. Os autores utilizaram NET ações isoladas de neutrófilos e ativado pelo phorbol myristate 12 13-acetato (PMA) como o substrato de adesão14. Embora este ensaio permite a detecção de interações reais com componentes líquidos na ausência de neutrófilos, é discutível se a "célula livre circulante líquido" isolados por centrifugação de alta velocidade mantém a estrutura molecular idêntica à redes produzidas em vivo. Recentemente, encontramos o líquido de lavagem peritoneal após cirurgia abdominal continha muitos LDN maduro, que gerou enormes redes e anexado às células de tumor causando metástases peritoneais15. Neste estudo, analisámos com sucesso a adesão das células tumorais para redes intactas sem qualquer manipulação física. Aqui, nós mostramos detalhes de uma técnica para detectar interações adesivas entre redes e células tumorais livre.
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Protocol
LDN foram obtidos de pacientes matriculados neste estudo e foram aprovados pela institucional Review Board de Jichi médica Universidade.
1. isolamento de LDN de Lavages de cavidade Abdominal e deteção líquida
- Aquisição de amostra
- Infundi 1.000 mL de solução salina estéril diretamente na cavidade abdominal antes do fechamento da ferida em pacientes que se submeteram à cirurgia abdominal devido a malignidade gastrointestinal.
Nota: As amostras foram obtidas de pacientes que se submeteram a uma gastrectomia, colectomia ou Esofagectomia sem preconceito com base na idade ou sexo. Solução salina foi transferida para um recipiente e vertida em todo abdome dentro de um minuto. Esta é realizada de rotina como uma lavagem peritoneal pós-operatória sem efeitos significativos sobre os pacientes. - Lavagem da cavidade abdominal extensivamente pelo menos 1 min.
Nota: É recomendável que o fluido infundido lentamente agita-se com as mãos do cirurgião para que as amostras são uniformes. - Recupere 200 mL de líquido de lavagem com 4 seringas de 50 mL.
Nota: Às vezes, um conector de borracha é usado para pegar os fluidos.
- Infundi 1.000 mL de solução salina estéril diretamente na cavidade abdominal antes do fechamento da ferida em pacientes que se submeteram à cirurgia abdominal devido a malignidade gastrointestinal.
- Realize a purificação da LDN peritoneal usando mAb específico de granulócitos, CD66b16.
Nota: Porque a camada intermediária após centrifugação gradiente de densidade contém muitas células mononucleares, selecção positiva de neutrófilos polimorfo usando CD66b mAb foi executada.- Transferi o líquido de lavagem peritoneal para um tubo de 50 mL.
Nota: Nesta etapa, passe os fluidos através de um filtro de nylon 100 µm para remover as impurezas. - Centrifugue o fluido peritoneal a 270 x g, durante 7 min na RT
- Resuspenda as pelotas em 5 mL de PBS com EDTA 0,02%.
- Sobreposição com cuidado a 5 mL de suspensão de células em uma solução de gradiente de densidade de 3 mL.
- Centrifugar a 1.700 x g, durante 15 min em RT sem intervalos.
- Colher o ~ 2-3 mL de solução contendo as camadas intermediárias (figura 1A), usando uma pipeta e misturar com 10 mL de PBS com EDTA 0,02%.
- Centrifugue o fluido peritoneal em 400 x g, durante 7 min na RT e descartar o sobrenadante.
- Adicione outro 10 mL de PBS com EDTA 0,02% e centrifugar a 270 x g, durante 7 min na RT. descartar o sobrenadante.
- Dissolva o centrifugado (1 x 107) em 60 µ l de tampão para o kit de separação magnética celular.
- Adicionar 20 µ l do bloco Fc nas pelotas e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
- Adicionar 20 µ l do anti-CD66b conjugados com microbeads e incube por um adicional 10 min a 4 ° C.
- Lave e ressuspender as pelotas em 500 µ l de tampão de MACS.
- Aplicar a suspensão de células de uma coluna magnética no campo magnético de um separador magnético adequado e recolher as células de passagem contendo CD66b(-) pela coluna com 15 mL de tampão de lavagem.
- Remover a coluna a partir do separador magnético e expulsar imediatamente as pilhas de CD66b(+) magneticamente etiquetadas empurrando firmemente o êmbolo na coluna.
Nota: A população de células de CD66b(+) consiste principalmente de neutrófilos, conforme determinado pela análise de FACS indicando que > 95% da fração CD66(+) são positivas para CD15, CD11b e CD16, mas negativas para CD14.
- Transferi o líquido de lavagem peritoneal para um tubo de 50 mL.
- Geração de redes
- Após a centrifugação a 270 x g, durante 7 min na RT, re-suspender a LDN isolado (5 x 106) em 1 mL de RPMI1640 com FCS de 10%.
- Cultura da LDN em uma placa revestida 6-poços poli-L-lisina (6 cm de diâmetro) por 2 h em 37 ˚ c em 5% CO2.
- Adicione o corante verde de contraste fluorescente (um corante membrana impermeável para manchar o núcleo e cromossomos) na concentração final de 5 µM.
- Imediatamente observe a morfologia das redes (os componentes DNA extracelulares expelidos da LDN sob microscopia de fluorescência).
2. coloração de células tumorais com tintura de vinculador de célula fluorescente vermelha
- Prepare o câncer humano linhas celulares, MKN45, NUGC e OCUM-1.
- Lavam-se 1 x 107 células com PBS + EDTA 0,02% em um tubo de 15 mL e centrifugar 270 x g por 7 min em RT
- Adicionar 1 mL de solução para tintura coloração nas pelotas e pipetar suavemente.
- Dissolver 4 µ l de corante vermelho fluorescente célula vinculador em 1 mL de solução para coloração e misture com a suspensão de células da etapa 2.2.
- Incubar as pelotas por 4 min na RT
- Adicionar 4 mL de DMEM (10% FBS) para parar a reação de coloração.
- Centrifugue a 270 x g, durante 7 min e descartar o sobrenadante.
- Repita os passos de 2.6 e 2.7 duas vezes.
- Verifique com um microscópio de fluorescência (excitação = 551 nm, emitindo = 567 nm) que as células do tumor estão manchadas de vermelho.
3. análise da aderência de célula de Tumor nas redes
- Ressuspender as células de tumor manchada fluorescente vermelha (1 x 106) em 1 mL de RPMI 1640 suplementado com 0,1% de BSA.
- Adicione as células do tumor para a cultura LDN que produziu as redes conforme descrito na etapa 1.3.
- Incube durante 5 min à 37 ˚ c, o que permite que as células do tumor entrar em contato com as redes.
Nota: Incubação longa induz aderência de célula do tumor para LDN ou para as placas. - Remover o meio e delicadamente lavar os poços, adicionando 2 mL de mídia escaldadas (0,1% BSA + RPMI 1640) e girando o prato.
- Repita o procedimento de lavagem no passo 3.4 duas vezes.
Nota: Desde redes fracamente anexar a placa, a lavagem deve ser feita o mais suavemente possível para evitar a remoção das redes se. - Adicione o corante verde fluorescente para manchar o núcleo e cromossomos em uma concentração final de 5 µ g/mL para visualização das redes.
- Observar as redes e anexado células tumorais usando os filtros apropriados (verde, excitação = 504 nm, emitindo = 523 nm; vermelho, excitação = 551 nm, emitindo = 567 nm).
- Mescle os números para mostrar as células do tumor que estão preso por redes.
Nota: Em alguns experimentos, enzima de degradação do DNA foi adicionada à cultura LDN (concentração final de 100 U/mL) 5 min antes co incubação por 5 min.
4. análise de vídeo lapso tempo das células do Tumor preso
- Cultura da LDN peritoneal em um 35 milímetros rodada prato revestido com poli-L-lisina, conforme descrito na etapa 1.3.
- Adicione o corante verde fluorescente para manchar o núcleo e cromossomos Visualizar redes conforme descrito na etapa 1.3.
- Após 1 minuto de incubação, remova a mídia e adicionar 2 mL de 0.1% BSA + RPMI 1640.
- Remova a mídia e adicionar imaculado 1 x 106 MKN45 células suspensas em 0,1% BSA + RPMI 1640. Incubar durante 5 min à RT.
- Remova quaisquer células de tumor desanexado lavando suavemente conforme descrito no passo 3.4 e adicione DMEM com 10% de FCS suplementado com 100 u/mL penicilina e 100 µ g/mL Estreptomicina.
- Montar o prato de cultura em um sistema de observação do vista para toda a célula e selecione o campo apropriado no qual tumor, as células são presos por redes.
- Continue a cultura co por mais 2 dias e tirar fotos contínuas do campo cada 6 min sob luz normal e fluorescência, que detecta células MKN45 e redes, respectivamente.
- Sobrepor as imagens em cada commit e construir vídeos Time-Lapse utilizando software visualizador de imagens.
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Representative Results
Na cultura de 2 horas, LDN CD66b(+), derivado de estruturas de sequência mostrou fluido de lavagem peritoneal corados com corante verde-fluorescente para nuclear e cromossomo (figura 1B), enquanto CD66b(-) células mononucleares não fizeram (Figura 1). No entanto, quando as culturas LDN foram pré-tratados com 100 U/mL DNase, a estrutura característica era destruído (Figura 1), indicando que eles eram compostos de DNA extracelular expelido de neutrófilos. Quando LDN foram cultivadas em placas de plástico sem revestimento, muitos clusters NET flutuando na mídia foram observada, com poucas redes no fundo (Figura 1E).
Em seguida, para examinar a adesão das linhas de células de tumor nas redes, MKN45 células marcadas com tinta fluorescente vermelha foram adicionadas para as redes e co incubadas por 5 minutos. Após a lavagem suave, muitos MKN45 foram encontradas células anexado (Figura 2A e 2C). Em contraste, algumas células MKN45 anexado quando LDN foram pré-tratados com DNase I (Figura 2B e 2C). A figura mesclada mostrou claramente que a maioria das células MKN45 anexadas era co localizadas com redes, vistas como estruturas formadas na parte inferior da placa (Figura 2D). Padrões de adesão semelhantes foram observados com OCUM-1 e NUGC-4 (Figura 2E e 2F).
Desde que as redes foram mostradas para ser citotóxicos para bactérias, nós então examinado se células tumorais preso pela die redes ou sobreviver em uma contínua co-cultura usando vídeo lapso de tempo. Curiosamente, enquanto as redes gradualmente desapareceram dentro de algumas horas, as células de MKN45 presos por redes começadas a proliferar vigorosamente depois (vídeo 1).
Figura 1: formação líquida após a cultura de LDN peritoneal. (A) após centrifugação gradiente de densidade do fluido de lavagem no pós-operatório, recuperadas a camada intermediária de células são mostradas. (B) em seguida, CD66b(+) LDN foram separados de células mononucleares de CD66b(-) e cultivadas em placas de 6-poços revestidas poli-L-lisina, seguidas pela adição de tintura coloração nuclear e observação imediata com microscopia de fluorescência. (C) o mesmo número de células mononucleares de CD66b(-) foram cultivado nas mesmas condições. (D) monocamada a LDN foi incubado com DNase eu por 5 minutos antes de coloração nuclear. (E) CD66b(+) LDN foram cultivadas em placas de plástico sem revestimento. Barras brancas representam 100 µm. Esta figura foi modificada de uma anterior publicação15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: células de aderência do tumor para redes. (A) LDN Peritoneal foram cultivadas em placas de 6-poços revestidas poli-L-lisina para 2 h, que produziu enormes redes. Vermelho MKN45 Antigamaglobulina então foram adicionados. Após uma incubação de 5 minutos, solto as células foram removidas por lavagem suave e restantes células tumorais foram observadas sob um microscópio de fluorescência. (B) antes da adição de MKN45, a monocamada LDN foi pré-tratados com DNase por 5 min. (C) em experimentos (A) e (B), o número de células de MKN45 anexados foram contados em 3 campos aleatórios sob o microscópio de fluorescência e média ± SD foi expressa. (D) após a lavagem suave, verde tintura fluorescente para nuclear e cromossomo foi adicionado à cultura co. Em áreas representativas, fotos das estruturas MKN45 e NET anexadas foram tiradas usando filtros ópticos de comprimento de onda apropriado, e fundiram-se as duas figuras. As mesmas experiências realizadas em (D) também foram realizadas para OCUM-1 (E) e NUGC-4 (F). Barras brancas representam 100 µm. Esta figura foi modificada de uma anterior publicação15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Video 1: comportamento pós-adesão das células de tumor preso. LDN foram cultivadas em placas de 6-poços revestidas poli-L-lisina por 2 horas, e formação de rede foi confirmada pelo corante fluorescente verde para nuclear e cromossomo. Em seguida, imaculado MKN45 células foram adicionadas e co incubadas por 5 minutos, e células desanexadas foram removidas por lavagem suave e continuou a ser co cultivadas em 10% FCS + DMEM. Usando um sistema de observação de toda a visão celular, áreas onde as células do tumor foram aprisionadas por redes foram procuradas. Fotografias do campo então foram tomadas a cada 6 minutos sob luz normal e fluorescência, que permitiu a claras figuras de células tumorais e redes, respectivamente. Finalmente, as imagens foram sobrepostas com software visualizador de imagens e um vídeo de lapso de tempo foi criado em uma velocidade de 3600 x maior do que em tempo real. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Estudos anteriores relataram que circulam células tumorais pode ser presa por substratos NET na vivo10,11. Células de câncer de mama metastático foram mostradas para estimular os neutrófilos e induzir a formação de redes, que auxilia no crescimento de células de tumor no órgão alvo17. Além disso, nós encontramos que a curto prazo culturas de LDN de fluido de lavagem pós-operatória produziam enormes redes que poderiam montar uma armadilha eficiente células tumorais sem mais estimulação15. Estas observações sugerem um possível papel para envolvimento mecânico das redes no processo metastático. No entanto, os mecanismos moleculares detalhados que medeiam as interações adesivas entre as redes e as células do tumor é ainda não está claro. Estudos recentes têm implicado o envolvimento da integrina neste processo através do uso de líquido ações isoladas de neutrófilos ativados que servem como o substrato de adesão12,13. No entanto, purificados e concentrados componentes de redes devem para ter amplamente diferentes estruturas moleculares de redes originais. Em comparação, o nosso método utiliza redes intactas sem manipulação física, que é uma forte vantagem ao examinar os mecanismos detalhados de adesivos interações com as redes. Com esta técnica simples, os pesquisadores podem detectar o acessório específico de muitas células de tumor nas redes rapidamente (dentro de 5 min).
A característica mais importante do protocolo é o uso de uma placa revestida poli-L-lisina para corrigir as estruturas de rede na parte inferior da placa. Quando intactas placas plásticas foram usadas para a cultura LDN, apenas algumas redes foram detectadas na parte inferior. Além disso, observaram-se muitos clusters de verde-positivo como flutuando livremente os meios de cultura, quando deveriam ter sido desconectados da placa (Figura 1). Também examinamos a formação líquida em placas revestidas com colágeno, fibronectina e laminina, que permitiu a detecção de estruturas semelhantes a web na camada inferior. No entanto, as redes apareceram para anexar os substratos menos firmemente que a poli-L-lysine, e eles foram facilmente destacados pelo procedimento de lavagem. Portanto, essas outras opções são insuficientes para os ensaios de aderência. Na verdade, se usarmos pratos sem revestimentos poli-L-lisina, redes e quaisquer células de tumor anexado podem tornar-se facilmente removidas da placa simplesmente adicionando mídia aos poços.
O passo crítico no ensaio de adesão é o período de incubação da cultura co com as células do tumor. Cinco minutos é suficiente para as células do tumor ligar as redes. Nas condições experimentais, ao adicionar a solução contendo as células do tumor para a placa de 6, todas as células do tumor fazercom contato físico com as estruturas líquidas formadas na parte inferior da placa. No entanto, co cultivo para um mais resultados do período (por exemplo, mais de 10 minutos) na ligação de pilhas do tumor para LDN ou substratos de poli-L-lisina. Portanto, o tempo de incubação deve ser curto para detectar a ligação específica para as redes. A manobra de lavagem suave é outro ponto essencial. Nós fizemos certo adicionar lentamente a mídia aquecida da parede do lado de cada bem, suavemente a placa do balanço e remove o sobrenadante com um aspirador. Desde redes colar no prato fracamente, este processo deve ser realizado de forma especialmente cautelosa.
Esta técnica destaca o fato de que um mecanismo molecular diferente é necessária para a ligação a redes em poucos minutos, do que as células do tumor que mostrado em um ensaio de adesão com uma incubação de ~ 30-60 minutos para NET os estoques12,13. Experimentos usando esse método de bloqueio pode elucidar os mecanismos de moleculares detalhados em que redes reais prender vários materiais. No entanto, uma limitação dessa técnica é que o processo de lavagem pode ser diferente quando as adesivas interações ocorrem entre redes e de células de tumor em vivo. Na prática clínica, a densidade de células tumorais é muito menor do que o utilizado no presente protocolo, que pode apresentar outra limitação.
Análise de vídeo Time-Lapse é altamente útil para monitorar os resultados de diversos eventos celulares durante um período de dias. Usando o sistema de exibição de células inteiras, mostramos que as redes são gradualmente degradadas, presumivelmente por DNAse contido no soro, Considerando que MKN45 preso pelo início de redes a proliferar vigorosamente posteriormente. Este vídeo só mostrou a divisão das células do tumor fixadas às redes, com nenhuma comparação com MKN45 anexado à placa. Neutrófilos contaminados e a tintura coloração nuclear adicionada podem também ter afetado o crescimento das células do tumor. Portanto, não poderia tirar uma conclusão definitiva sobre os efeitos líquidos das redes no crescimento de células de tumor. No entanto, esta análise indicam que células tumorais não são mortas por redes e podem de fato sobreviver após uma armadilha por redes.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Agradecemos a Sra. J. Shinohara e I. Nieda para trabalhos técnicos e administrativos. Também, agradecemos os Drs Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina e Kazuya Takahashi sua cooperação para aquisição de amostra na sala de cirurgia. Este trabalho foi financiado por um subsídio para a investigação científica do Ministério da educação, ciência, esportes e cultura do Japão e o Japão sociedade para a promoção da ciência (17K 10606).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
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